韋黨軍，高潮兵，吳正升

人喉鱗狀細(xì)胞癌中CMIP的表達(dá)及意義

韋黨軍1,2，高潮兵3，吳正升1

目的 探討CMIP(C-Maf inducing protein)基因在人喉鱗狀細(xì)胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma, LSCC)和喉息肉組織中的表達(dá)及其臨床意義。方法 應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)28例人LSCC和23例喉息肉組織中CMIP mRNA的表達(dá)；應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)86例人LSCC和29例喉息肉組織中CMIP蛋白的表達(dá)，分析其與LSCC臨床病理特征及其預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果 LSCC CMIP mRNA和蛋白表達(dá)均顯著高于喉息肉組織；CMIP表達(dá)與LSCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期呈顯著正相關(guān)，并且CMIP表達(dá)均與LSCC患者無(wú)復(fù)發(fā)生存期(relapse-free survival, RFS)和總生存期(overall survival, OS)密切相關(guān)。結(jié)論 CMIP可能參與人LSCC的發(fā)生、發(fā)展，CMIP表達(dá)提高可能是LSCC進(jìn)展和預(yù)后不良的潛在標(biāo)志物。

喉腫瘤；鱗狀細(xì)胞癌；CMIP；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；免疫組織化學(xué)

喉鱗狀細(xì)胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma, LSCC)是人喉部最常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)病率僅次于肺癌，是呼吸系統(tǒng)第二大惡性腫瘤[1]。盡管近年來(lái)LSCC的診療技術(shù)有了一定進(jìn)展，中晚期LSCC患者的預(yù)后仍然不令人滿(mǎn)意[2]。另外，一些傳統(tǒng)的判定LSCC患者預(yù)后的指標(biāo)，如臨床TNM分期和腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等指標(biāo)并不能完全準(zhǔn)確的評(píng)估患者的生存狀況和指導(dǎo)后續(xù)治療[3]。因此，探討人LSCC發(fā)生、發(fā)展背后的分子機(jī)制以及相關(guān)重要調(diào)控因子，有助于發(fā)掘并建立新的有效的判定LSCC患者病情進(jìn)展和預(yù)后生物學(xué)標(biāo)志物，乃至將來(lái)對(duì)LSCC的分子靶向藥物的研發(fā)具有重要意義。本文分別使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫組化法檢測(cè)LSCC患者新鮮腫瘤組織和石蠟包埋組織(以喉息肉作為對(duì)照)中CMIP(C-Maf inducing protein)的表達(dá)及其與患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，探討CMIP作為L(zhǎng)SCC病情進(jìn)展和患者預(yù)后判定的一種新的生物學(xué)標(biāo)志物。目前，關(guān)于CMIP在人LSCC的研究國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2009～2012年安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院和太和縣中醫(yī)院病理科存檔的86例LSCC和29例喉息肉組織，組織均以10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋。每例病例診斷均經(jīng)病理證實(shí)。按照美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)(AJCC)最新分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行臨床分期。所有病例均獲隨訪，獲得無(wú)復(fù)發(fā)生存期(relapse-free survival, RFS)和總生存期(overall survival, OS)?；颊咝g(shù)前均未接受任何放療或化療等治療。另收集2015～2016年安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院存檔的耳鼻喉手術(shù)切除的28例LSCC和23例喉息肉組織，標(biāo)本離體后立即置入液氮保存。所有病例診斷均經(jīng)病理證實(shí)。

1.2 試劑與方法

1.2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR Trizol提取液購(gòu)自Reagent公司，cDNA合成試劑盒購(gòu)于Takara公司，Ex Tap PCR反應(yīng)試劑盒購(gòu)于Takara公司，PCR引物由上海捷瑞公司合成。首先將收集的LSCC和喉息肉新鮮組織按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行總RNA提取，cDNA合成和定量PCR檢測(cè)。每個(gè)樣本分別重復(fù)3次，得到擴(kuò)增曲線和樣本的相對(duì)定量Ct值。以標(biāo)本CMIP的Ct值和內(nèi)部參照GAPDH的Ct值用2-△△Ct法得到每個(gè)樣本CMIP的mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.2 免疫組化 鼠抗人CMIP單克隆抗體購(gòu)自Proteintech公司(工作濃度1 ∶100)，采用免疫組化MaxVision法染色，即用型免疫組化試劑盒及DAB顯色劑均購(gòu)自福州邁新公司，具體操作按說(shuō)明書(shū)染色步驟進(jìn)行。以PBS緩沖液代替一抗作陰性對(duì)照，用已知陽(yáng)性標(biāo)本作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定 CMIP染色以細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)明顯的黃色顆粒視為陽(yáng)性著色，染色標(biāo)準(zhǔn)綜合陽(yáng)性細(xì)胞率及染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)估，判斷表達(dá)強(qiáng)度：0分為陰性(-)，1～2分為弱陽(yáng)性(1+)，3～4分為中度陽(yáng)性(2+)，5～6分為強(qiáng)陽(yáng)性(3+)。陰性和弱陽(yáng)性視為低表達(dá)，中度和強(qiáng)陽(yáng)性視為高表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 CMIP在人LSCC和喉息肉組織中的表達(dá) 在新鮮樣本中，28例LSCC的CMIP mRNA表達(dá)量為3.05±1.25，23例喉息肉組織為1.44±0.52，兩者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖1)。而CMIP蛋白陽(yáng)性信號(hào)呈黃色顆粒狀，主要定位于鱗狀細(xì)胞癌的細(xì)胞質(zhì)，正常鱗狀上皮有少量表達(dá)(圖2)。86例石蠟包埋LSCC組織中CMIP高表達(dá)率為52.3%，29例喉息肉組織高表達(dá)率為27.6%，兩者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，表1)。

圖1 喉息肉和喉鱗狀細(xì)胞癌組織中CMIP mRNA的表達(dá)

表1 CMIP在人喉鱗狀細(xì)胞癌和喉息肉中的表達(dá)[n(%)]

*P=0.021

AB

圖2 CMIP蛋白在喉息肉組織(A)中呈低表達(dá)，在喉鱗狀細(xì)胞癌組織(B)中呈高表達(dá)，MaxVision法

2.2 CMIP表達(dá)與LSCC臨床病理特征的關(guān)系 CMIP表達(dá)與LSCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期呈顯著正相關(guān)(P<0.05；P<0.01)，與患者年齡、性別、腫瘤位置和組織學(xué)分級(jí)均無(wú)顯著相關(guān)性(P>0.01，表2)。

表2 CMIP表達(dá)與人喉鱗狀細(xì)胞癌臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.3 CMIP表達(dá)與LSCC患者預(yù)后的關(guān)系 為探討CMIP表達(dá)與LSCC患者預(yù)后的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)采用Kaplan-Meier曲線法和Log-rank檢驗(yàn)對(duì)CMIP蛋白表達(dá)及LSCC患者RFS和OS關(guān)系進(jìn)行單因素生存分析。86例具有完整隨訪資料的LSCC患者，CMIP蛋白表達(dá)均與患者RFS和OS密切相關(guān)(P均<0.01，圖3)。

圖3 喉鱗狀細(xì)胞癌組織中CMIP蛋白表達(dá)與患者無(wú)復(fù)發(fā)生存率(A)和總生存率(B)的關(guān)系

3 討論

喉癌是臨床耳鼻咽喉頭頸外科常見(jiàn)的腫瘤之一，好發(fā)于中老年男性，其具體病因尚不十分清楚，可能與患者吸煙、病毒感染和飲酒過(guò)多等多種因素有關(guān)。近年來(lái)，隨著我國(guó)城市大建設(shè)和城鎮(zhèn)工業(yè)化的影響，大氣污染如霧霾等日益加重，可能也是引起喉癌發(fā)病率升高的原因之一[4-6]。目前，臨床喉癌的治療主要采取以手術(shù)治療為主的綜合治療，包括手術(shù)治療、化療、放療和免疫治療等。然而，每種治療均有其優(yōu)缺點(diǎn)，對(duì)于喉癌患者特別是中晚期患者的治療效果難以達(dá)到滿(mǎn)意的效果。近年來(lái)，隨著“個(gè)體化治療”和“精準(zhǔn)治療”等理念的提出，迫切需要開(kāi)發(fā)新的有效的腫瘤生物標(biāo)志物和藥物靶點(diǎn)為不同患者提供最合適的治療策略[7-8]。因此，認(rèn)識(shí)腫瘤發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移等分子機(jī)制，從中發(fā)掘重要的調(diào)控因子對(duì)監(jiān)測(cè)腫瘤病情發(fā)展、指導(dǎo)治療和建立藥物靶點(diǎn)有著重要意義。

LSCC是臨床實(shí)踐中喉癌最主要的組織學(xué)類(lèi)型，目前大多數(shù)喉癌研究均以其為研究對(duì)象，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了一些LSCC相關(guān)的癌基因和抑癌基因。Gao等[9]采用免疫組化法檢測(cè)76例LSCC和26例喉息肉組織中ARTN基因及其受體GFRα1表達(dá)，發(fā)現(xiàn)LSCC中ARTN和GFRα1表達(dá)顯著高于喉息肉組織，并且與腫瘤臨床分期和患者預(yù)后密切相關(guān)。Zhuang等[10]研究發(fā)現(xiàn)LSCC組織中CCAT1表達(dá)顯著高于癌旁組織黏膜組織，并且與腫瘤組織學(xué)分級(jí)和臨床分期密切相關(guān)，進(jìn)一步體外研究發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)CCAT1能夠促進(jìn)LSCC細(xì)胞Hep-2的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，提示CCAT1可能在LSCC發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮癌基因角色。孫玉滿(mǎn)等[11]應(yīng)用免疫組化SP法檢測(cè)85例LSCC及癌旁切緣組織中p53、p21和Cdk1/p34cdc2蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)p53、p21和Cdk1/p34cdc2蛋白在LSCC發(fā)生、發(fā)展中可能起重要作用，癌旁切緣組織中p53、p21和Cdk1/p34cdc2過(guò)表達(dá)與LSCC局部復(fù)發(fā)密切相關(guān)，Ge等[12]研究發(fā)現(xiàn)miR-300在LSCC組織中表達(dá)較癌旁正常組織顯著下調(diào)，并且過(guò)表達(dá)miR-300可以顯著抑制Hep-2細(xì)胞的增殖和侵襲，提示miR-300在LSCC進(jìn)展中發(fā)揮抑癌基因角色。

CMIP是一種銜接蛋白，具有兩種亞型：一種亞型是短蛋白，參與多種信號(hào)通路，并且在微小病變型腎小球腎炎的發(fā)病中發(fā)揮重要作用[13-14]；另一種亞型是長(zhǎng)蛋白，其功能目前尚不清楚[15-16]。CMIP在人LSCC中角色尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)首先使用兩種技術(shù)檢測(cè)LSCC組織和良性喉息肉組織中CMIP蛋白和mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤組織中CMIP蛋白和mRNA表達(dá)均較良性病變組織顯著提高。進(jìn)一步通過(guò)臨床病理特征分析發(fā)現(xiàn)，CMIP表達(dá)與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期呈正相關(guān)，并且與LSCC患者RFS和OS呈負(fù)相關(guān)，提示CMIP在LSCC發(fā)生、發(fā)展中可能發(fā)揮癌基因角色。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)臨床LSCC組織和喉息肉組織樣本中CMIP的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CMIP表達(dá)量與患者病情進(jìn)展和術(shù)后生存期密切相關(guān)，提示CMIP可能參與LSCC發(fā)生、發(fā)展，其表達(dá)量可能是預(yù)測(cè)病情進(jìn)展和患者預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)。

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Clinical significance of CMIP expression in human laryngeal squamous cell carcinoma

WEI Dang-jun1,2, GAO Chao-bing3, WU Zheng-sheng1
(1DepartmentofPathology,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China;2DepartmentofOtorhinolaryngology,TaiheHospitalofTraditionalChineseMedicine,Fuyang236600,China;3DepartmentofOtorhinolaryngology,HeadandNeckSurgery,FirstAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China)

Purpose To investigate the expression of C-Maf inducing protein(CMIP) in human laryngeal squamous cell carcinoma and polyps tissues, and to analyze their association with clinicopathological parameters and survival of patients with laryngeal squamous cell carcinoma. Methods Real-time PCR assay was used to detect the expression of CMIP mRNA in 28 cases of laryngeal squamous cell carcinoma and 23 cases of polyp fresh tissue specimen. Immunohistochemical staining was used to detect the expression of CMIP in 86 cases of formalin-fixed and parrffin-embedded laryngeal squamous cell carcinoma and 29 cases of polyp tissue specimens. The clinicopathological and prognostic significance of CMIP expression was investigated in laryngeal squamous cell carcinoma. Results The expression of CMIP mRNA and protein was both significantly increased in laryngeal squamous cell carcinoma compared with polyp tissue specimens. The expression of CMIP was significantly associated with tumor lymph node metastasis and late clinical stage of laryngeal squamous cell carcinoma. Furthermore, the expression of CMIP was significantly correlated with poor relapse-free survival and overall survival in laryngeal squamous cell carcinoma. Conclusion CMIP might play an important role in the development and progression of laryngeal squamous cell carcinoma and increased expression of CMIP might imply disease progression and poor outcome in patient with laryngeal squamous cell carcinoma.

laryngeal neoplasms; squamous cell carcinoma; C-Maf inducing protein; Real-time PCR; immunohistochemistry

安徽省學(xué)術(shù)和技術(shù)帶頭人及后備人選科研基金資助項(xiàng)目(2016H074)、安徽省高校優(yōu)秀青年人才支持計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(gxyqZD2016046)

1安徽醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室，合肥 2300322安徽省阜陽(yáng)市太和縣中醫(yī)院耳鼻喉科，阜陽(yáng) 2366003安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻喉科，合肥 230032

韋黨軍，男，碩士研究生。Tel: (0551)62922025，E-mail: 13966591297@163.com 吳正升，男，博士，教授，通訊作者。E-mail: woozson@126.com

時(shí)間：2017-6-20 11:18 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170620.1117.012.html

R 739.6

A

1001-7399(2017)06-0649-04

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.06.012

接受日期：2017-02-14