閆天芳， 苗彥軍， 王向濤， 魏臻武， 徐雅梅*， 藺永和

(1.西藏農(nóng)牧學(xué)院，西藏 林芝 860000； 2.揚州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 江蘇 揚州225009； 3.蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院， 甘肅 蘭州 730000)

西藏位于我國西部，地域遼闊，平均海拔4 000 m以上，年均氣溫4.8℃，降水表現(xiàn)出明顯的地域性，從東南到西北依次遞減(4 000～50 mm)[1]。高寒缺氧、雨水匱乏成為高原植物生長最大的限制因素，因此探索培育能耐寒耐旱的牧草品種對于西藏生態(tài)經(jīng)濟的可持續(xù)發(fā)展尤為重要。披堿草屬牧草(Elymus)是一種多年生冷季型禾本科牧草，主要分布于我國青藏高原的西北、西南和華北地區(qū)，能夠適應(yīng)平均海拔在3 000～5 000 m的高原，常作為建群種，是青藏高原草原和草甸的重要組成部分[2]。由于其品質(zhì)優(yōu)良、產(chǎn)草量高、對于高原環(huán)境的適應(yīng)性強，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于高寒地區(qū)牧草地和人工草地的建植，是高寒地區(qū)生態(tài)恢復(fù)改良的主要牧草之一[3-4]。

當牧草遭受干旱脅迫時，細胞內(nèi)活性氧發(fā)生代謝失調(diào)，加劇了細胞膜脂過氧化作用，從而氧化細胞膜系統(tǒng)發(fā)生嚴重的損傷。牧草長期適應(yīng)性演化過程中為應(yīng)對這種生理特性的損傷，從而逐漸形成了一套完善的抗氧化防御系統(tǒng)，來提高自身的抗旱性。研究認為：丙二醛、超氧化物歧化酶、游離脯氨酸、以及植物體內(nèi)可溶性糖含量等生理指標可作為植物抗逆性生理評價的重要指標。研究發(fā)現(xiàn)，當植物受到外界環(huán)境脅迫時，植物細胞通過積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)保持細胞內(nèi)膨壓維持植物的生理過程，以丙二醛含量來反映植物細胞膜的受傷害程度，脯氨酸含量的增加可防止細胞脫水，超氧化物歧化酶活性對于防止自由基活性氧的毒害至關(guān)重要，可溶性糖的積累有利于提高細胞膨壓[5-8]。目前較為科學(xué)的研究植物抗旱性的方法是在水分脅迫下測定植物的相關(guān)生理生化指標。只以單項指標來評價，結(jié)果存在片面性，需多個與抗旱性有關(guān)的指標應(yīng)用數(shù)學(xué)方法對其進行綜合分析，才能更加準確地評價出植物抗旱性。本試驗選取來自不同生境的野生披堿草屬植物作為試驗材料，進行耐旱性鑒定，系統(tǒng)地分析在土壤水分脅迫下植株苗期葉片生理生化變化，利用模糊隸屬函數(shù)法對其耐旱性進行綜合評定。通過測定相關(guān)生理生化等指標，綜合評定和分析不同生境來源披堿草屬植物在水分脅迫下的生理適應(yīng)機制及抗旱性評價，旨在為西藏地區(qū)披堿草屬植物的抗旱性選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料：老芒麥采集于拉薩市，其它三種材料分別采集于西藏的林芝縣、那曲縣和申扎縣(表1)。

表1 材料及來源Table 1 Materials and sources

注：下文圖表中出現(xiàn)的材料名稱均以編號表示。

Note: The codes of material names will be used in following Figures and Tables.

1.2 研究方法

本實驗于2016年4月份在西藏農(nóng)牧學(xué)院高寒草地實驗室進行。選擇成熟、籽粒飽滿、大小均勻、健康無病蟲害的種子為試驗材料。用2% NaClO對待用牧草種子進行表面消毒5 min，再用蒸餾水沖洗3次。農(nóng)場取土，在105℃的烘箱中烘5 h后裝入在直徑20 cm、高18 cm的塑料花盆中，在有孔塑料花盆底部鋪雙層濾紙，這樣既可以通氣，同時也阻止沙土漏出。每個花盆放入2.5 kg的烘干土壤，設(shè)置3個重復(fù)。在花盆內(nèi)種植牧草種子進行澆水處理，使每盆土壤處于飽和含水狀態(tài)即土壤的內(nèi)部和表層均含水達到飽和狀態(tài),而表面的開口孔隙及面層卻處于無水狀態(tài)。置于人工氣候箱內(nèi)培養(yǎng)，溫度為15/25℃，12 h光照，12 h黑暗處理。在2～3片真葉時進行定苗，待長到4～5葉齡時進行干旱脅迫處理(4月6日)即停止?jié)菜?。分別在干旱處理4 d、8 d、12 d、16 d，測定植株幼苗葉片生理生化指標，每個處理3次重復(fù)。取樣時間為早晨9: 00-10: 00。

1.3 測量指標與方法

1.3.1植物葉片相對含水量(relative water conter,RWC) 采用飽和稱重法[9]測定RWC。稱取葉片5 g(Wf)，在蒸餾水中浸泡24 h稱取飽和鮮重(Wt)然后在110℃下烘干稱樣品干重(Wd)。用RWC(%)=(Wf-Wd)(Wt-Wd)×100% 計算，3次重復(fù)。

1.3.2脯氨酸(free proline,Pro)含量 采用酸性茚三酮法[10]測定Pro含量。稱取葉片各0.2～0.5 g，加入3%磺基水楊酸5 mL，在沸水浴中提取10 min，冷卻后，吸取2 mL提取液加入2 mL冰醋酸和3 mL酸性茚三酮，在沸水浴中提取40 min，冷卻，加入5 mL甲苯，振蕩，靜置數(shù)分鐘，待溶液分層后吸出甲苯層，用分光光度計在520 nm波長比色，3次重復(fù)。

1.3.3超氧化物歧化酶(superxide dismutase,SOD)活性 采用氮藍四唑法[11]測定SOD活性。稱取葉片0.5 g，加磷酸緩沖液研磨成漿，10000 r·min-1下離心10 min。取上清液0.1 mL加入0.05 mol·L-1磷酸緩沖液1.5 mL，130 mmol·L-1甲硫氨酸0.3 mL，750 μmol·L-1氮藍四唑溶液0.3 mL，100 μmol·L-1EDTA-Na2溶液0.3 mL，加入20 μmol·L-1核黃素0.3 mL，再加入0.05 mL酶液，對照管加酸緩沖液代替酶液，最后加入蒸餾水0.25 mL，共3 mL反應(yīng)液，混合均勻，將對照管置暗處，其他各管立即置于4 000 lx日光燈下反應(yīng)20 min后，用黑布遮住，終止反應(yīng)，以遮光的對照管作為空白，在波長560 nm下比色，3次重復(fù)。

1.3.4丙二醛(malondialdeehyde,MDA)含量 采用硫代巴比妥酸法[12]測定MDA含量。稱取鮮葉片1 g，加入10%三氯乙酸(TCA)緩沖液研磨得10 mI二漿，4 000 r·min-1下離心10 min，取上清液2 mL，加入2 mL硫代巴比妥酸溶液，沸水浴加熱15 min，冷卻后4 000 r·min-1下離心10 min，以硫代巴比妥酸溶液為參比液，分別在波長532 nm、600 nm和450 nm處測定光密度值，3次重復(fù)。

1.3.5可溶性糖(soluble sugar content,SSC)含量 采用苯酚法[13]測定SSC含量。稱取鮮葉片0.1～0.3 g，加蒸餾水，塑料膜封口，于沸水中提取30 min，過濾入25 mL容量瓶中，定容，作為待測液。取0.5 mL提取液，加1.5 mL蒸餾水，加1 mL的9%苯酚溶液，5 mL濃硫酸，搖勻，顯色。在485 nm波長下比色，3次重復(fù)。

1.4 苗期抗旱性綜合評價

1.4.1抗旱性評價方法 采用隸屬函數(shù)法進行抗旱性評價[14]。

材料各指標隸屬函數(shù)值：

μ(Xj)=(Xj-Xmin)/(Xmax-Xmin)

式中，Xj表示第j個指標值，Xmin表示第j個指標的最小值，Xmax表示第j個指標中的最大值。如果某一指標與抗旱性呈負相關(guān)，可采用反隸屬函數(shù)法計算抗旱隸屬函數(shù)值：

μ(Xj)=(Xmax-Xj)/(Xmax-Xmin)

求出各指標平均值后對不同材料間各指標間進行算數(shù)平均數(shù)進行比較，平均值越大代表耐旱性越強。

1.4.2抗旱性評價分級標準 將試驗材料的綜合抗旱能力D值劃分為3級。Ⅰ 級：綜合評價值0.7以上，為抗旱性強；Ⅱ 級：綜合評價值在0.5～0.7之間，為抗旱性中等；Ⅲ 級：綜合評價值在0.5以下，為抗旱性弱[14]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2013對原始數(shù)據(jù)進行處理，SPSS 19.0軟件并用鄧肯氏(Duncan)法進行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫對葉片RWC的影響

隨著干旱脅迫時間的延長，幼苗葉片相對含水量持續(xù)降低，呈下降趨勢(圖1)。在干旱脅迫第4 d時，供試幼苗葉片相對含水量均保持在80～90%之間，幼苗色澤光鮮，含水量充足。干旱脅迫4～8 d時失水速度緩慢，土壤中水分較充足，失水速度緩慢。以脅迫8 d時相對含水量作為對照，LS的變化量最小僅為2%，SZ的變化量最大為12.8%。干旱脅迫8～12 d時，土壤出現(xiàn)板結(jié)現(xiàn)象，幼苗出現(xiàn)不同程度的萎蔫，失水速度達到最快。表現(xiàn)為葉片發(fā)生卷曲，部分葉尖與葉片邊緣開始泛黃。出現(xiàn)干枯現(xiàn)象。干旱脅迫16 d時，花盆表面土壤板結(jié)情況嚴重，幼苗葉片出現(xiàn)不同程度的干枯現(xiàn)象，LZ葉片倒伏于花盆邊緣。

圖1 干旱脅迫對葉片相對含水量影響Fig.1 Effect of drought stress on leaf relative water content注：圖中不同小寫字母表明差異顯著(P<0.05 )，下圖相同。Note：Different lowercase letters in theFigure indicate significant difference at the 0.05 level, the same as below.

2.2 干旱脅迫對MDA含量的影響

當供試幼苗遭受干旱脅迫時，隨著脅迫時間的延長，MDA含量都表現(xiàn)出逐漸增加的趨勢(圖2)。脅迫8～12 d時 LZ、LS、NQ增幅達到最高，SZ在12 d后增幅達到最高。增長幅度達到了52.69%。以干旱脅迫第4 d作為對照，LZ和LS的MDA含量變化最小，分別而增加了14 nmol·g-1FW和14.24 nmol·g-1FW。SZ的MDA含量變化最大，變化量達到了23.67 nmol·g-1FW。供試幼苗MDA含量峰值與對照相比，變化差異較大，從小到大依次為：LZ

圖2 干旱脅迫對葉片MDA含量的變化Fig.2 The content of MDA under different drought stress

2.3 干旱脅迫對SOD活性的影響

供試幼苗葉片中SOD活性隨干旱脅迫強度加劇呈先上升后下降的變化趨勢(圖3)。干旱脅迫4 d時各幼苗SOD活性差異性顯著(P<0.05)，其中LS的SOD活性最高，LZ的SOD活性最低。NQ與SZ的SOD活性最為接近，平均為276.61 U·g-1FW。脅迫8 d時SOD活性增長幅度從小到大排序依次為：LS < NQ < SZ

圖3 干旱脅迫對葉片SOD含量影響Fig.3 The activity of SOD under different drought stress

2.4 干旱脅迫對Pro含量的影響

隨著干旱脅迫強度的加劇，Pro含量都呈明顯上升的趨勢(圖4)。供試幼苗干旱脅迫第4 d時Pro含量接近，平均為24.66 μg·g-1FW。脅迫第8 d后Pro含量增長速度均達到最高，分別為106.8%，99.3%，115.7%，123.6%，其中LS增長速度最小為99.3%，SZ增長速度達到了123.6%。脅迫12～16 d時，Pro含量增長速度均明顯變慢，脅迫16 d時，Pro含量達到峰值且差異顯著(P<0.05)。其中Pro含量最高的是SZ，高達163.8 μg·g-1FW，最低的是LS，為101.03 μg·g-1FW。4份材料Pro含量由少到多依次為LS

圖4 干旱脅迫對葉片Pro含量影響Fig.4 The content of pro under different drought stress

2.5 干旱脅迫對SSC含量影響

供試幼苗隨著干旱脅迫時間的延長，SSC含量均表現(xiàn)出逐漸增加的趨勢(圖5)。在干旱脅迫12 d時，供試幼苗SSC含量差異顯著(P<0.05)。LZ與SZ在脅迫16 d時漲幅達到最高分別為69.69%和91.96%。NQ在脅迫8 d時漲幅達到最高為61.05%，LS在脅迫4～8 d時SSC含量變化量最小僅為9.41%，供試幼苗都在脅迫16 d時可溶性糖含量達到峰值，分別為7.31 mg·g-1，4.83 mg·g-1，5.83 mg·g-1，9.26 mg·g-1，其中SSC含量SZ最高，LS最低。在脅迫期間供試幼苗SSC含量增幅達到最高點的時間各不相同，LZ增幅在12 d后達到最高，LS在脅迫4～8 d時SSC含量變化差異不顯著，NQ在4 d后增幅達到最大隨后增長速度趨于平緩，SZ在脅迫4～12 d時增長速度均勻，12～16 d時增長速度突然增大。方差分析表明，各供試幼苗在干旱脅迫條件下葉片中SSC含量差異性顯著(P<0.05)。

圖5 干旱脅迫對葉片SSC含量影響Fig.5 The content of soluble sugar under different drought stress

2.6 抗旱性綜合評價

植物的耐旱性是由多種因素相互作用而構(gòu)成的一個較為復(fù)雜的綜合性狀。本試驗將供試的4份材料與抗旱性有關(guān)的5個指標進行抗旱指數(shù)綜合分析，計算出供試材料與各指標的隸屬度值，以供試材料的抗旱算數(shù)平均隸屬度作為抗旱鑒定綜合評價指標。綜合評價值越大，抗旱性越強，反之則弱。表2為4種材料的綜合評價結(jié)果。LZ、LS、NQ、SZ抗旱隸屬度分別為0.552，0.544，0.560和0.573，都介于0.4～0.7之間，屬于中等抗旱性。供試材料抗旱能力強弱依次為SZ > NQ > LZ >LS。

表2 不同材料抗旱指標的抗旱指數(shù)隸屬及其隸屬度評價Table 2 Analysis of subordinate function values of drought resistance index of different materials

3 討論

葉片RWC反映植物組織的含水狀況是以植物組織飽和含水量為基礎(chǔ)來表示，被用來表示植株遭受水分脅迫后水分虧缺程度的參數(shù)[15]。本試驗研究表明在干旱脅迫下，植物葉片中RWC與抗旱性呈正相關(guān)[16-19]。在脅迫第8 d后葉片供試材料相對含水量下降速度變快，其中以LZ、LS下降最快，NQ和SZ下降速度相對較慢，由此表明相對含水量下降速度越慢抗旱性越強。植物葉片RWC下降越嚴重，葉片萎蔫越嚴重，說明膜的透性變大，植物細胞受傷越嚴重，抗旱性隨之變差。這與祁娟[17]等在披堿草與老芒麥苗期抗旱性綜合評價的研究結(jié)果一致。

植物在逆境條件下或器官發(fā)生衰老時，會發(fā)生膜質(zhì)過氧化作用，其中MDA是主要產(chǎn)物之一，其含量常被用作衡量細胞膜脂過氧化指標。MDA含量越高，植物組織受傷越重，植物抗旱能力越弱[20]。本試驗研究表明：供試材料隨干旱脅迫強度加劇，MDA含量呈上升趨勢。供試材料在干旱脅迫下，MDA含量均存在顯著差異(P<0.05)，表明在干旱脅迫下植物幼苗受到了不同程度的損害。在干旱脅迫4～8 d時，供試材料葉片MDA含量與對照(以脅迫第4 d時MDA含量作為對照)相比變化不大。這表明植物在短期逆境條件下，植物器官遭受傷害程度小。在脅迫8 d后MDA含量大幅度上升，表明植物體內(nèi)細胞受到嚴重破壞，增幅越大，植物細胞受傷害程度越大，抗逆性越差。SZ在脅迫12 d后MDA含量增幅達到最大，表明其抗旱性最弱，植物葉片MDA緩慢增加的時間維持越長，植物的抗旱性越強，反之則越弱，這與魯存海[20],程紅焱[21]研究結(jié)果一致。在干旱脅迫下，4份供試材料MDA含量均顯著增加，不同材料間MDA含量增長速度不同。其中，SZ的MDA含量增幅達到最高的時間最晚，說明植物膜系統(tǒng)受到傷害時對于逆境的脅迫持續(xù)的時間最久，抗旱性最強，NQ次之，LZ與LW最弱。

SOD是植物體內(nèi)最重要的抗氧化酶，SOD活性大小與植物抗逆性相關(guān)[22]。在逆境脅迫下，SOD活性對于防止細胞膜遭受自由基活性氧的毒害至關(guān)重要。在此期間其活性往往會升高，來保護植物細胞膜免受自由基活性氧毒害，在逆境條件下，清除自由基的能力越強，保護酶活力維持的時間越久，植物的抗逆性就越強。試驗結(jié)果顯示，在干旱脅迫下，4份供試材料SOD活性均呈現(xiàn)先增加后降低趨勢。均在脅迫8～12 d時SOD活性漲幅最高，在脅迫12d時各供試幼苗中SOD活性達到最大且達到峰值，隨后SOD活性開始迅速下降。其中LZ、LS下降幅度最快分別達到了62.4%，72.3%。NQ和SZ相對較慢為45.2%，52.5%。結(jié)果表明干旱脅迫可使SOD活性增強，在同等脅迫條件下，SOD達到峰值迅速下降時，下降速率越快，抗旱性越弱。脅迫后期SOD活性出現(xiàn)迅速下降的現(xiàn)象可能是由于隨著脅迫強度的加劇，植物細胞多種生理功能受到破壞，發(fā)生生理代謝紊亂，使得SOD活性受到抑制。也可能是由于脅迫強度過大，活性氧和防御系統(tǒng)的動態(tài)平衡遭到了破壞，使酶活性降低[23]。原因有待進一步考證。

Pro既可作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)又能與蛋白質(zhì)相互作用。植物在正常條件下， Pro含量很低。但遭受逆境脅迫時，便會大量積累來保持原生質(zhì)與環(huán)境的滲透平衡。與蛋白質(zhì)相互作用增加蛋白質(zhì)可溶性或減少可溶性蛋白的沉淀，可作為植物抗逆性生化指標[24]。在干旱脅迫下，4份供試材料Pro含量隨著脅迫程度的加劇，供試材料Pro含量都持續(xù)升高。目前，對于Pro含量的增加與植物耐旱性間的關(guān)系還存在很多異議，但多數(shù)研究者認為Pro能降低細胞的滲透勢、具有保護和穩(wěn)定細胞生物大分子的作用，其含量的高低與植物的抗旱性呈正相關(guān)[25-26]。本試驗中，4份供試材料Pro含量隨脅迫程度的加強在增大，在脅迫第8 d后供試材料Pro含量增幅達到最大。其中SZ在遭受脅迫時Pro含量明顯高于其他材料，其抗旱性最高。當植物受到逆境脅迫時Pro含量越高，其抗旱性越高，本試驗結(jié)果與張昌勝、郭郁頻[27]等的研究結(jié)論相一致，說明逆境下Pro含量升高對植物體逆境脅迫抗性有利。

植物在干旱脅迫環(huán)境中，SSC也是植物體內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，參與滲透調(diào)節(jié)，有利于植物在干旱脅迫下吸收水分，從而提高植物的抗旱性[28]。也有研究者認為SSC在維持蛋白質(zhì)穩(wěn)定方面可能也起到重要作用，保證細胞的正常生理功能[29]。本試驗中，在干旱脅迫下，4份供試材料SSC含量隨著脅迫強度的加劇呈上升趨勢。其中SZ增加幅度最大，且SSC含量最高，說明SSC含量對于增強其抗旱性起到了一定作用。LZ、LS、SZ都在脅迫12 d后SSC含量出現(xiàn)大幅度增長，而NQ在脅迫4 d后就發(fā)生SSC含量大幅度增長現(xiàn)象，在脅迫8～16 d時SSC含量增長速度呈勻速增長。表明NQ材料在受到干旱脅迫時，其葉片內(nèi)SSC含量對于干旱脅迫的敏感程度高于其他材料。當脅迫強度加劇時，供試材料SSC含量變化差異顯著，對于抗旱性的影響較大，可作為抗旱性鑒定指標。結(jié)果表明當植物遭受干旱脅迫時，SSC含量的增高對于植物對抗干旱脅迫起到積極作用。與王川[30]，張小嬌[31]等研究結(jié)論一致。

植物所在生境年平均降水量對于植物的抗旱性具有一定影響[32-33]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)海拔高度對于披堿草屬植物抗旱性呈正相關(guān)，年平均降水量對于披堿草屬植物抗旱性呈負相關(guān)。由表1可看出在西藏地區(qū)海拔高度的高低又直接影響著當?shù)氐哪昶骄邓?，隨著海拔高度升高，年平均降水量降低。在降水量偏低的地區(qū)披堿草需適應(yīng)本地環(huán)境而變的更具耐旱性，海拔高度與披堿草的抗旱性之間的關(guān)系，可能是由于海拔高度升高間接影響植物生境的降水量，繼而影響植物的抗旱性，植物的抗旱性與海拔高度有何影響，需進行進一步研究。本實驗研究表明隨著海拔高度的升高披堿草屬植物的抗旱性隨之變強，所在生境的年平均降水量越低披堿草屬植物的抗旱性越強。本實驗研究材料所在生境的海拔高度排序依次為：SZ>NQ>LS>LZ；通過抗旱性評價得出抗旱性強弱順序由強到弱依次為：SZ>NQ>LZ>LS。在降水量相對較高的林芝垂穗披堿草抗旱性高于在降水量相對較低的拉薩老芒麥，可推斷出同屬披堿草屬的垂穗披堿草抗旱性高于老芒麥。

4 結(jié)論

4種披堿草屬植物幼苗在干旱脅迫條件下，RWC含量隨脅迫程度的加劇而下降，MDA、Pro及可溶性糖含量隨脅迫程度的加劇而上升，SOD則是先上升后下降。5個生理指標在4種披堿草屬植物幼苗間均存在顯著差異，可以作為披堿草屬植物抗旱性的評價指標。在脅迫8 d后各測試指標的變化趨勢均出現(xiàn)了明顯的轉(zhuǎn)折點，說明8 d后土壤的含水量可能是披堿草屬耐旱的關(guān)鍵水勢點。本研究采用模糊隸屬函數(shù)法對西藏4種野生披堿草屬植物抗旱性進行綜合評價后，得出其抗旱性強弱順序依次為：申扎垂穗披堿草>那曲垂穗披堿草>林芝垂穗披堿草>拉薩老芒麥。綜合得出在申扎地區(qū)的野生垂穗披堿草在高寒缺氧、雨水匱乏的青藏高原繁育前景廣闊，為選育具有抗旱、抗寒的優(yōu)良垂穗披堿草提供了依據(jù)。