劉 乾, 劉 松, 徐衛(wèi)國(guó), 管思彬, 郭雪君

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院呼吸科, 上海 200092)

泛素特異性蛋白酶19對(duì)煙熏誘導(dǎo)慢性阻塞性肺疾病大鼠模型骨骼肌萎縮的作用及機(jī)制

劉 乾, 劉 松, 徐衛(wèi)國(guó), 管思彬, 郭雪君

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院呼吸科, 上海 200092)

目的 通過煙熏制備慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠模型, 研究泛素特異性蛋白酶-19(USP-19)在COPD相關(guān)骨骼肌萎縮中的作用及機(jī)制。方法 煙熏誘導(dǎo)大鼠COPD模型，觀察肺及骨骼肌組織的組織形態(tài)學(xué)變化，利用蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting)及實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT- PCR)觀察骨骼肌細(xì)胞內(nèi)USP-19、肌球蛋白重鏈(MHC)及絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)基因的表達(dá)情況。結(jié)果 煙熏建立的大鼠COPD模型, 大鼠肺組織呈肺氣腫改變, 煙熏12周時(shí), 每高倍鏡視野下肌纖維數(shù)量增多40%，間接提示骨骼肌發(fā)生萎縮; 骨骼肌細(xì)胞內(nèi)MHC表達(dá)明顯下調(diào)，與煙熏時(shí)間呈負(fù)相關(guān); 萎縮的骨骼肌細(xì)胞內(nèi)USP-19基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)均明顯上調(diào), 與煙熏時(shí)間呈正相關(guān)，與MHC表達(dá)呈負(fù)相關(guān); 萎縮的骨骼肌細(xì)胞內(nèi)MAPKs通路磷酸化水平明顯增強(qiáng) (P<0.05)。結(jié)論 USP-19基因參與COPD模型鼠骨骼肌萎縮的發(fā)生，起負(fù)性調(diào)節(jié)作用，此作用可能通過MAPKs通路實(shí)現(xiàn)。

煙熏; 泛素特異性蛋白酶-19(USP-19); 慢性阻塞性肺疾病(COPD); 骨骼肌萎縮;絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)

目前, 全球慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease, 以下簡(jiǎn)稱COPD)的發(fā)病率和死亡率正逐年增高, 吸煙是COPD發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素之一。除呼吸系統(tǒng)的癥狀及體征外, 營(yíng)養(yǎng)不良、體質(zhì)量下降以及骨骼肌萎縮等被視為較為重要的肺外表現(xiàn)。近年來研究表明, 骨骼肌的消耗與肌蛋白降解加速密切相關(guān)，其中由泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解途徑發(fā)揮了重要作用。目前已有研究多集中在泛素連接過程，對(duì)于去泛素化的研究還知之甚少。

本實(shí)驗(yàn)采用煙熏制備COPD大鼠模型，對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行了骨骼肌的病理形態(tài)學(xué)觀察，同時(shí)選取泛素特異性蛋白酶-19(USP-19)作為研究對(duì)象，分別檢測(cè)煙熏前后股四頭肌組織內(nèi)USP-19基因的表達(dá)。試圖通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來探討模型大鼠如何發(fā)生骨骼肌萎縮，以及USP-19參與骨骼肌細(xì)胞萎縮的發(fā)生過程，為今后臨床上USP-19基因用于治療骨骼肌萎縮提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 制備COPD大鼠模型與分組

SPF級(jí)15周齡雄性SD大鼠, 平均體質(zhì)量350 g,購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物責(zé)任公司[SCXK(滬)2007-0005]，飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[ SYXK(滬)2008-0052]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：隨機(jī)數(shù)字方法將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為對(duì)照組(6只)，煙熏4周模型組(6只)，煙熏8周模型組(6只)和煙熏12周模型組(6只)。使用烤煙型大前門香煙(購(gòu)自上海煙草集團(tuán)公司, 焦油量為11 mg), 模型組每日上午在自制有機(jī)玻璃箱(容積為240 L, 長(zhǎng)寬高分別為80 cm, 60 cm, 50 cm)內(nèi)被動(dòng)吸煙。每6只動(dòng)物一箱，每次同時(shí)燃燒6支香煙，每日4次，每次煙熏間隔時(shí)間為2 h。連續(xù)煙熏4周、8周和12周。對(duì)照組動(dòng)物正常吸入空氣。分別于實(shí)驗(yàn)4周、8周和12周稱量體質(zhì)量，用腹腔注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%戊巴比妥鈉處理動(dòng)物并取肺組織及股四頭肌(骨骼肌)。

1.2 大鼠營(yíng)養(yǎng)不良的判斷

COPD模型組大鼠體質(zhì)量降低大于預(yù)計(jì)值的10%，可判斷為營(yíng)養(yǎng)不良。預(yù)計(jì)值為同等條件下正常對(duì)照組同齡大鼠的平均體質(zhì)量。

1.3 病理組織學(xué)分析

將肺組織及股四頭肌于體積分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛內(nèi)固定24 h，石蠟包埋，行HE染色后于光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.4 大鼠各組織內(nèi)USP-19基因表達(dá)情況

取正常大鼠皮膚、大腦、肺臟、肝臟、心臟、股四頭肌、血管、脾臟, 提取各組織總RNA。

1.5 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT- PCR)

提取的總RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行RT- PCR。循環(huán)條件如下: 預(yù)變性：95℃ 30 s; PCR反應(yīng)：95℃5 s, 60℃ 34 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。2-△△Ct法進(jìn)行相對(duì)定量分析, 公式: ΔCt = Cttarget-CtGAPDH; ΔΔCt = Δ Ct (CS) -Δ Ct (CTRL); 基因表達(dá)水平= 2-ΔΔCt。引物序列:

GAPDH上游: 5'-AAG GTC GGA GTC AAG GGA TTT-3'

GAPDH下游: 5'-AGA TGA TGA CCC TTT TGG CTC-3'

USP-19上游: 5'-GGC ACA AGA TGA GGA ACG A-3'

USP-19下游: 5'-CAG ATA AAG GAA CGG GTC AA-3'

MHC上游: 5'-GCG GAA AGA AAG GTG GCA AGA-3'

MHC下游: 5'-TGG GAA TGA GGC ATC GGA CAA-3'

MyoG上游: 5'-GCG GAA AGA AAG GTG GCA AGA-3'

MyoG下游: 5'-TGG GAA TGA GGC ATC GGA CAA-3'

1.6 Western blotting

提取細(xì)胞總蛋白, 利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)進(jìn)行變性電泳, 轉(zhuǎn)膜, 一抗孵育過夜后二抗孵育2 h; 用ChemiDoc XRS+ Systems遠(yuǎn)紅外成像系統(tǒng)掃描結(jié)果, 并通過Image Lab 2.0軟件以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行分析, 分別進(jìn)行三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法

RT- PCR、Western blotting結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì), 數(shù)值以表示，采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行方差分析(ANOVA)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠的一般情況

建模早期(染毒4周)模型組大鼠在染毒箱中吸煙時(shí)比較安靜，驅(qū)散大鼠聚堆時(shí)，部分大鼠有輕度喘息，停止吸煙約半小時(shí)后飲食與活動(dòng)恢復(fù)正常，與正常對(duì)照組無明顯區(qū)別。繼續(xù)煙熏，部分大鼠在吸煙以外的時(shí)間出現(xiàn)輕度喘息，活動(dòng)相對(duì)減少, 皮毛黃澀, 行動(dòng)遲鈍, 攝食、飲水減少。正常對(duì)照組大鼠飲食正常, 活動(dòng)靈敏, 皮毛清潔有光澤。

2.2 COPD大鼠模型肺組織的病理改變

對(duì)照組大鼠氣道上皮結(jié)構(gòu)完整，肺泡結(jié)構(gòu)正常(圖1A); 煙熏組大鼠細(xì)支氣管狹窄變形，管腔內(nèi)有炎癥細(xì)胞及脫落的上皮細(xì)胞; 黏膜下及細(xì)支氣管周圍可見以淋巴細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn); 肺泡壁增厚，有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，可見纖維細(xì)胞增生，部分肺泡壁破裂，相鄰肺泡融合形成肺大泡; 具有慢性細(xì)支氣管炎及肺氣腫的病理改變(圖1B)。

圖1 大鼠肺臟組織學(xué)形態(tài) (HE×100)Figure 1 Histopathological observation on lung of rat (HE×100)

2.3 大鼠體質(zhì)量變化

造模前模型組和對(duì)照組大鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。隨后煙熏組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)速度下降。煙熏8周時(shí)模型組大鼠體質(zhì)量明顯低于對(duì)照組, 但尚未達(dá)到營(yíng)養(yǎng)不良的標(biāo)準(zhǔn); 煙熏12周時(shí)模型組大鼠體質(zhì)量明顯低于對(duì)照組(P<0.01), 且體質(zhì)量下降已超過預(yù)計(jì)值的10%, 出現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)不良改變(表1)。

2.4 COPD模型大鼠骨骼肌組織形態(tài)變化

大體觀察見對(duì)照組大鼠股四頭肌組織飽滿、有光澤、彈性佳, 顯微鏡下見肌纖維排列緊密, 細(xì)胞核排列整齊，間質(zhì)內(nèi)有少量纖維組織(圖2A)。而煙熏大鼠骨骼肌組織暗澀、綿軟, 顯微鏡下觀察見肌纖維橫截面積較正常對(duì)照組減小，間質(zhì)內(nèi)纖維組織增多，血管組織增生及部分毛細(xì)血管擴(kuò)張充血(圖2B)。高倍鏡下每個(gè)視野煙熏大鼠肌纖維數(shù)量(362.0±17.7個(gè))較正常對(duì)照組(257.0±15.1個(gè))明顯增多，間接反應(yīng)出肌纖維發(fā)生萎縮。

2.5 大鼠各組織內(nèi)USP-19基因表達(dá)情況

各組織內(nèi)均有USP-19基因表達(dá)，心肌組織骨骼肌組織內(nèi)表達(dá)較高(圖3)。

2.6 大鼠骨骼肌內(nèi)MHC及USP-19基因表達(dá)

與對(duì)照組相比, 8周及12周的煙熏大鼠骨骼肌組織內(nèi)USP-19 mRNA和蛋白表達(dá)均有所上調(diào)(P<0.05),且與煙熏持續(xù)時(shí)間呈正相關(guān), 煙熏4周后USP-19表達(dá)雖上調(diào), 但與對(duì)照組相比差異不明顯; 4周、8周及12周煙熏后大鼠股四頭肌組織內(nèi)MHC mRNA和蛋白表達(dá)均下調(diào)(P<0.05), 且與煙熏時(shí)間呈負(fù)相關(guān)與體質(zhì)量下降呈正相關(guān)。提示煙熏引起骨骼肌萎縮是體質(zhì)量下降、營(yíng)養(yǎng)不良的原因之一; USP-19蛋白在骨骼肌萎縮過程中可能起到負(fù)性調(diào)節(jié)作用(圖4)。

2.7 COPD大鼠模型骨骼肌內(nèi)MAPKs活性的變化

總ERK和p38水平未發(fā)生明顯改變，煙熏組大鼠骨骼肌組織內(nèi)磷酸化ERK和p38水平明顯升高, 表明細(xì)胞內(nèi)ERK和p38信號(hào)通路被激活(圖5)。

表1 大鼠體質(zhì)量 g

圖2 大鼠股四頭肌組織學(xué)形態(tài) (HE×100)Figure 2 Histopathological features of rats quadriceps femoris (HE×100)

圖3 USP-19在組織內(nèi)的表達(dá)Figure 3 USP-19 expression pattern in normal tissues

圖4 大鼠骨骼肌組織內(nèi)MHC和USP-19基因的表達(dá)變化Figure 4 MHC and USP-19 gene expression levels

圖5 大鼠骨骼肌組織內(nèi)MAPKs通路表達(dá)情況Figure 5 Cigarette smoke affected MAPKs signaling pathways activities in skeletal muscle

3 討論

近年來, COPD的發(fā)病率和病死率逐年增加，COPD可引起廣泛的肺外損傷，已知泛素-蛋白酶體系參與骨骼肌萎縮的過程，這一體系是由多種泛素化酶及去泛素化酶構(gòu)成，目前研究多集中在泛素化過程，對(duì)于去泛素化酶的作用及機(jī)制還知之甚少[1]。

本文實(shí)驗(yàn)證實(shí)，通過12周的煙熏可使大鼠肺組織產(chǎn)生肺氣腫改變, 且8周及12周的煙熏暴露可誘發(fā)顯著的體質(zhì)量減輕及肌肉體積減少。Lee等[2]研究表明, 16周的持續(xù)煙熏可導(dǎo)致大鼠肺實(shí)質(zhì)損傷,氣腫形成及體質(zhì)量減輕，與本文結(jié)果相似。實(shí)驗(yàn)顯示，在核酸及蛋白質(zhì)水平，骨骼肌組織內(nèi)的MHC發(fā)生明顯減少，表明骨骼肌組織發(fā)生萎縮，煙熏引起骨骼肌萎縮的因素可能包括缺氧，高碳酸血癥, 營(yíng)養(yǎng)耗竭, 全身炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激[3]。

骨骼肌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)多種去泛素化酶，其中部分在骨骼肌內(nèi)特異性表達(dá)[4]。Urso等[5]研究制動(dòng)48 h后人骨骼肌細(xì)胞內(nèi)基因的表達(dá),表明泛素特異性蛋白酶-6(USP-6)mRNA水平明顯升高; Radom-Aizik等[6]對(duì)COPD患者進(jìn)行12周的耐力訓(xùn)練后檢測(cè)骨骼肌的基因表達(dá)，表明泛素特異性蛋白酶-15(USP-15)表達(dá)較未參加訓(xùn)練者明顯升高; Bosch-Comas等[7]研究表明，USP-25表達(dá)增強(qiáng)可以抑制肌球蛋白結(jié)合蛋白C1的降解，從而影響肌肉的分化和生長(zhǎng)。本文作者研究首次表明, 煙熏可刺激萎縮的骨骼肌組織內(nèi)USP-19基因的表達(dá)。USP-19的表達(dá)與體質(zhì)量，MHC水平呈負(fù)相關(guān), 且與煙熏暴露時(shí)間呈正相關(guān)。這些結(jié)果提示，USP-19基因?yàn)楣趋兰》纸獯x中的負(fù)性調(diào)節(jié)因子。Combaret等[8]研究表明，惡性腫瘤及長(zhǎng)期使用糖皮質(zhì)激素可誘導(dǎo)大鼠發(fā)生骨骼肌萎縮, 萎縮的骨骼肌細(xì)胞內(nèi)USP-19基因表達(dá)明顯上調(diào); Bedard等[9]研究表明，USP-19基因敲除的小鼠在糖皮質(zhì)激素化過程中，較對(duì)照組不易發(fā)生骨骼肌萎縮。這些結(jié)果與本文結(jié)果一致。

本實(shí)驗(yàn)中煙熏12周后，骨骼肌細(xì)胞內(nèi)2條主要的MAPKs信號(hào)傳導(dǎo)通路被激活，分別為p38及ERK通路。這與已有的多項(xiàng)研究結(jié)果相似。如Lecker等[10]證實(shí)USP-14在骨骼肌萎縮過程中起負(fù)向調(diào)節(jié)作用，而這一作用可能通過刺激細(xì)胞內(nèi)ERK磷酸化水平而實(shí)現(xiàn); Lee等[2]也證實(shí)氧自由基，腫瘤壞死因子a(TNF-a)所誘導(dǎo)的肌纖維的降解機(jī)制與p38 MAPK有關(guān)，p38的磷酸化水平升高有利于骨骼肌細(xì)胞萎縮和蛋白質(zhì)降解。Penna等[11]研究證實(shí)，惡性腫瘤誘發(fā)的惡病質(zhì)病程中，大鼠的骨骼肌組織發(fā)生明顯萎縮，萎縮肌肉內(nèi)ERK磷酸化水平明顯升高; Koistinen等[12]研究表明，2型糖尿病模型大鼠的萎縮骨骼肌組織內(nèi)p38MAPK通路磷酸化水平明顯上調(diào)。這些證據(jù)均提示MAPKs通路參與骨骼肌萎縮的發(fā)生。

總之，本研究初步證實(shí)USP-19作為一個(gè)負(fù)性調(diào)節(jié)基因，參與了COPD大鼠骨骼肌萎縮的過程。欲證實(shí)USP-19基因是否通過MAPKs通路參與骨骼肌細(xì)胞的降解，需通過體外實(shí)驗(yàn)，利用p38及ERK抑制劑及沉默RNA技術(shù)加以論證。本文研究結(jié)果將有助于對(duì)COPD患者骨骼肌功能障礙/骨骼肌萎縮的發(fā)生機(jī)制的探索，有助于臨床早期發(fā)現(xiàn)并避免其高危因素、預(yù)防萎縮的發(fā)生。

[1] Wing SS. Deubiquitinases in skeletal muscle atrophy[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2013, 45(10):2130-2135.

[2] Lee JH, Lee DS, Kim EK,et al. Simvastatin inhibits cigarette smoking-induced emphysema and pulmonaryhypertension in rat lungs[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2005, 172(8):987-993.

[3] Man WD, Kemp P, Moxham J, et al. Skeletal muscle dysfunctionin COPD: Clinical and laboratory observations [J]. Clin Sci (Lond), 2009, 117(8):251-264.

[4] Quesada V, Díaz-Perales A, Gutiérrez-Fernández A, et al. Cloning and analysis of 22 novel human ubiquitin-specific proteases[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2004 , 314(1): 54-62.

[5] Urso ML, Scrimgeour AG, Chen YW, et al. Analysis of human skeletal muscle after 48h immobilization reveals alterations in mRNAand protein for extracellular matrix components [J]. J Appl Physiol, 2006, 101(4):1136-1148.

[6] Radom-Aizik S, Kaminski N, Hayek S, et al. Effects of exercise training on quadriceps muscle gene expression in chronic obstructive pulmonary disease[J]. J Appl Physiol, 2007, 102(5):1976-1984.

[7] Bosch-Comas A, Lindsten K, Gonzalez-Duarte R, et al. The ubiquitin-specific protease USP25 interacts with three sarcomeric proteins[J]. Cell Mol Life Sci, 2006, 63(6):723-734.

[8] Combaret L, Adegoke OA, Bedard N, et al.USP19 is a ubiquitin-specific protease regulated in rat skeletal muscleduringcatabolic states[J]. Am J Physiol Endocrinol Metab, 2005, 288(4):693-700.

[9] Bédard N, Jammoul S, Moore T, et al. Inactivation of the ubiquitin-specific protease 19 deubiquitinating enzyme protects againstmuscle wasting[J]. FASEB J, 2015, 29(9): 3889-3898.

[10] Liu N, Kong T, Chen X, et al. Ubiquitin-specific protease 14 regulates LPS-induced inflammation by increasing ERK1/2 phosphorylation and NF-kB activation[J]. Mol Cell Biochem, 2017. doi: 10.1007/s11010-017-2978-0. [Epub ahead of print]

[11] Penna F, Costamagna D, Fanzani A, et al. Muscle wasting and impaired myogenesis in tumor bearing mice are preventedby ERK inhibition[J]. PLoS One, 2010, 5:e13640.

[12] Koistinen HA, Chibalin AV, Zierath JR. Aberrant p38 mitogen-activatedprotein kinase signaling in skeletal muscle from Type 2 diabeticpatients[J]. Diabetologia, 2003, 46(10): 1324-1328.

Effect and Mechanism of Ubiquitin-specific Peptidase 19 on Muscle Atrophy of Chronic Obstructive Pulmonary Disease Induced by Cigarette Smoke Exposure in Rats

LIU Qian, LIU Song, XU Wei-guo, GUAN Si-bin, GUO Xue-jun
(Department of Respiration Medicine,Xinhua Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200092)

ObjectiveTo investigate the effects of ubiquitin-specific peptidase 19 (USP-19) on rats bearing chronic obstructive pulmonary disease (COPD) induced by cigarette smoke (CS) exposure .MethodsRats exposed to chronic CS was chosen for the study. For histological examination, lungs and quadriceps femoris muscle were stained with hematozylin and eosin. Total RNA and protein were extracted for Real-time PCR and Western blot analysis to assess the MHC, USP-19 and MAPKs gene expression .ResultsTwelve weeks CS exposure produced lung lesions that morphologically resembled human emphysema, leading to the enlargement of alveolar ducts. Skeletal cell numbers per high-power (HP) lens increased after 12 weeks by 40% in comparison with the control group, suggesting muscle wasting. Chronic CS exposure decreased the mRNA level of MHC. MHC protein content in the quadriceps femoris muscle was decreased in the 8- and 12-week groups. CS significantly stimulated phosphorylation of ERK1/2, p38 without altering the total ERK1/2, p38 content .ConclusionsCigarette smoke-induced skeletal muscle atrophy is associated with up-regulation of USP-19, which via MAPKs probably.

Cigarette smoke exposure; Ubiquitin-specific peptidase 19 (USP-19); Chronic obstructive pulmonary disease (COPD); Muscle atrophy; Mitogen-activated protein kinases (MAPKs)

Q95-33

A

1674-5817(2017)03-0185-06

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.03.003

2017-03-20

上海市衛(wèi)生局青年科研項(xiàng)目(編號(hào): 20134Y015)和國(guó)家青年科學(xué)基金項(xiàng)目(81400026)

劉 乾(1980-), 女, 醫(yī)學(xué)博士, 呼吸科主治醫(yī)師, 從事呼吸系統(tǒng)疾病研究。

E-mail: liuqian_1980@hotmail.com

郭雪君(1964-), 男, 醫(yī)學(xué)博士, 呼吸科主任醫(yī)師, 從事呼吸系統(tǒng)疾病研究。E-mail: snowgen@126.com