朱永紅，李朋波，潘轉(zhuǎn)霞，楊六六，夏芝，曹彩榮，吳翠翠，丁霄，侯保國

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所，山西運(yùn)城044000）

利用Barnase和Barstar基因創(chuàng)建棉花雄性不育系及恢復(fù)系

朱永紅，李朋波，潘轉(zhuǎn)霞，楊六六，夏芝，曹彩榮，吳翠翠，丁霄，侯保國

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所，山西運(yùn)城044000）

將Barnase及Barstar基因構(gòu)建的不育及恢復(fù)基因載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入棉花基因組，經(jīng)田間生物學(xué)檢測及分子檢測，獲得120株T0陽性棉花不育系植株和76株T0陽性棉花恢復(fù)系植株。經(jīng)回交轉(zhuǎn)育，選育成不同性狀的不育系材料5個(gè)，恢復(fù)性良好的恢復(fù)系材料3個(gè)；獲得的不育系及恢復(fù)系材料已選育至T5。

棉花；雜種優(yōu)勢；雄性不育系；恢復(fù)系

棉花三系雜交品種較之常規(guī)品種具有產(chǎn)量高、纖維品質(zhì)優(yōu)等優(yōu)勢，而目前我國三系雜交棉育種由于受種質(zhì)材料限制，進(jìn)展緩慢，三系雜交棉花品種商業(yè)化推廣應(yīng)用非常有限。利用基因工程創(chuàng)建棉花雄性不育系及恢復(fù)系是一種有效的棉花三系雜交育種方法。國內(nèi)外研究者先后利用核糖核酸酶Barnase基因獲得了雄性不育的煙草和油菜、水稻、玉米、西瓜等植株[1-6]。山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所利用Barnase及Barstar基因獲得了雄性不育和恢復(fù)系植株。經(jīng)回交轉(zhuǎn)育，培育成不同特點(diǎn)的不育系材料5個(gè)，恢復(fù)系材料3個(gè)[7-10]。

1 棉花雄性不育基因及恢復(fù)基因載體構(gòu)建

利用煙草中分離的花藥絨氈層特異性啟動子TA29、擬南芥中分離的啟動子A6和A9與Barnase基因及Barstar基因構(gòu)建轉(zhuǎn)化載體，以新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因II（NPTII）為報(bào)告基因、抗除草劑溴苯腈基因（Bxn）作為鑒定篩選基因[11-15]，經(jīng)質(zhì)粒DNA提取、純化、酶切和連接等操作完成。載體命名為pBin19-3pBN，其獲得國家發(fā)明專利（專利號為ZL 00124829.4）。

2 Barnase和Barstar基因?qū)γ藁ǖ倪z傳轉(zhuǎn)化結(jié)果

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對棉花進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，農(nóng)桿菌選用根癌農(nóng)桿菌EHA105，轉(zhuǎn)化受體棉花品種為晉棉7號、珂字312和冀合321。采用山西省農(nóng)科院棉花研究所創(chuàng)建的棉花高效轉(zhuǎn)化再生技術(shù)體系，以下胚軸為外植體，經(jīng)浸染、愈傷組織誘導(dǎo)、分化及植株再生幾個(gè)階段獲得再生植株。再生植株采用嫁接方式移入大田，成活率高達(dá)95%以上[16-19]。

3 轉(zhuǎn)基因不育及恢復(fù)植株的檢測結(jié)果

用5×10-5mol/L的溴苯腈溶液涂抹待測棉花植株葉片，葉片顏色無變化的為轉(zhuǎn)基因陽性植株，葉片表現(xiàn)出失綠枯黃的為非轉(zhuǎn)基因棉花植株[11-12]。用PCR法分子檢測進(jìn)一步驗(yàn)證，引物用PADDON等報(bào)道的序列[20-22]，用于Barnase基因檢測的引物有2條：P1為5′-CGGGTACCATGGCACAGGTTATCA AC-3′，P2為5′-TCTAGAGCTCGAGTTATCTGATCT TTGTAAAGG-3′。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因植株中檢測到目的條帶，而非轉(zhuǎn)基因植株中沒有檢測到目的條帶。以Barnase和Barstar DNA為探針，進(jìn)行Southern雜交，結(jié)果顯示，其與PCR檢測結(jié)果一致。經(jīng)檢測，共獲得陽性T0不育系植株120株，恢復(fù)系植株76株。

4 轉(zhuǎn)基因棉花雄性不育系的花器特征及遺傳規(guī)律

轉(zhuǎn)基因陽性不育株T0能正常開花，開花時(shí)間較早；花朵較小，花藥比正常棉花小、幾乎無花粉。轉(zhuǎn)基因陽性T0幾乎全表現(xiàn)不育，人工授粉后能正常成鈴結(jié)實(shí)，結(jié)實(shí)率與正常棉花無差異。從T1開始，不育株育性開始出現(xiàn)分離。T1不育株率變化范圍較大，可能是因?yàn)锽arnase基因的表達(dá)能力、表達(dá)環(huán)境不同，與Barnase基因插入位點(diǎn)數(shù)目也有關(guān)[23-25]。隨選育世代延續(xù)，不育性狀逐漸穩(wěn)定。目前，獲得不育性狀能穩(wěn)定遺傳的材料有3個(gè)，對這些穩(wěn)定的不育系材料進(jìn)行回交轉(zhuǎn)育，選用不同回交親本，育成了抗蟲不育系材料、具有海島棉遺傳背景的抗逆不育材料、抗旱不育系材料、優(yōu)良纖維品質(zhì)不育系材料及抗草甘膦除草劑不育系，已穩(wěn)定遺傳至T5。

5 恢復(fù)系的遺傳選育及恢復(fù)度測定結(jié)果

恢復(fù)系鑒定采用分子檢測結(jié)合田間溴苯腈檢測及恢復(fù)性測試檢測。采用回交選育方法，現(xiàn)已選育成不同遺傳背景的恢復(fù)系材料3個(gè)?；謴?fù)度檢測試驗(yàn)結(jié)果表明，恢復(fù)系恢復(fù)能力較強(qiáng)，恢復(fù)度在75%～92.6%，恢復(fù)性可穩(wěn)定遺傳，已選育至T5。遺傳背景相近的不育系與恢復(fù)系之間恢復(fù)率較高。

6 展望

目前，棉花三系雜交品種選育受到不育系遺傳基礎(chǔ)較窄、恢復(fù)系農(nóng)藝性狀差等因素的限制，而利用基因工程創(chuàng)造雄性不育系及恢復(fù)系能夠彌補(bǔ)目前棉花三系雜交棉育種存在的不足。隨研究的深入，用Barnase基因創(chuàng)造雄性不育系已經(jīng)在越來越多的植物中取得重要研究進(jìn)展[26-27]。目前，由于遺傳轉(zhuǎn)化效率、基因表達(dá)、育性分離等原因，尚未取得商業(yè)化進(jìn)展。由于基因工程雄性不育棉花的雄性不育性具有細(xì)胞核基因的特性，導(dǎo)致其育性在后代出現(xiàn)分離，應(yīng)用受到限制[28-29]。值得欣慰的是，所獲得的不育系棉花在人工授粉情況下具有正常的成鈴結(jié)籽能力，其不育性也能穩(wěn)定遺傳，恢復(fù)系經(jīng)多代選育，恢復(fù)能力已能夠滿足雜交制種要求，其恢復(fù)性能也可穩(wěn)定遺傳，目前我們培育的5種類型不育系及3個(gè)恢復(fù)系材料，拓寬了棉花雄性不育系及恢復(fù)系的遺傳基礎(chǔ)，已經(jīng)組配選育出一些有苗頭的雜交組合，為進(jìn)一步培育棉花三系雜交品種奠定了基礎(chǔ)。

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Study on Establishment Male Sterile Lines and Restorer Lines of Cotton by Using Barnase and Barstar Gene

ZHUYonghong，LI Pengbo，PANZhuanxia，YANGLiuliu，XIAZhi，CAOCairong，WUCuicui，DINGXiao，HOUBaoguo
（Institute ofCotton，Shanxi Academy ofAgricultural Sciences，Yuncheng 044000，China）

A carrier constructed with sterile gene Barnase and its antagonist gene Barstar was transferred into cotton genome mediated by Agrobacterium.It was verified through molecular detection that 120 positive male sterile lines of cotton plants of T0generation and 76 positive restorer lines of cotton plants of T0generation were got.By backcrossing,5 male sterile lines of cotton of different traits and 3 restorer lines ofcotton with good ability ofrecovery were bred.

cotton;heterosis;male sterile line;restorer line

S562

：A

：1002-2481（2017）07-1056-03

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.07.02

2017-03-01

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2016YFD0101416）

朱永紅（1974-），男，陜西渭南人，助理研究員，碩士，主要從事棉花遺傳育種研究工作。