包愛(ài)科，白天惠，趙天璇，蘇家豪

(草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院, 甘肅 蘭州730020)

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CRISPR/Cas9系統(tǒng)：基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)及其在植物基因功能研究中的應(yīng)用

包愛(ài)科*，白天惠，趙天璇，蘇家豪

(草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院, 甘肅 蘭州730020)

CRISPR/Cas系統(tǒng)是細(xì)菌和古細(xì)菌在長(zhǎng)期演化過(guò)程中形成的一種適應(yīng)性免疫防御系統(tǒng)，可用來(lái)對(duì)抗入侵的病毒及外源DNA。相比鋅指核酸酶(ZFNs)和TALE核酸酶(TALENs)，基于RNA指導(dǎo)的Ⅱ型CRISPR/Cas9系統(tǒng)為基因組定點(diǎn)編輯開(kāi)辟了一條新的道路，在基因功能研究中具有效率高、成本低、易于操作等顯著優(yōu)點(diǎn)。本文從CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基本結(jié)構(gòu)、作用機(jī)制及其在植物基因功能研究和作物遺傳育種中的應(yīng)用等方面進(jìn)行了簡(jiǎn)述，最后對(duì)該系統(tǒng)的發(fā)展前景進(jìn)行了展望。

基因編輯；CRISPR/Cas9系統(tǒng)；基因功能；分子育種

隨著越來(lái)越多物種全基因組測(cè)序的完成，進(jìn)一步研究基因的功能及其應(yīng)用是當(dāng)前面臨的一個(gè)新的挑戰(zhàn)。20世紀(jì)80年代發(fā)展起來(lái)的基因編輯技術(shù)可以對(duì)基因組完成精確修飾，通過(guò)在基因組水平上進(jìn)行基因的定點(diǎn)突變、插入、多位點(diǎn)突變及小片段的刪失等手段，進(jìn)行基因功能的研究。真核生物基因組包含成千上萬(wàn)的DNA堿基，直接對(duì)其進(jìn)行遺傳操作難度很大。同源重組(homologous recombination，HR)介導(dǎo)的打靶技術(shù)在基因編輯技術(shù)方面是一個(gè)很大的突破，大大推進(jìn)了生命科學(xué)領(lǐng)域的諸多研究進(jìn)程[1-2]。然而，盡管HR介導(dǎo)的基因打靶產(chǎn)生了許多精確的突變，但是其發(fā)生頻率很低，因此大規(guī)模應(yīng)用面臨巨大挑戰(zhàn)[3]。近年來(lái)出現(xiàn)的人工核酸酶技術(shù)很好地克服了這一缺點(diǎn)。人工核酸酶可以在基因組特定位點(diǎn)產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂(double strand broken，DSB)，隨后啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)的自我修復(fù)機(jī)制，通過(guò)非同源末端連接(non-homologous end joining，NHEJ)或同源重組(homologous recombination，HR)實(shí)現(xiàn)修復(fù)[4-5]。目前，人工核酸酶主要包括4類：大范圍核酸酶(meganuclease，MGN)、鋅指核酸酶(zinc-finger nuclease，ZFNs)、TALE核酸酶(transcription activator-like effector nuclease，TALENs)以及CRISPR/Cas系統(tǒng)。

MGN核酸酶是在酵母中發(fā)現(xiàn)，能夠識(shí)別14～40堿基長(zhǎng)度的核酸序列的歸巢核酸內(nèi)切酶，可構(gòu)建雙鏈斷裂，通過(guò)激活同源重組進(jìn)行修復(fù)[6]。歸巢核酸內(nèi)切酶識(shí)別并切割不含內(nèi)含子的同源等位基因，啟動(dòng)歸巢作用，插入序列就轉(zhuǎn)移到缺少該序列的同源等位基因上了。當(dāng)一個(gè)DNA序列被歸巢核酸內(nèi)切酶切割后，可以通過(guò)同源重組對(duì)其進(jìn)行修復(fù)，從而實(shí)現(xiàn)歸巢核酸內(nèi)切酶的轉(zhuǎn)移，以及內(nèi)含子和歸巢位點(diǎn)序列的阻斷[7]。但是，目前已知的大范圍核酸酶較少，不能覆蓋所有的靶位點(diǎn)，所以其應(yīng)用受到很大限制[8]。

ZFNs核酸酶包括DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域鋅指蛋白和切割結(jié)構(gòu)域ForkⅠ兩部分，每個(gè)鋅指蛋白能夠特異性識(shí)別3個(gè)堿基，而鋅指核酸酶是多個(gè)鋅指蛋白模塊的串聯(lián)，可以識(shí)別更多的核苷酸序列[9]。ForkⅠ通過(guò)二聚化才能產(chǎn)生核酸內(nèi)切酶活性。因此，需要兩個(gè)ZFN分別識(shí)別靶位點(diǎn)的上下游，當(dāng)兩個(gè)ZFN同各自的識(shí)別位點(diǎn)特異性結(jié)合并且中間間隔精確時(shí)，F(xiàn)orkⅠ將會(huì)行使切割功能，從而使DNA雙鏈斷裂(DSB)[9-10]?？梢?jiàn)，ZFNs的出現(xiàn)給基因編輯開(kāi)辟了一條新的道路，它有明顯的技術(shù)優(yōu)勢(shì)。然而，ZFNs依然存在著諸多如不能靶向所有的序列、使用前需要大量的篩選和鑒定、脫靶切割率較高等問(wèn)題[11-12]。

TALE核酸酶和ZFNs結(jié)構(gòu)類似，也由DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域TALE蛋白和切割結(jié)構(gòu)域ForkⅠ兩部分組成。在TALE蛋白的N-端是typeⅢ傳送系統(tǒng)的信號(hào)位點(diǎn)(translocation)，而其C-端則有核定位信號(hào)位點(diǎn)(nuclear locatization，NLS)和轉(zhuǎn)錄激活信號(hào)位點(diǎn)(transcriptional activation，AD)，中游是DNA特異結(jié)合域(DNA-binding domain)[13]。DNA特異結(jié)合域由33～35個(gè)氨基酸組成的重復(fù)片段串聯(lián)而成，每個(gè)片段靶向一個(gè)DNA堿基，串聯(lián)的重復(fù)片段可靶向識(shí)別多個(gè)堿基。TALE的C-端與ForkⅠ融合后形成TALEN單體，當(dāng)兩個(gè)TALEN單體分別特異性識(shí)別各自的位點(diǎn)后，兩個(gè)ForkⅠ的切割結(jié)構(gòu)域即可形成二聚體，從而切割DNA產(chǎn)生DSB[14]。與ZFNs相比，TALENs在設(shè)計(jì)和構(gòu)建上更為簡(jiǎn)便，但由于TALENs的重復(fù)片段很多，增大了與靶基因結(jié)合的難度，限制了其廣泛應(yīng)用[11]。

近年來(lái)，一項(xiàng)新的基因編輯技術(shù)——CRISPR/Cas技術(shù)被越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)室廣泛接受，該項(xiàng)技術(shù)不僅克服了前述3種基因編輯技術(shù)中出現(xiàn)的大多數(shù)問(wèn)題，且具有便于操作、成本低等優(yōu)點(diǎn)[15]，在動(dòng)植物基因功能鑒定、分子設(shè)計(jì)育種等研究領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力。因此，本文著重從CRISPR/Cas的基因座結(jié)構(gòu)、作用機(jī)制以及在植物基因功能研究中的應(yīng)用進(jìn)行詳細(xì)的介紹，以期為相關(guān)的研究提供參考。

1 CRISPR/Cas系統(tǒng)概述

1.1 CRISPR/Cas系統(tǒng)

早在1987年，Ishino等[16]在研究iap酶在大腸桿菌中參與堿性磷酸酶同工酶轉(zhuǎn)化時(shí)發(fā)現(xiàn)，iap基因的下游存在一種成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列，和大多數(shù)重復(fù)序列不同的是，這些重復(fù)序列被5個(gè)非重復(fù)序列間隔開(kāi)。但這一發(fā)現(xiàn)在當(dāng)時(shí)并沒(méi)有引起足夠的注意。在接下來(lái)的10年中，隨著更多的微生物基因組被測(cè)序，人們發(fā)現(xiàn)在40%的細(xì)菌和90%的古細(xì)菌中都存在這種成簇的重復(fù)序列[17]。直到2002年，這類重復(fù)序列才被正式命名為Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)[18]。同時(shí)，在CRISPR位點(diǎn)的附近發(fā)現(xiàn)存在一組保守的與CRISPR相關(guān)的蛋白編碼基因，被命名為Cas基因。根據(jù)不同的Cas基因，可以將CRISPR系統(tǒng)分為3種類型：TypeⅠ、TypeⅡ以及TypeⅢ[19-20]。Ⅰ型和Ⅲ型的CRISPR位點(diǎn)包含多個(gè)Cas蛋白，而Ⅱ型CRISPR位點(diǎn)只包含Cas9一種蛋白，便于構(gòu)建載體，因此，在目前的研究中，Ⅱ型的CRISPR/Cas9系統(tǒng)的使用比較廣泛。

2005年，多個(gè)研究小組均發(fā)現(xiàn)從CRISPR重復(fù)序列中分離出來(lái)的間隔序列與宿主菌染色體外的遺傳物質(zhì)有很高的同源性[21-23]。這被認(rèn)為是CRISPR系統(tǒng)研究的一個(gè)關(guān)鍵轉(zhuǎn)折點(diǎn)。很快， Barrangou等[24]首次為Ⅱ型CRISPR系統(tǒng)作為適應(yīng)性免疫系統(tǒng)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，證明了在基于核酸的免疫系統(tǒng)中，CRISPR的間隔區(qū)負(fù)責(zé)指導(dǎo)外源DNA的識(shí)別，而Cas酶則主要控制間隔區(qū)的采集和噬菌體的防御。在此之后，CRISPR/Cas系統(tǒng)的研究步伐明顯加快。2012年，Jinek等[25]通過(guò)對(duì)Ⅱ型CRISPR系統(tǒng)的改造和優(yōu)化，將CRISPR RNA(crRNA)和trans-activing crRNA(tracrRNA)構(gòu)建成一條單鏈引導(dǎo)RNA (single-guide RNA，sgRNA)，同樣可以與Cas9共同作用特異性切割目的基因。這為后來(lái)CRISPR/Cas系統(tǒng)在基因功能研究中的成功應(yīng)用打開(kāi)了一扇大門，如Mandal等[26]采用CRISPR/Cas系統(tǒng)在人類的造血干細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了有效的基因剔除；Chen等[27]通過(guò)該系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)(Caenorhabditiselegans)的雙重sgRNA定向基因敲除；Auer等[28]在斑馬魚(yú)中介導(dǎo)eGFP向Gal4轉(zhuǎn)基因株系的轉(zhuǎn)化；最近，Zhu等[29]也利用該系統(tǒng)在猴子胚胎干細(xì)胞中通過(guò)同源重組成功實(shí)現(xiàn)了基因的打靶。此外，CRISPR/Cas系統(tǒng)還為某些疾病的治療提供了新的手段，目前已成功利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)乙肝病毒[30]、EB病毒[31]以及范可尼貧血[32]等的基因編輯。因此，CRISPR/Cas系統(tǒng)已經(jīng)得到全世界從事生物學(xué)研究科學(xué)家的高度重視。

1.2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)及作用原理

Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)的基因結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單穩(wěn)定，由眾多短的高度保守的重復(fù)序列和長(zhǎng)度相似的間隔序列(spacers)間隔排列組成[33-37]，從5′端到3′端依次為tracrRNA、Cas9基因、前導(dǎo)序列(leader sequence)和CRISPR序列。前導(dǎo)序列可作為啟動(dòng)子，啟動(dòng)CRISPR序列的轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生crRNA前體(pre-crRNA)[38-39]。tracrRNA可與Cas9蛋白一起參與RNA酶Ⅲ對(duì)CRISPR轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的選擇性酶切，從而產(chǎn)生成熟的crRNA；隨后，由Cas9蛋白、tracrRNA和crRNA形成的復(fù)合體可對(duì)crRNA配對(duì)的外源DNA實(shí)施剪切[40]。值得注意的是，Cas9蛋白有兩個(gè)標(biāo)志性的核酸酶區(qū)域，RuvC和HNH，RuvC位于Cas9的氨基端，HNH是一個(gè)單一的核酸酶結(jié)構(gòu)域，位于蛋白的中間位置[41]。在Cas9蛋白行使剪切功能時(shí)，HNH核酸酶結(jié)構(gòu)域剪切與crRNA互補(bǔ)的序列，而RuvC結(jié)構(gòu)域則負(fù)責(zé)剪切非互補(bǔ)的序列[24]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)的另一個(gè)重要特征就是原型間隔序列毗鄰基序(protospacer adjacent motif, PAM)。DNA靶位點(diǎn)上與間隔序列對(duì)應(yīng)的序列被稱為原間隔序列(protospacer)，PAM通常位于protospacer的3′端，其序列很保守，長(zhǎng)度一般為2～5個(gè)堿基，與protospacer距離1～4個(gè)堿基[42]。當(dāng)外源核酸入侵時(shí)，宿主掃描到入侵核酸DNA序列中的多個(gè)PAM結(jié)構(gòu)，將PAM的5′端的序列定義為protospacer，從而獲得新的間隔區(qū)[42]。另外，由于CRISPR本身的重復(fù)序列中不存在PAM位點(diǎn)，因此，PAM的存在也是CRISPR系統(tǒng)區(qū)分自身DNA和外源DNA，從而避免發(fā)生自身免疫的原因之一[43]。釀膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes) Cas9的生物化學(xué)和結(jié)構(gòu)特征表明，PAM的識(shí)別可以啟動(dòng)Cas9靶向結(jié)合和切割之間的構(gòu)造轉(zhuǎn)換[43-45]。

目前已發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas系統(tǒng)的防御過(guò)程可分為3個(gè)階段：第一階段，CRISPR間隔區(qū)的獲得，包括識(shí)別和CRISPR位點(diǎn)上相鄰兩個(gè)重復(fù)序列間間隔區(qū)序列的整合。來(lái)自噬菌體或質(zhì)粒的雙鏈DNA的一小段特殊區(qū)域(即原型間隔序列)被整合到宿主細(xì)胞DNA的CRISPR前導(dǎo)序列末端，因此，spacer的位置代表了外源遺傳物質(zhì)入侵的時(shí)間順序[46]。在此過(guò)程中，Cas1和Cas2蛋白參與了新間隔序列的獲得[24,47]。第二階段，CRISPR基因座的表達(dá)。CRISPR基因座首先在RNA聚合酶的作用下被轉(zhuǎn)錄成前體CRISPR RNA (pre-CRISPR RNA)，然后被Cas蛋白或核酸內(nèi)切酶剪切成包含單個(gè)間隔區(qū)和部分重復(fù)區(qū)的更小的crRNA[48]。第三階段，CRISPR/Cas系統(tǒng)的干擾或免疫。該階段是CRISPR/Cas免疫反應(yīng)最關(guān)鍵的一步，crRNAs與Cas蛋白復(fù)合體共同作用，識(shí)別外來(lái)DNA上的靶序列并進(jìn)行堿基配對(duì)，形成的核糖核蛋白復(fù)合物在外源DNA的原型間隔序列處進(jìn)行切割[49-50]。已有研究發(fā)現(xiàn)，crRNA的間隔序列(spacer)與外源DNA的靶位點(diǎn)完全或部分互補(bǔ)都可以實(shí)現(xiàn)對(duì)特定位點(diǎn)的切割[49]。

2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在植物基因功能研究中的應(yīng)用

CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為一種全新的基因編輯技術(shù)，除了在動(dòng)物育種和疾病治療中發(fā)揮其優(yōu)勢(shì)外，在植物基因功能的研究中也體現(xiàn)出其簡(jiǎn)便、高效的特點(diǎn)。

2.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的構(gòu)建

CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)基因組進(jìn)行定點(diǎn)修飾時(shí)，只需要表達(dá)Cas9蛋白、crRNA和tracrRNA三個(gè)組分[51]。目前已對(duì)天然CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行了成功改造，將crRNA和tracrRNA雙組分利用基因工程整合成一條雙鏈RNA分子，成為sgRNA，從而將CRISPR/Cas9系統(tǒng)簡(jiǎn)化成了sgRNA和Cas9蛋白兩部分[25,52]。

Cas9核酸酶是CRISPR/Cas9系統(tǒng)中的核心部分。遺傳密碼有64種，但通常情況下，不同的物種在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，絕大多數(shù)生物傾向于利用其中的一部分密碼子，即對(duì)于編碼同一種氨基酸的同義密碼子的使用具有很大的偏好性。而這種密碼子的偏好性阻礙了細(xì)菌基因在植物細(xì)胞中的表達(dá)，因此，在轉(zhuǎn)入植物之前需要根據(jù)宿主植物基因?qū)?lái)源于細(xì)菌的基因進(jìn)行改造和密碼子優(yōu)化。有研究表明，在植物中對(duì)Cas9基因的密碼子進(jìn)行優(yōu)化可以顯著提高基因組的編輯效率[53]。另外，Cas9蛋白只有被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核中才能發(fā)揮作用，因此，需要在Cas9蛋白引入1個(gè)或2個(gè)入核的信號(hào)肽或標(biāo)簽蛋白[51]。sgRNA引導(dǎo)Cas9蛋白在靶位點(diǎn)進(jìn)行切割，是CRISPR/Cas9系統(tǒng)中另一個(gè)重要的組成部分。研究表明，選擇不同的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)sgRNA表達(dá)的效率不同。在雙子葉植物中，植物內(nèi)源的Ⅲ型啟動(dòng)子U6或組成型啟動(dòng)子CaMV35S均可高效地驅(qū)動(dòng)sgRNA的表達(dá)，而在單子葉植物中，除了這兩種啟動(dòng)子外，Ⅲ型啟動(dòng)子U3也可以高效的啟動(dòng)其表達(dá)[54-59]。另外，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在植物中進(jìn)行基因組編輯時(shí)，sgRNA中與PAM相距12～13個(gè)堿基的序列主要決定CRISPR/Cas9系統(tǒng)的特異性，前導(dǎo)序列中GC含量較高以及將sgRNA和Cas9核酸酶構(gòu)建在同一載體中可在一定程度上增加CRISPR/Cas9系統(tǒng)的靶向效率[58-59]。

綜合目前已有的報(bào)道，在體外構(gòu)建植物sgRNA-Cas9系統(tǒng)的流程大致可總結(jié)為以下幾個(gè)步驟：(1) 合成sgRNA。首先在已知序列中找到PAM位點(diǎn)，然后通過(guò)PAM定位尋找合適的靶位點(diǎn)，設(shè)計(jì)的靶位點(diǎn)最好在目標(biāo)基因序列的第一外顯子附近，這樣可以獲得較高活性的sgRNA(圖1A)。(2) sgRNA-Cas9重組質(zhì)粒的構(gòu)建。將合成的sgRNA和經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化的Cas9序列構(gòu)建重組質(zhì)粒。該過(guò)程可以構(gòu)建一個(gè)載體將sgRNA和Cas9同時(shí)載入，也可以分別構(gòu)建載體，構(gòu)建載體時(shí)需要攜帶報(bào)告基因或抗性基因(圖1B)。(3) sgRNA-Cas9重組質(zhì)粒載體活性檢測(cè)。Kabin等[60]在水稻(Oryzasativa)中將密碼子優(yōu)化過(guò)的Cas9和sgRNA克隆到水稻瞬時(shí)表達(dá)載體中，以水稻35s:GFP的表達(dá)作為質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率的參考來(lái)檢測(cè)重組質(zhì)粒載體的活性。如果沒(méi)有活性或活性較低，需要重新設(shè)計(jì)合成sgRNA。(4) 遺傳轉(zhuǎn)化。采用農(nóng)桿菌侵染或者基因槍法將構(gòu)建好的工程載體導(dǎo)入目標(biāo)植物，進(jìn)行基因組定點(diǎn)修飾。(5) 檢測(cè)定點(diǎn)修飾結(jié)果。一般會(huì)采用RE-PCR分析法、PCR+TA克隆測(cè)序法、基于可以識(shí)別錯(cuò)配雙鏈的錯(cuò)配內(nèi)切酶檢測(cè)法(Surveyor 法)和T7E1核酸內(nèi)切酶法以及結(jié)合二代測(cè)序(next generation sequencing，NGS)的高通量檢測(cè)法檢測(cè)定點(diǎn)修飾的結(jié)果[61]。

圖1 植物中使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行RNA指導(dǎo)的基因編輯原理圖Fig.1 Schematic description of RNA-guided genome editing in plants using the CRISPR/Cas9 system (A) sgRNA通過(guò)PAM定位尋找合適的靶位點(diǎn)，介導(dǎo)Cas9對(duì)靶序列進(jìn)行特異性切割。(B) sgRNA-Cas9重組質(zhì)粒的構(gòu)建示意圖。PolⅢ啟動(dòng)子和終止子控制sgRNA的轉(zhuǎn)錄；MCS為多克隆位點(diǎn)；PolⅡ啟動(dòng)子和終止子控制Cas9核酸酶的表達(dá)；NLS為核定位信號(hào)；Ampr代表抗性基因。(A) sgRNA find the right target site through the PAM and mediate the specific cleavage by Cas9. (B) Diagram of vectors for transient expression. A DNA-dependent RNA polymerase Ⅲ (Pol Ⅲ) promoter and terminator are used to control the transcription of engineered sgRNA. MCS represents the multiple cloning sites. Plant DNA-dependent RNA polymerase Ⅱ (Pol Ⅱ) promoter and terminator are used to control the expression of a chimeric Cas9 nuclease. NLS is a nuclear localization signal and Ampr represents a resistance gene.

2.2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在植物基因功能研究中的應(yīng)用

CRISPR/Cas系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)以后，很快就被應(yīng)用到了高等植物基因功能研究中。目前，CRISPR/Cas9系統(tǒng)已經(jīng)成功介導(dǎo)了擬南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻、小麥(Triticumaestivum)、煙草(Nicotianatabacum)、番茄(Lycopersiconesculintum)、大豆(Glycinemax)、甜橙(Citrussinensis)、毛白楊(Populustomentosa)以及豆科牧草蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)等基因組中單個(gè)位點(diǎn)甚至多個(gè)位點(diǎn)的修飾(表1)。Xu等[53]在水稻中通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)水稻BEL基因?qū)崿F(xiàn)了基因的靶向編輯。他們發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化方法是影響CRISPR/Cas9系統(tǒng)在植物中作用效率的重要因素，總體上使用基因槍會(huì)得到更高的轉(zhuǎn)化效率，且可以導(dǎo)致多個(gè)插入，從而有助于提高sgRNA和Cas9蛋白的表達(dá)水平。然而，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化通常能夠得到高效的單位點(diǎn)插入，因此，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的sgRNA-Cas9系統(tǒng)靶向的基因組更容易確定。不過(guò)最近Yin等[62]發(fā)現(xiàn)雙生病毒DNA復(fù)制可以提高基因打靶頻率。煙草花葉病毒是一種在細(xì)胞質(zhì)中復(fù)制的RNA病毒，可以將gRNAs傳遞到轉(zhuǎn)基因的Cas9表達(dá)煙草中，以實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)的基因組編輯，甚至可以在兩個(gè)后代植株中被檢測(cè)到。而目前在植物中，基于DNA病毒的基因組編輯傳遞系統(tǒng)還未被發(fā)現(xiàn)。除此之外，其他學(xué)者也在雙子葉植物如擬南芥、煙草，以及單子葉植物高粱(Sorghumvulgare)中成功地表達(dá)了CRISPR/Cas9系統(tǒng)[63]。目前，CRISPR/Cas9系統(tǒng)不僅能夠在草本植物中進(jìn)行精確的基因編輯，同時(shí)也在木本植物中實(shí)現(xiàn)了基因組的編輯和靶位點(diǎn)的突變。Jia等[64]在木本植物甜橙中通過(guò)農(nóng)桿菌向甜橙中導(dǎo)入Cas9以及合成的sgRNA靶向CsPDS基因，成功使目標(biāo)位點(diǎn)CsPDS基因發(fā)生了突變。Fan等[65]在木本植物毛白楊中設(shè)計(jì)了4個(gè)引導(dǎo)RNA(gRNA)靶定毛白楊八氫番茄紅素脫氫酶基因8 (PtoPDS)的不同基因組位點(diǎn)。在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化之后，他們?cè)谵D(zhuǎn)基因楊樹(shù)中觀察到了明顯的白化表型。通過(guò)分析RNA引導(dǎo)的基因組編輯事件，59個(gè)PCR克隆中有30個(gè)是純合子突變體，有2個(gè)是雜合子突變體，這些目標(biāo)位點(diǎn)的突變效率估計(jì)是51.7%。這就表明，利用Cas9/sgRNA系統(tǒng)，也可以在木本植物中精確地編輯基因組序列，并有效地建立基因敲除突變體。

為了進(jìn)一步研究CRISPR/Cas9系統(tǒng)在植物基因功能研究中的穩(wěn)定性，Zhang等[59]通過(guò)2個(gè)水稻亞種(粳稻日本晴和秈稻Kasalath)測(cè)試CRISPR/Cas9系統(tǒng)誘導(dǎo)11個(gè)靶基因產(chǎn)生突變的效率、特點(diǎn)、遺傳性及特異性等。通過(guò)檢測(cè)T0代轉(zhuǎn)基因植株，發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9系統(tǒng)在所有11個(gè)靶基因位點(diǎn)都誘導(dǎo)產(chǎn)生了突變，突變效率高達(dá)66.7%，且超過(guò)一半(6/11)的靶基因位點(diǎn)在T0代獲得純合突變體；同時(shí)，CRISPR/Cas9誘導(dǎo)產(chǎn)生的基因突變通過(guò)經(jīng)典的孟德?tīng)柖蛇z傳到下一代，通過(guò)全基因組重測(cè)序并檢測(cè)與靶序列高度同源的序列，他們僅在只有一個(gè)堿基不同的潛在脫靶位點(diǎn)檢測(cè)到突變，這表明CRISPR/Cas9系統(tǒng)在水稻中有很高的特異性。該項(xiàng)研究為CRISPR/Cas9系統(tǒng)在水稻中的穩(wěn)定應(yīng)用及進(jìn)一步應(yīng)用該技術(shù)提高水稻的產(chǎn)量、抗性及品質(zhì)等提供了理論基礎(chǔ)。

最近幾年，許多研究者還對(duì)CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行了升級(jí)改造，如：Lozano-Juste等[67]發(fā)現(xiàn)Cas9蛋白的D10A突變體CasNickase可切割DNA單鏈，其在成對(duì)的gRNAs輔助下可以實(shí)現(xiàn)DNA雙鏈斷裂，從而在保證原有系統(tǒng)靶向率的基礎(chǔ)上，顯著降低了脫靶率。此外，Qi等[68]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)缺失核酸內(nèi)切酶的Cas9與sgRNA共表達(dá)時(shí)，會(huì)產(chǎn)生一種新的DNA識(shí)別復(fù)合體，能特異性地干擾轉(zhuǎn)錄的延伸、RNA聚合酶的結(jié)合或轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，被稱為CRISPR干擾(CRISPRi)系統(tǒng)。這一系統(tǒng)能有效抑制大腸桿菌中靶向基因的表達(dá)，并且不會(huì)出現(xiàn)脫靶效應(yīng)。而且利用CRISPRi還可以同時(shí)抑制多個(gè)靶基因。另外，不同于原有的基因敲除技術(shù)，CRISPRi技術(shù)的效應(yīng)是可逆的。因此，CRISPRi的序列特殊靶向平臺(tái)在大范圍的宿主細(xì)胞中作為一種綜合調(diào)控基因表達(dá)的方法有很好的應(yīng)用前景。

隨著CRISPR/Cas9系統(tǒng)在基因組編輯技術(shù)上的開(kāi)發(fā)和完善，該系統(tǒng)正在被逐步應(yīng)用到對(duì)植物病毒基因組進(jìn)行高效靶向修飾的研究中。目前已有研究證明CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)植物DNA病毒存在抑制作用[69]。Ji等[70]通過(guò)在擬南芥和煙草中表達(dá)Cas9/sgRNA，驗(yàn)證了其對(duì)甜菜曲頂病毒(單鏈DNA病毒)的抑制作用，并發(fā)現(xiàn)在sgRNA的引導(dǎo)下，Cas9能夠引起植物病毒多個(gè)關(guān)鍵功能區(qū)(如IR區(qū))核苷酸序列的刪減或突變，而這種作用對(duì)菜豆黃矮病毒(單鏈DNA病毒)同樣有效[71]，體現(xiàn)了該系統(tǒng)對(duì)植物DNA病毒的作用能力具有普遍適用性。

雖然近幾年來(lái)CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為一種精確改寫基因組的便捷工具受到了很多學(xué)者的青睞(表1)，但是， 對(duì)于難以轉(zhuǎn)化的植物而言， 有效利用CRISPR/Cas9技術(shù)進(jìn)行基因組編輯時(shí)存在著巨大挑戰(zhàn)。 最近，Zhang等[72]報(bào)道了一種無(wú)轉(zhuǎn)基因的CRISPR/Cas9基因組編輯方法，在小麥愈傷組織細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)CRISPR/Cas9的DNA或RNA，再用這些細(xì)胞再生出整個(gè)植株。結(jié)果顯示，以瞬時(shí)表達(dá)為基礎(chǔ)的基因組編輯系統(tǒng)高度有效，能夠產(chǎn)生無(wú)轉(zhuǎn)基因的、純合的小麥突變體。隨后，他們將該方法用于六倍體面包小麥和四倍體硬粒小麥中，產(chǎn)生的突變體沒(méi)有檢出任何轉(zhuǎn)基因成分。研究指出，這種方法可以應(yīng)用到其他植物中去，加快植物基因組工程研究的速度。

3 CRISPR/Cas9技術(shù)的發(fā)展前景

CRISPR/Cas9技術(shù)作為一種新興的基因編輯技術(shù)，與前期的鋅指核酸酶(ZFNs)和TALE核酸酶(TALENs)系統(tǒng)相比，有以下優(yōu)點(diǎn)：(1) 只要靶序列上含有NGG(PAM)，就可以對(duì)其前面的20 bp的序列進(jìn)行基因編輯，作用效率高；(2) 能夠同時(shí)作用于不同靶位點(diǎn)，成本低；(3) 由于Cas9的基因是相同的，不同的靶位點(diǎn)只需設(shè)計(jì)不同的sgRNA，所以載體構(gòu)建流程簡(jiǎn)便；(4) CRISPR/Cas系統(tǒng)還可以完成不能利用TALENs等技術(shù)編輯的基因的定點(diǎn)修飾。

當(dāng)然，CRISPR/Cas9技術(shù)在發(fā)展過(guò)程中也存在一些問(wèn)題，比如脫靶效應(yīng)和編輯位置的限制等。為了減少CRISPR/Cas9系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)，科學(xué)家們提出了以下一些策略[73]。(1) 通過(guò)全基因組同源性檢索選擇出具有最少潛在脫靶位點(diǎn)的導(dǎo)向序列，在這些選出的導(dǎo)向序列中，選擇脫靶錯(cuò)配集中在導(dǎo)向序列PAM近端的sgRNAs[74-75]。(2) 使用長(zhǎng)度較短的導(dǎo)向序列(17-19 nt)[76]。(3) 采用雙切口酶策略。使用一對(duì)位置靠近的sgRNAs，Cas9切割酶可以引入兩個(gè)靠近的單鏈切口，導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂。這種方法已在細(xì)胞系中被證實(shí)可以將脫靶活性降低50～1500倍，并在小鼠受精卵中實(shí)現(xiàn)基因敲除而不影響靶向切割效率[77-78]。(4) 采用dCas9-FokI策略。利用一對(duì)間距優(yōu)化和定位的sgRNAs，與Fok1核酸酶結(jié)構(gòu)域結(jié)合的dCas9可以形成二聚體，導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂，這與ZFN和TALEN的設(shè)計(jì)相似。利用這種策略可以大大提高基因編輯的特異性[79-80]。

總之，CRISPR/Cas9技術(shù)由于其諸多優(yōu)點(diǎn)，在短時(shí)間內(nèi)受到了全球眾多科學(xué)家的青睞，成為生物學(xué)領(lǐng)域重要的研究熱點(diǎn)之一，為基因的定點(diǎn)修飾和編輯開(kāi)辟了一條新的道路。我國(guó)是世界上旱、寒和鹽堿等災(zāi)害最為嚴(yán)重的國(guó)家之一，草類植物資源十分豐富。長(zhǎng)期生存于干旱、低溫、土壤貧瘠和鹽堿化等嚴(yán)酷環(huán)境下的野生植物在漫長(zhǎng)的進(jìn)化過(guò)程中，形成了獨(dú)特的逆境適應(yīng)機(jī)制，蘊(yùn)涵著豐富的抗逆基因資源，在優(yōu)良牧草和農(nóng)作物抗性遺傳改良方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。然而，由于這些野生植物生活周期長(zhǎng)、遺傳背景和生物學(xué)性狀十分復(fù)雜，很難利用傳統(tǒng)的基因突變技術(shù)對(duì)其功能基因展開(kāi)系統(tǒng)研究。因此，CRISPR/Cas9技術(shù)的發(fā)展無(wú)疑為研究野生草類植物抗逆基因的功能提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支持，從而為系統(tǒng)闡明這些植物的逆境響應(yīng)機(jī)制、并將其用于栽培作物的遺傳改良帶來(lái)了曙光。值得一提的是，目前在豆科牧草蒺藜苜蓿中利用CRISPR/Cas9技術(shù)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了基因功能的研究，這為其他牧草功能基因的研究奠定了良好的基礎(chǔ)[66]?？梢灶A(yù)見(jiàn)，隨著技術(shù)的不斷發(fā)展完善，CRISPR/Cas9系統(tǒng)及其相關(guān)的衍生技術(shù)將在植物關(guān)鍵功能基因的鑒定以及作物和優(yōu)良牧草分子設(shè)計(jì)育種等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，從而造福于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展和生態(tài)環(huán)境安全。

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CRISPR/Cas9: A gene targeting technology and its application in the study of plant genetic function

BAO Ai-Ke*, BAI Tian-Hui, ZHAO Tian-Xuan, SU Jia-Hao

StateKeyLaboratoryofGrasslandAgro-ecosystems,CollegeofPastoralAgricultureScienceandTechnology,LanzhouUniversity,Lanzhou730020,China

CRISPR/Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) was derived from the adaptive immune system of bacteria and archaea to resist attacks from invasive viruses and exogenous DNA. Comparing zinc finger nuclease (ZFN) and transcription activator-like effector nuclease (TALENs), the type II CRISPR/Cas9 system mediated by RNA breaks new ground for gene editing due to its efficiency, low cost and ease of operation for the study of genetic function. This review summarizes recent research and progress of the structure, mechanisms and application of CRISPR/Cas9 for the study of genetic function and crop breeding. We also investigate the potential future development of CRISPR/Cas9.

gene editing； CRISPR/Cas9 system； gene function； molecular breeding

10.11686/cyxb2016430

2016-11-14；改回日期：2017-02-14

國(guó)家自然科學(xué)基金(31670405，31372360)， 甘肅省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(144FKCA058)和蘭州大學(xué)中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金(lzujbky-2016-4)資助。

包愛(ài)科(1980-)，男，甘肅岷縣人，副教授。E-mail: baoaik@lzu.edu.cn

*通信作者Corresponding author. E-mail: baoaik@lzu.edu.cn

http://cyxb.lzu.edu.cn

包愛(ài)科, 白天惠, 趙天璇, 蘇家豪. CRISPR/Cas9系統(tǒng)：基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)及其在植物基因功能研究中的應(yīng)用. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2017, 26(7): 190-200.

BAO Ai-Ke, BAI Tian-Hui, ZHAO Tian-Xuan, SU Jia-Hao. CRISPR/Cas9: A gene targeting technology and its application in the study of plant genetic function. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(7): 190-200.