高中南，余磊磊，周京龍，周燚 (長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院,湖北 荊州 434025)

白芨種子共生及非共生萌發(fā)的研究進(jìn)展

高中南，余磊磊，周京龍，周燚 (長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院,湖北 荊州 434025)

綜述了白芨(Bletillastriata)種子共生萌發(fā)的過(guò)程與機(jī)制、種子的采集與保存、種子的消毒與預(yù)處理、非共生萌發(fā)的培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件及組培苗移栽技術(shù)等的研究進(jìn)展，并對(duì)白芨種子萌發(fā)研究及白芨工業(yè)化生產(chǎn)進(jìn)行了展望。

白芨(Bletillastriata)；共生萌發(fā)；非共生萌發(fā)

白芨(Bletillastriata)別名朱蘭，為蘭科(Orchidaceae)地生型多年生草本球莖植物。花期主要在春季，具有很高的藥用及園林價(jià)值。主要用于收斂止血、消腫生肌，是我國(guó)民間傳統(tǒng)的珍貴中藥材之一[1]，市場(chǎng)需求量很大。近些年來(lái)，在我國(guó)白芨被過(guò)度采挖，且生長(zhǎng)環(huán)境被嚴(yán)重破壞，野生白芨資源急聚下降，瀕臨滅絕，白芨已被我國(guó)列為重點(diǎn)保護(hù)生物類(lèi)群。分株繁殖是白芨栽培常用的方法[2]，但分株繁殖周期長(zhǎng)，效率低，繁殖力有限，滿(mǎn)足不了產(chǎn)業(yè)化栽培的需要。白芨亦可采用直播繁殖，但其種子細(xì)小如粉且無(wú)胚乳，一個(gè)果莢常含上萬(wàn)粒種子，數(shù)量極多，野生條件下很難萌發(fā)，且萌發(fā)過(guò)程中通常需要共生真菌為其提供營(yíng)養(yǎng)，種子萌發(fā)率非常低[3]。要滿(mǎn)足大量栽培的需要，種子萌發(fā)是關(guān)鍵所在。筆者對(duì)近年來(lái)白芨種子萌發(fā)相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以為加快白芨產(chǎn)業(yè)化步伐提供參考。

1 共生萌發(fā)的研究

共生萌發(fā)是指在共生菌侵染下種子萌發(fā)的過(guò)程。白芨種子細(xì)小如粉且無(wú)胚乳和子葉，其胚無(wú)法為種子萌發(fā)過(guò)程提供足夠養(yǎng)分，且種子必須從外界獲取萌發(fā)所需的營(yíng)養(yǎng)元素和生長(zhǎng)因子[4]。

1.1 真菌對(duì)白芨種子萌發(fā)的促進(jìn)作用

19世紀(jì)人們證實(shí)了蘭科植物中存在著共生菌，并證實(shí)共生菌能促進(jìn)蘭科種子萌發(fā)。同時(shí)表明，在野生環(huán)境下，白芨種子只有被其共生真菌侵染才能萌發(fā)。1992年郭順星等[5]研究白芨共生萌發(fā)特性，發(fā)現(xiàn)白芨在常規(guī)環(huán)境下能順利發(fā)芽，為蘭科植物中易萌發(fā)的種子類(lèi)型。種子與真菌拌種播種，可明顯加快種子萌發(fā)過(guò)程中原球莖子葉分化及假根形成。真菌培養(yǎng)后的提取液能促進(jìn)白芨萌發(fā)和生長(zhǎng)，表明該菌代謝產(chǎn)物可能含有促進(jìn)白芨生長(zhǎng)的活性養(yǎng)料。真菌拌種和提取液播種效果相似。

1.2 染菌萌發(fā)過(guò)程中細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化

1990年徐錦堂等[6]研究了白芨共生萌發(fā)細(xì)胞中微小結(jié)構(gòu)的生長(zhǎng)過(guò)程。該研究表明，白芨為蘭科植物中易萌發(fā)種類(lèi)。胚的大型薄壁細(xì)胞中富含淀粉及脂類(lèi)等貯藏物質(zhì)，是種子在常規(guī)條件下萌發(fā)的主要營(yíng)養(yǎng)來(lái)源。種子與真菌拌種播種，被合適的真菌侵染，發(fā)芽勢(shì)會(huì)升高，能明顯促進(jìn)原球莖的分化。觀(guān)察萌發(fā)過(guò)程中細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，真菌首先穿過(guò)種皮細(xì)胞到達(dá)種胚，從胚柄處進(jìn)入胚細(xì)胞，然后散布在胚柄端的幾層胚細(xì)胞中。胚細(xì)胞被真菌侵入后，細(xì)胞器和細(xì)胞質(zhì)漸漸變沒(méi)，質(zhì)膜內(nèi)陷生成的囊狀體包裹并吸收菌絲中的養(yǎng)分。菌絲經(jīng)過(guò)白芨細(xì)胞壁過(guò)程中，尖端多半會(huì)膨漲變大，依賴(lài)其與細(xì)胞質(zhì)作用生成的壓力在白芨細(xì)胞中穿行。此外少量菌絲的細(xì)胞壁會(huì)在侵染后顯著變厚，用于加厚的營(yíng)養(yǎng)元素來(lái)源于白芨種胚細(xì)胞質(zhì)，這些加厚的菌絲最后會(huì)被全部消解，為白芨種子萌發(fā)和生長(zhǎng)提供養(yǎng)分。真菌即將侵入但還未侵入的白芨細(xì)胞顯示出很旺盛的代謝活力。

白芨種子染菌萌發(fā)中，種子對(duì)不同真菌侵入后的反應(yīng)并非完全一致，適宜的真菌在胚的一定范圍細(xì)胞中存在，形成彼此營(yíng)養(yǎng)平衡的共生關(guān)系，有利于種子萌發(fā)及其后的生長(zhǎng)。有些真菌或植物致病菌可使整個(gè)白芨種胚充滿(mǎn)菌絲，導(dǎo)致種子死亡。

1.3 真菌促進(jìn)白芨種子萌發(fā)的機(jī)制

在白芨種子萌發(fā)的過(guò)程中，白芨種胚中養(yǎng)分往往不夠，侵入的真菌可為它提供養(yǎng)分和生長(zhǎng)因子等。入侵的真菌不僅能為種子萌發(fā)提供所需的營(yíng)養(yǎng)，而且共生真菌能產(chǎn)生抑制其他微生物生長(zhǎng)的活性物質(zhì)，可大大減少種子被雜菌污染的幾率，進(jìn)而為白芨種子萌發(fā)及生長(zhǎng)提供良好的環(huán)境條件[7～9]。

2 非共生萌發(fā)的研究

白芨非共生萌發(fā)是指利用組織培養(yǎng)技術(shù)，在人工培養(yǎng)基上不外加真菌侵染使白芨種子萌發(fā)。非共生萌發(fā)能在短時(shí)間內(nèi)得到大批白芨幼苗，是目前成本低、既快速又有效的繁殖方法之一[10～13]。白芨在自然環(huán)境或人工培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)速度都非常慢，繁殖系數(shù)也很低。利用組織培養(yǎng)技術(shù)促進(jìn)白芨種子的大量萌發(fā)，可以解決分株繁殖系數(shù)低、成本高的弊端，并且能在短期內(nèi)得到大批生長(zhǎng)健全的小苗，是一種經(jīng)濟(jì)高效的繁殖方式。

2.1 白芨種子的采集與保存

白芨種胚的成熟度決定著非共生萌發(fā)的萌發(fā)率，種胚的年齡到20 周時(shí)開(kāi)始采收最好，這時(shí)種子含胚的幾率最大，萌發(fā)率接近100%，萌發(fā)所需的時(shí)間為1 周[14]。最好在白芨種子成熟后但蒴果還未開(kāi)裂之前進(jìn)行采集[15]。

溫度和種子含水量是影響種子壽命的主要因素。白芨種子在5℃條件下保存為宜。新鮮白芨種子在5℃下儲(chǔ)藏最為合適，該溫度下存放60d后，種子才開(kāi)始緩慢減少萌發(fā)率，即使150d后種子的萌發(fā)率仍接近50%。在5℃和-18℃條件下儲(chǔ)存干燥種子，3個(gè)月內(nèi)種子萌發(fā)率幾乎一樣，儲(chǔ)存在-18℃的種子的萌發(fā)率稍高一點(diǎn)，表明冷凍對(duì)干燥的種子的萌發(fā)率基本無(wú)影響[16]。

2.2 白芨種子的消毒與預(yù)處理

未開(kāi)裂的白芨蒴果常用的消毒方法如下：先使用70%酒精消毒30s，再用0.1%升汞進(jìn)行消毒15min，或根據(jù)實(shí)際試驗(yàn)的情況確定消毒時(shí)間。也可用2.5%次氯酸鈉溶液代替升汞進(jìn)行消毒。消毒完后再用無(wú)菌水沖洗3遍，并用無(wú)菌濾紙把水吸干[17]。然后在無(wú)菌條件下切開(kāi)果莢，取出種子，將種子均勻接種到已滅菌的培養(yǎng)基上，實(shí)驗(yàn)所用的刀和鑷子等都需要經(jīng)過(guò)消毒處理。陳超等[18]研究發(fā)現(xiàn)，接種到培養(yǎng)基中的種子數(shù)量越多，種子萌發(fā)會(huì)越迅速，這體現(xiàn)出群體效應(yīng)。但不宜過(guò)密，過(guò)密則會(huì)得到負(fù)面效果。

開(kāi)裂的白芨蒴果宜用次氯酸鈉代替升汞消毒。因?yàn)榇温人徕c對(duì)細(xì)小白芨種子傷害更小，且消毒效果也好。

2.3 非共生萌發(fā)的培養(yǎng)基

根據(jù)前人的研究，現(xiàn)收集整理部分白芨非共生萌發(fā)及生根壯苗培養(yǎng)基配方(表1)。目前比較常用的培養(yǎng)基有MS、改進(jìn)的MS、KC、N6和RE等。這些培養(yǎng)基一般還加入2%～3%的蔗糖、0.8%左右的瓊脂固化，pH還不確定，大多研究認(rèn)為5.8～6.5較合適。培養(yǎng)基中一般還加入一定濃度的NAA，能提高種子萌發(fā)率和萌發(fā)速度；關(guān)于其中加入6-BA的作用，還存在一定的爭(zhēng)議。目前，關(guān)于白芨種子萌發(fā)最適培養(yǎng)基配方也沒(méi)有一致的結(jié)論。多數(shù)研究在培養(yǎng)基中加入了不同的添加劑，常用的添加劑有椰子汁、香蕉汁、菠蘿汁、土豆汁等[19]，它們是一類(lèi)成分復(fù)雜的天然復(fù)合物，可有效促進(jìn)種子萌發(fā)。一般培養(yǎng)基中還會(huì)加入一定量活性碳。一般認(rèn)為，活性炭能提供暗環(huán)境，促進(jìn)不定根的誘導(dǎo)；還能吸附培養(yǎng)基中酚類(lèi)等有毒有害物質(zhì)，有效地防止褐變；也能吸附培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物[20,21]。

表1 白芨種子非共生萌發(fā)培養(yǎng)基配方

2.4 培養(yǎng)條件

蘭科植物種子萌發(fā)通常采用暗培養(yǎng)或光照強(qiáng)度為1200～2000lx的環(huán)境中培養(yǎng)[29,30]。但李雨晴等[31]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，黑暗下培養(yǎng)會(huì)降低白芨種子的發(fā)芽率。培養(yǎng)的溫度通常為25℃左右。光照時(shí)間通常為12h左右。

2.5 組培苗的移栽

種子萌發(fā)后，待幼苗長(zhǎng)至2cm左右時(shí)，將幼苗轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，待幼苗長(zhǎng)至3～5cm時(shí)，打開(kāi)培養(yǎng)瓶瓶蓋放在室內(nèi)自然光下煉苗3d左右[32]，然后取出幼苗，將根部附著的培養(yǎng)基清洗干凈，再移栽至育苗基質(zhì)中，基質(zhì)為腐質(zhì)土與蛭石按一定比例混合配制，使用前要先消毒。移栽后適度遮陰，并保持一定的濕潤(rùn)。

3 問(wèn)題與展望

白芨具有很高的藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，雖其種子屬于蘭科中易萌發(fā)的類(lèi)型，但白芨的工業(yè)化生產(chǎn)問(wèn)題仍未解決。

白芨種子共生萌發(fā)雖然行之有效，但白芨體內(nèi)分離的真菌不一定是其種子萌發(fā)的共生菌，且共生菌的篩選需要很長(zhǎng)時(shí)間，共生萌發(fā)也較緩慢。不過(guò)一旦篩選出效果較好的共生菌，就可進(jìn)行大規(guī)模育苗。通過(guò)共生萌發(fā)形成的幼苗，成活率也更高?，F(xiàn)階段有關(guān)白芨共生菌的研究文獻(xiàn)還不夠多，也沒(méi)有效果非常好的共生菌被篩選出來(lái)。因此，亟需研究人員篩選出效果較好的種子萌發(fā)共生菌。

現(xiàn)階段研究得較多的是白芨的非共生萌發(fā)，非共生萌發(fā)操作簡(jiǎn)便，可在短時(shí)期內(nèi)生產(chǎn)出很多白芨幼苗，但非共生萌發(fā)的幼苗移栽的成活率相對(duì)較低，且白芨蒴果即使在5℃條件下存放一段時(shí)間后也會(huì)開(kāi)裂，開(kāi)裂后種子的消毒不易把握，消毒過(guò)長(zhǎng)種子易死；消毒不完全，培養(yǎng)基和種子易被雜菌污染，污染不僅會(huì)浪費(fèi)種子，還會(huì)降低白芨幼苗產(chǎn)量。李慧敏等[33]研究發(fā)現(xiàn)，含有假鱗莖的白芨組培苗存活率非常高，認(rèn)為假鱗莖的誘導(dǎo)形成是提高組培苗存活的關(guān)鍵。此外，非共生萌發(fā)的最適培養(yǎng)基也沒(méi)有統(tǒng)一的配方。如何改進(jìn)培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件進(jìn)一步提高萌發(fā)率、改進(jìn)消毒方法減少污染率、改進(jìn)移栽技術(shù)提高幼苗成活率仍需進(jìn)一步研究。

2種萌發(fā)方法都有不足之處，基于此，有研究者提出了原地共生萌發(fā)法。白芨原地共生萌發(fā)法是指將白芨種子裝在特殊的袋子中，然后埋到白芨原來(lái)的野生生長(zhǎng)環(huán)境中，一段時(shí)間后察看白芨種子萌發(fā)與否，并檢測(cè)細(xì)胞是否被真菌侵入[34]。該技術(shù)在國(guó)外已被用于蘭科植物種群保育，維持蘭科植物種群發(fā)展，但國(guó)內(nèi)還未廣泛運(yùn)用。

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[編輯] 余文斌

2017-02-26

湖北省農(nóng)業(yè)創(chuàng)新基地項(xiàng)目(2010CBB03801)；湖北省科技廳重點(diǎn)基金項(xiàng)目(2015000384)。

高中南(1991-)，男，碩士生，研究方向?yàn)橹参锊『εc生物防治。通信作者：周燚，zhouyi@yangtzeu.edu.cn。

Q949.71+8.43

A

1673-1409(2017)14-0058-04

[引著格式]高中南，余磊磊，周京龍，等.白芨種子共生及非共生萌發(fā)的研究進(jìn)展[J].長(zhǎng)江大學(xué)學(xué)報(bào)(自科版) ，2017，14(14)：58～61.