李 波， 馬 赫， 張曉雪， 趙 瑞， 丑純鳳， 孫 野

(齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院， 黑龍江 齊齊哈爾 161006)

輻射誘變育種是獲得新品種及新種質(zhì)資源的一條有效途徑。將輻射誘變育種與其他育種方式如雜交育種等結(jié)合，可以充分發(fā)揮其突變率高、后代性狀穩(wěn)定等特點(diǎn)。在輻射誘變中人們常常采用γ射線進(jìn)行輻照，60Co-γ和137Cs-γ射線又是其中最常用的兩種輻射源[1-2]，選擇合適的輻射劑量是輻射誘變育種成功的關(guān)鍵因素之一[3-4]。輻射誘變育種在我國牧草育種特別是沙打旺(AstragalusadsurgensPall.)、苜蓿(MedicagosativaL.)中廣泛應(yīng)用[5]，但在谷稗新品種選育中應(yīng)用較少。

谷稗(Echinochloacrusgalli)是一種一年生的禾本科牧草，其適應(yīng)性較強(qiáng)，生長快，是一種產(chǎn)量高、適口性好的優(yōu)良飼料。其穗形似谷子，實(shí)為稗屬植物。其在鹽堿及干旱條件下也可生長，因此又被稱為“堿稗”或“旱稗”。谷稗干草、籽實(shí)的粗蛋白、粗脂肪及維生素都高于其他禾谷類植物[6-7]。雖然谷稗在畜牧業(yè)應(yīng)用較多，但對(duì)其進(jìn)行種質(zhì)資源更新的研究甚少，導(dǎo)致谷稗品種單一，種質(zhì)資源遺傳基礎(chǔ)狹窄，因此，如何拓寬谷稗遺傳基礎(chǔ)，創(chuàng)新谷稗種質(zhì)資源，并采用多途徑和多種方法選育新品種，顯得十分重要。本試驗(yàn)采用不同劑量60Co-γ射線輻照谷稗干種子，對(duì)輻照后種子的萌發(fā)、芽苗生長和根系活力等進(jìn)行了探討研究，以期為谷稗輻射誘變育種提供科學(xué)依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

谷稗種子為‘朝牧1號(hào)’，由黑龍江省畜牧研究所提供?！?號(hào)’谷稗具有適應(yīng)性廣、抗逆性強(qiáng)、生長健壯、整齊一致、糧草兼收雙高產(chǎn)、草飼兼用雙優(yōu)質(zhì)等特點(diǎn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.160Co-γ射線輻照 以中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院原子能利用研究所的60Co-γ射線為輻射源，于2016年5月進(jìn)行谷稗干種子輻射處理，輻照劑量分別為0，200，250，300，350，400和450 Gy，劑量率15 Gy·min-1，每個(gè)處理100 g種子，以未輻照的種子為對(duì)照。

1.2.2發(fā)芽試驗(yàn) 選取各輻射處理和對(duì)照的種子各50粒，用35℃蒸餾水浸泡2 h，置入鋪有兩層濾紙的發(fā)芽盒中，25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以胚芽長度大于2 mm即視為發(fā)芽，每天觀察其發(fā)芽個(gè)數(shù)以計(jì)算發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率，共觀測(cè)7 d。以3 d 發(fā)芽種子數(shù)計(jì)算發(fā)芽勢(shì)，以7 d 發(fā)芽種子個(gè)數(shù)計(jì)算發(fā)芽率。取發(fā)芽后第7 d具代表性的芽苗20株，用游標(biāo)卡尺分別測(cè)量其芽長、根長。選取芽苗10株，測(cè)其鮮重和干重。各指標(biāo)均重復(fù)3次。

發(fā)芽率(GR) ( %) =第7 d發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%；發(fā)芽勢(shì)(GE) ( %) =3 d內(nèi)發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%；發(fā)芽指數(shù)(GI) =ΣGt/Dt ( Gt指時(shí)間t的發(fā)芽數(shù)，Dt指相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù))；活力指數(shù)(VI) =S×ΣGt/Dt( S 指芽苗的根長)。

1.2.3根系活力測(cè)定 取芽苗幼根進(jìn)行芽苗根系活力測(cè)定，采用氯化三苯基四氮唑(TTC)法[8-9]，重復(fù)3次。

1.2.4出苗率與成苗率調(diào)查 選取輻射處理和對(duì)照的種子各15粒，用35℃蒸餾水浸泡2 h，播于裝有2：1的營養(yǎng)土與珍珠巖混合育苗缽中，置于溫室。播后7 d統(tǒng)計(jì)種子的出苗率，21 d統(tǒng)計(jì)幼苗的存活率即為種子的成苗率，重復(fù)測(cè)定3次。

出苗率(%)=出苗數(shù)/播種種子總數(shù)×100%

成苗率(%)=成苗數(shù)/播種種子總數(shù)×100%

根據(jù)谷稗在不同劑量下的成苗率，擬合直線回歸方程Y=a+bX，導(dǎo)出成苗率為 50%(LD50)時(shí)所對(duì)應(yīng)的輻射劑量，以此確定谷稗種子輻照的最佳劑量范圍。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行差異顯著性分析，圖表繪制使用Excel 2010軟件。

2 結(jié)果分析

2.1 不同劑量60Co-γ射線輻射對(duì)谷稗種子萌發(fā)的影響

60Co-γ射線輻射處理后，其發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)的變化如表1所示，隨著輻射劑量的增加，種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)呈先增高后降低的變化趨勢(shì)。谷稗種子發(fā)芽率比較低，經(jīng)200～250 Gy劑量輻射雖能提高種子發(fā)芽率，但對(duì)發(fā)芽率提高影響不大，輻射劑量在300～350 Gy時(shí)，顯著促進(jìn)種子發(fā)芽率，與對(duì)照相比差異顯著(P<0.05)，輻射劑量為350 Gy時(shí)達(dá)最高，比對(duì)照增加了14.99%。在200～450 Gy輻射劑量范圍內(nèi)種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)均高于對(duì)照，且在250 Gy時(shí)發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)達(dá)最高，比對(duì)照分別增加了63.88%和76.20%，與對(duì)照相比差異顯著(P<0.05)?；盍χ笖?shù)的變化除350，400和450 Gy輻射劑量外均高于對(duì)照組，在200 Gy時(shí)達(dá)最高，比對(duì)照增加了32.24%，與對(duì)照相比差異顯著(P<0.05)。輻射處理對(duì)谷稗種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)產(chǎn)生不同的影響，250～350 Gy劑量可促進(jìn)其種子萌發(fā)。

表1 60Co-γ射線輻照對(duì)谷稗種子萌發(fā)的影響Table1 Effects of 60Co-γ irradiation on seed germination of Echinochloa crusgalli

注:同列不同小寫字母表示顯著差異(P<0.05)，下同

Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant difference at the 0.05 level, the same as below

2.2 不同劑量60Co-γ射線輻射對(duì)谷稗芽苗生長的影響

60Co-γ射線輻射處理后，種子的芽苗生長狀況如圖1所示，對(duì)種子芽苗的根長和芽長的影響如表2所示，根長和芽苗高度均隨輻射劑量增加而減少，450 Gy輻射劑量下根長和芽長均降低的最多。不同劑量輻照處理根長與對(duì)照相比分別降低了19.38%，39.15%，43.77%，55.69%，60.02%和65.31%，所有處理組與對(duì)照組相比均差異顯著(P<0.05)。芽長與對(duì)照相比分別降低了13.27%，29.51%，36.55%，42.53%，44.63%和50.51%，所有處理組與對(duì)照相比均差異顯著(P<0.05)，輻射對(duì)芽苗根的抑制作用大于芽長。

60Co-γ射線輻射處理對(duì)種子芽苗鮮重、干重的影響如表2所示，芽苗鮮重除200 Gy輻射劑量比對(duì)照略有增加外，其他劑量處理下均低于對(duì)照組，其他處理組芽苗鮮重與對(duì)照相比分別降低了25.46%，33.23 %，33.19 %，34.01%，34.49 %，除200 Gy劑量外，其余輻射劑量組與對(duì)照組比較差異顯著(P<0.05)，450 Gy輻射劑量鮮重降低的最多。干重隨著輻射劑量增加而降低，其他處理組與對(duì)照組相比分別降低了8.93%，11.72%，14.06%，15.18%，14.58%和34.36 %，與對(duì)照相比均差異顯著(P<0.05)，450 Gy輻射劑量干重降低的最多，輻射處理對(duì)芽苗鮮重的影響大于對(duì)干重的影響。

圖1 60Co-γ射線輻照后谷稗種子的芽苗Fig.1 The seedling of Echino chloacrusgalli seeds under 60Co-γ irradiation

表2 60Co-γ射線輻照對(duì)谷稗種子芽苗生長的影響Table2 Effects of seedling growth of Echinochloa crusgalli under 60Co-γ irradiation

輻射劑量Radiation dose/Gy鮮重Fresh weight/mg干重Dry weight/mg根長Root length/cm芽苗高度Seeding height/cm0313.57±10.90ab38.40±1.01a48.00±7.92a76.34±9.15a200314.83±8.89a34.97±0.64b38.70±2.92b66.21±1.88b250233.73±4.51b33.90±0.53b29.21±2.13c53.81±3.93c300209.37±9.38c33.00±0.62c26.99±0.92d48.44±1.98c350209.50±3.97c32.57±0.93cd21.27±2.16d43.87±1.23d400206.93±3.30c32.80±1.47cd19.19±2.99d42.27±4.58d450205.43±6.34c25.20±1.30d16.65±2.29d37.78±1.98d

2.3 不同劑量60Co-γ射線輻射對(duì)谷稗種子芽苗根系活力的影響

60Co-γ射線輻射處理芽苗的根系活力的變化如圖2所示。根系活力隨輻射劑量增加而呈現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢(shì)，且在250 Gy輻射劑量時(shí)根系活力最高，450 Gy輻射劑量根系活力最低。200～300 Gy輻射劑量根系活力分別比對(duì)照增加了36.56%，58.81%和18.26%，350～450 Gy輻射劑量根系活力分別比對(duì)照降低了19.63%，41.84%和66.65%。

圖2 60Co-γ輻照對(duì)谷稗芽苗根系活力的影響Fig.2 Effect of 60Co-γ radiation on root activity of seedling of Echinochloa crusgalli

2.4 60Co-γ射線輻射對(duì)谷稗種子出苗率和成苗率的影響

60Co-γ射線輻射處理對(duì)谷稗種子出苗率和成苗率的影響如表3所示。種子出苗率隨輻射劑量增加呈先增加后降低的變化趨勢(shì)，且在300 Gy時(shí)出苗率最高，輻射處理提高了谷稗種子出苗率，但降低了幼苗的成苗率，不同劑量輻射處理下谷稗種子幼苗的成苗率均低于50%，說明200 Gy以上輻射劑量對(duì)谷稗種子的成苗產(chǎn)生了極大的影響。

在不同輻射劑量中，谷稗種子成苗率半致死劑量常被認(rèn)為是輻射誘變率最高的劑量，并能獲得可利用的誘變體，因此常采用半致死劑量作為植物輻射的最佳劑量[10-13]。根據(jù)谷稗種子在不同輻射劑量下的成苗率(表3)，建立輻射劑量(X)對(duì)成苗率(Y)的回歸方程，成苗率Y=-0.1136X+59.58(R2=0.98641)，半致死劑量是84.33 Gy。

表3 60Co-γ射線輻照對(duì)谷稗出苗率和成苗率的影響Table 3 Effects of 60Co-γ irradiation on germination ratio and survival rate of Echinochloa crusgalli

3 討論

適宜的輻射劑量可增加有效突變體的獲得，在一定范圍內(nèi)增加輻射劑量可以拓寬突變譜，但過高的輻射劑量會(huì)降低出芽率、增加畸變率，一般都以半致死劑量作為輻射育種適宜的輻射劑量[10-13]。但哪種輻射劑量能夠獲得最多的有益突變暫無定論[14]。韓貴清[6]等人的研究認(rèn)為30 Gy的輻照即對(duì)谷稗有正向作用，而本試驗(yàn)采用高劑量(200～450 Gy)輻照谷稗種子，綜合分析發(fā)現(xiàn)，200～250 Gy劑量輻照對(duì)于谷稗也有一定的正向作用。本研究中，谷稗的干種子發(fā)芽率比較低，但在輻照后發(fā)芽情況有一定增加，其原因可能是輻射對(duì)種子萌發(fā)的生理活動(dòng)產(chǎn)生了一定的促進(jìn)作用。從試驗(yàn)結(jié)果來看，輻射處理對(duì)谷稗種子發(fā)芽具有一定的促進(jìn)作用，隨著輻射劑量的增加，種子活力受到的抑制作用也增強(qiáng)，并且表現(xiàn)出輻射劑量越大，抑制作用越明顯，種子活力越低的變化趨勢(shì)，這與耿興敏[15]等人研究60Co-γ輻射對(duì)桂花種子萌發(fā)的影響的結(jié)果基本一致。

根的生長情況和活力水平直接影響地上部的生長和營養(yǎng)狀況及產(chǎn)量水平。根系活力是衡量根系功能的主要指標(biāo)之一[16-17]。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)200～300 Gy60Co-γ射線輻射處理對(duì)種子芽苗根系活力有促進(jìn)作用。

隨著輻射劑量的增加，輻射處理對(duì)谷稗種子芽苗的生長產(chǎn)生明顯的抑制作用，導(dǎo)致種子芽苗的根長和芽長顯著降低，鮮重和干重也出現(xiàn)降低的變化趨勢(shì)，原因可能與60Co-γ射線在輻照時(shí)破壞了部分種胚有關(guān)，而種胚受損可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生長和增殖受阻，進(jìn)而影響種子的生理活動(dòng)[15-16]，也有可能是因?yàn)檩椛淠芰康亩逊e導(dǎo)致根尖及芽尖分生區(qū)細(xì)胞分裂受到抑制，并且這種抑制隨芽苗生長而不斷顯現(xiàn)，最終導(dǎo)致幼苗生長困難甚至不能成苗[12]。而出苗率與成苗率試驗(yàn)也證明了這一點(diǎn)，各個(gè)輻射劑量處理的種子在出苗第一周均能正常生長，但在第二周后均出現(xiàn)芽苗不同數(shù)量的死亡，表現(xiàn)為由芽尖開始自上而下的萎蔫直至死亡，而無輻射處理組則可以正常生長。結(jié)合對(duì)谷稗根系活力的變化研究可以推測(cè)由于高劑量的60Co-γ射線對(duì)根部生長及根系活力的影響最終導(dǎo)致了出苗與成苗率不符的情況。

從發(fā)芽試驗(yàn)和根系活力測(cè)定結(jié)果來看，250 Gy左右的輻射劑量能有效地誘導(dǎo)谷稗種子發(fā)生變異，又不會(huì)使種子受到過度損傷而影響萌發(fā)和幼苗生長，對(duì)幼苗的表現(xiàn)分析，谷稗的適宜輻照劑量應(yīng)小于250 Gy，根據(jù)成苗率試驗(yàn)結(jié)果分析，最適宜谷稗的輻射劑量大概在84.33 Gy左右，這需要進(jìn)一步的探索以確定該劑量是否是一個(gè)適合谷稗變異品種篩選的劑量。

4 結(jié)論

谷稗種子在200～450 Gy高輻射劑量下，其發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)的變化均隨輻射劑量的增加呈現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢(shì)；除200 Gy輻射劑量的芽苗鮮重比對(duì)照略有增加外，其他輻射劑量芽苗的根長、芽長、鮮重、干重均低于對(duì)照組；根系活力隨輻射劑量增加呈現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢(shì)；經(jīng)輻射處理的谷稗種子在出苗率上有一定的增加，但成苗率均下降。說明高劑量60Co-γ射線輻射對(duì)于谷稗種子萌發(fā)、芽苗生長、出苗率和成苗率產(chǎn)生不同的影響。