楊漢波 張 蕊 王幫順 徐肇友 周志春

(1.中國林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所 浙江省林木育種技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 杭州 311400；2.浙江省龍泉市林業(yè)科學(xué)研究院 龍泉 323700)

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基于SSR標(biāo)記的木荷核心種質(zhì)構(gòu)建*

楊漢波1張 蕊1王幫順2徐肇友2周志春1

(1.中國林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所 浙江省林木育種技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 杭州 311400；2.浙江省龍泉市林業(yè)科學(xué)研究院 龍泉 323700)

【目的】 通過對比分析與評(píng)價(jià)以確定木荷核心種質(zhì)構(gòu)建的最適取樣策略和比例，并構(gòu)建木荷核心種質(zhì)； 在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步建立核心種質(zhì)分子身份信息，為木荷種質(zhì)資源的深入研究和加強(qiáng)利用、發(fā)掘優(yōu)異基因資源提供理論依據(jù)和核心材料，同時(shí)也可為其他多年生木本植物核心種質(zhì)的構(gòu)建提供參考?！痉椒ā?利用13對SSR引物，以來自7個(gè)省(市)29個(gè)地區(qū)的754份木荷種質(zhì)資源為材料，利用M策略(M)、隨機(jī)取樣法(R)、遺傳多樣性最大化法(SAGD)和等位基因最大化法(SANA)分別構(gòu)建核心種質(zhì)。采用等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)和Shannon’s信息指數(shù)(I)等遺傳多樣性指標(biāo)進(jìn)行比較分析來確定最適合的構(gòu)建方法?！窘Y(jié)果】 13對SSR引物共檢測到128個(gè)等位基因(Na)，平均有效等位基因數(shù)(Ne)為3.47，Shannon’s信息指數(shù)(I)為1.39，表明木荷種質(zhì)資源具有豐富的遺傳多樣性。SANA、SAGD和M策略構(gòu)建的核心種質(zhì)均優(yōu)于R策略。SANA和SAGD法抽取的核心種質(zhì)對原有種質(zhì)均具有較好的代表性，但等位基因保留率較低。M策略構(gòu)建的核心種質(zhì)等位基因(Na)保留比例明顯高于其他3種策略所構(gòu)建的核心種質(zhì)。根據(jù)遺傳多樣性參數(shù)綜合考慮，同時(shí)考慮抽樣數(shù)量，M策略構(gòu)建的核心種質(zhì)能以最小的取樣量、最大程度地保留原有種質(zhì)的遺傳多樣性，為最優(yōu)的取樣策略。采用主坐標(biāo)分析法顯示，M策略構(gòu)建的核心種質(zhì)能夠較全面地代表木荷種質(zhì)資源的遺傳多樣性，利用該策略得到的115份木荷核心種質(zhì)，保留了原有種質(zhì)15.3%的種質(zhì)材料，等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)和Shannon’s信息指數(shù)(I)的保留率分別達(dá)到93.8%，115.6%和109.9%。依據(jù)13對SSR引物的擴(kuò)增數(shù)據(jù)，經(jīng)過多態(tài)性譜帶的有序編碼轉(zhuǎn)換，構(gòu)建了115份木荷核心種質(zhì)的特異分子身份信息，置信概率達(dá)到99.99%，具有有效性和唯一性?！窘Y(jié)論】 M策略是較適宜的構(gòu)建木荷核心種質(zhì)的方法，構(gòu)建的115份核心種質(zhì)能最大程度代表木荷種質(zhì)資源的遺傳多樣性，同時(shí)，本研究所采用的方法對其他多年生木本植物核心種質(zhì)的構(gòu)建具有重要的參考價(jià)值。

木荷； SSR標(biāo)記； 核心種質(zhì)； 分子身份信息

植物種質(zhì)資源是育種工作的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，是決定育種效果的關(guān)鍵，世界各國都非常注重對種質(zhì)資源的調(diào)查、搜集、評(píng)價(jià)、保存和利用(Escribanoetal., 2008)。然而，大量的種質(zhì)資源在為植物遺傳改良和品種選育提供了豐富遺傳基礎(chǔ)的同時(shí)，也給種質(zhì)資源的搜集保存及研究利用帶來了困難(Escribanoetal., 2008)。針對這一問題，F(xiàn)rankel等(1984)首次提出核心種質(zhì)的概念，Brown(1989)將其進(jìn)一步發(fā)展，核心種質(zhì)是指以最小數(shù)量的種質(zhì)資源和遺傳重復(fù)最大程度地代表整個(gè)種質(zhì)資源的遺傳多樣性，是資源深入研究、優(yōu)良基因挖掘和新技術(shù)應(yīng)用的核心子集，能夠提高種質(zhì)資源的有效利用率。核心種質(zhì)的提出為種質(zhì)資源的有效保護(hù)與深入研究、利用開辟了新的途徑，發(fā)達(dá)國家和農(nóng)業(yè)研究中心十分注重對核心種質(zhì)的研究，使其逐漸成為國際種質(zhì)資源研究的熱點(diǎn)(Belajetal., 2012; 劉娟等, 2015)。利用分子標(biāo)記的方法，Miyamoto等(2015)從3 203份日本柳杉(Cryptomeriajaponica)優(yōu)樹中選出了349份核心種質(zhì)； Belaj等(2012)建立了總體比例為10%的橄欖(Canariumalbum)核心種質(zhì)； 王麗俠等(2014)建立了數(shù)目為157份的扁豆(Lablabpurpureus)核心種質(zhì)。我國從1994年開始提出構(gòu)建核心種質(zhì)，現(xiàn)今已經(jīng)在多種農(nóng)作物上建立了核心種質(zhì)，如水稻(Oryzasativa)(Zhangetal., 2011)、小麥(Triticumaestivum)(董玉琛等， 2003)、苧麻(Boehmerianivea)(欒明寶等, 2010)等。而林木核心種質(zhì)構(gòu)建工作相對滯后，僅對杏(Armeniacavulgaris)(劉娟等, 2015)、新疆野蘋果(Malussieversii)(張春雨等, 2009)、白樺(Betulaplatyphylla)(魏志剛等, 2009)、歐洲黑楊(Populusnigra)(曾憲君等, 2014)等少數(shù)樹種進(jìn)行了初步研究。林木等多年生木本植物樹體龐大，且資源保存通常以田間保存為主，占地面積大，管理費(fèi)用高，因此，建立林木核心種質(zhì)是十分必要和迫切的。

木荷(Schimasuperba)為山茶科(Theaceae)木荷屬(Schima)常綠大喬木，是我國東部濕潤亞熱帶常綠闊葉林的主要建群樹種，天然散布于東經(jīng)105°以東、北緯31°以南的廣闊地區(qū)，是我國南方各省區(qū)的珍貴優(yōu)質(zhì)闊葉用材和當(dāng)家生物防火樹種，在商品用材林和生態(tài)防火林建設(shè)中占有重要地位(倪健, 1996; 張萍等, 2004; 張蕊等, 2013)。項(xiàng)目組自2001年開始，先后開展了木荷育種與培育技術(shù)的研究，在木荷主產(chǎn)區(qū)選擇優(yōu)樹1 000余株，已成功嫁接保存了754個(gè)優(yōu)樹無性系，為高抗優(yōu)質(zhì)新品種選育和種子園營建等木荷遺傳研究和育種工作提供了大批量的優(yōu)質(zhì)材料。如何從豐富的木荷種質(zhì)資源中快速、準(zhǔn)確地鑒定出木荷育種上迫切需要的優(yōu)異基因，是木荷育種工作所急需解決的一個(gè)重大問題。本研究在項(xiàng)目組前期研究 (張萍等, 2006; 辛娜娜等, 2014; 2015； 楊漢波等， 2016) 的基礎(chǔ)上，借鑒其他多年生木本植物核心種質(zhì)構(gòu)建的方法，利用SSR分子標(biāo)記，以754份木荷種質(zhì)資源為材料，通過對比分析與評(píng)價(jià)不同構(gòu)建策略和取樣比例構(gòu)建的核心種質(zhì)，確定木荷核心種質(zhì)構(gòu)建的最適取樣策略和比例，并構(gòu)建木荷核心種質(zhì)； 在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步建立核心種質(zhì)分子身份信息，為木荷種質(zhì)資源的深入研究和加強(qiáng)利用、發(fā)掘優(yōu)異基因資源提供理論依據(jù)和核心材料，同時(shí)也可為其他多年生木本植物核心種質(zhì)的構(gòu)建提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試材取自浙江省龍泉市林業(yè)科學(xué)研究院上圩基地的木荷基因庫(28°03′N, 119°06′E，面積為6.7 hm2，海拔200～300 m，相對濕度79%，年均降雨量1 664.8～1 706.2 mm)。2010年至今，在浙江、福建、江西等木荷主產(chǎn)區(qū)選擇優(yōu)樹1 000余株，嫁接保存754株。選優(yōu)林分要求林齡20年、面積1.0 hm2以上，以木荷為主的優(yōu)良天然林或起源明確的人工林； 優(yōu)樹選擇條件為樹體高大，干形通直圓滿，生長量明顯高于附近3～5株同齡優(yōu)勢木等。以當(dāng)?shù)?～2年生木荷容器苗為砧木，在3—4月份選用帶有休眠芽的穗條，采用切接的方法嫁接優(yōu)樹無性系，在圃地集中培育2年生容器嫁接苗。然后根據(jù)林木種質(zhì)資源異地保存庫營建要求(株行距為4 m×4 m)將無性系嫁接苗移植至基因庫相應(yīng)位置上。取樣種質(zhì)為浙江(109份)、福建(350份)、江西(168份)、湖南(75份)、廣東(32份)、貴州(12份)和重慶(8份)7個(gè)省(市)的754份木荷種質(zhì)資源。2015年6月，對來自上述7個(gè)省(市)資源群體全部單株采集其頂端新發(fā)枝條上的新鮮嫩葉，將其放入液氮中帶回實(shí)驗(yàn)室，置于-80 ℃冰箱中保存。

1.2 基因組DNA提取及SSR擴(kuò)增

采用植物DNA快速提取試劑盒提取木荷基因組DNA，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度和完整性，NanoDrop-2000超微量分光光度計(jì)測定260 mm/280 mm處的光吸收值來檢測其濃度，最后稀釋到20 ng·μL-1，-20 ℃保存?zhèn)溆?。本研究選用13對條帶清晰、多態(tài)性強(qiáng)的SSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增(Niuetal., 2012; 辛娜娜等, 2015)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)在TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice(TaKaRa)上進(jìn)行。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系25 μL： 含12.5 μL 2×Taq Plus Master Mix,1 μL 10 μmol·L-1上下游引物和2.5 μL基因組DNA。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?95 ℃ 5 min； 94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s(35個(gè)循環(huán))； 72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物在Qsep100TM全自動(dòng)核酸蛋白自動(dòng)分析系統(tǒng)上進(jìn)行電泳分離檢測，Qsep100TM能以1～4 bp的分辨率高效區(qū)分20～20 000 bp DNA片段 (http://www.sciencemag.org/content/348/6241/1383.1.full)。

1.3 核心種質(zhì)構(gòu)建

Frankel等(1984)和Brown(1989)提出可以利用地理來源和表型數(shù)據(jù)構(gòu)建核心種質(zhì)。先按照地理來源分組、后取樣的策略也已被許多研究證明是合理有效的(李自超等， 1999； 崔艷華等， 2003； 趙冰等， 2007)。因此，本研究先將754份木荷種質(zhì)資源按地理來源分為7組，再按照下述方法分別對各組種質(zhì)進(jìn)行抽樣分別構(gòu)建核心種質(zhì)，最后將各組抽取的核心種質(zhì)進(jìn)行合并構(gòu)成全部木荷種質(zhì)資源的核心種質(zhì)。

1)M策略(Maximization strategy, M strategy):利用一系列遺傳標(biāo)記的位點(diǎn)來鑒定同時(shí)具有低冗余和高豐度等位變異的種質(zhì)材料，并確定如何在組內(nèi)合理地分配這些種質(zhì)材料，分配原則主要建立在一種假設(shè)上，即最大化核心種質(zhì)中的標(biāo)記位點(diǎn)，就相當(dāng)于最大化目標(biāo)位點(diǎn)(Schoenetal., 1995)。通過Core Finder軟件(Ciprianietal., 2010)以等位基因數(shù)最大化為原則對SSR數(shù)據(jù)進(jìn)行分析抽取核心種質(zhì)。

2)隨機(jī)取樣法(Random sampling, R):總體取樣比例設(shè)定為10%，15%， 20%，25%和30%，根據(jù)隨機(jī)取樣策略構(gòu)建核心種質(zhì)(張春雨等, 2009)。

3)采用PowerMarker version 3.25軟件(Liuetal., 2005)，選取的總體取樣比例同2)，根據(jù)模擬退火算法(simulated annealing algorithm, SA)以等位基因最大化(maximizing allelic richness, SANA)為標(biāo)準(zhǔn)構(gòu)建核心種質(zhì)。

4)采用PowerMarker version 3.25軟件(Liuetal., 2005)，選取的總體取樣比例同2)，根據(jù)模擬退火算法(simulated annealing algorithm, SA)以遺傳多樣性最大化(maximizing genetic diversity, SAGD) 為標(biāo)準(zhǔn)構(gòu)建核心種質(zhì)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

對SSR檢測結(jié)果進(jìn)行峰圖分析及等位基因的讀取，然后利用GenAlEx6.5軟件(Peakalletal., 2012)計(jì)算等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、期望雜合都(He)、觀測雜合度(Ho)及Shannon’s信息指數(shù)(I)，用這些指標(biāo)來評(píng)價(jià)核心種質(zhì)、原有種質(zhì)和保留種質(zhì)的遺傳多樣性，并通過t檢驗(yàn)對核心種質(zhì)與原有種質(zhì)各遺傳多樣性指標(biāo)進(jìn)行差異顯著性檢測(Escribanoetal., 2008)。同時(shí)運(yùn)用主坐標(biāo)分析法(PCoA)對構(gòu)建的核心種質(zhì)進(jìn)行確認(rèn)(Wangetal., 2007)。將毛細(xì)管電泳譜帶轉(zhuǎn)化為數(shù)字指紋圖譜并以此構(gòu)建木荷核心種質(zhì)的分子身份信息，依據(jù)指紋圖譜概率公式P=1/2n(n為等位基因的數(shù)目)計(jì)算其置信概率(唐源江等, 2015)。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR分子標(biāo)記遺傳多樣性

采用SSR標(biāo)記對754份木荷種質(zhì)資源的遺傳多樣性進(jìn)行分析(表1)，13對SSR引物共檢測到128個(gè)等位基因(Na)，有效等位基因數(shù)(Ne)為3.47，每對引物檢測到的等位基因數(shù)(Na)的變化范圍為4(ss01)～15(ss16)，平均為9.85。各引物的期望雜合度(He)變化范圍0.54(ss30)～0.83(ss32)，平均為0.68。Shannon’s信息指數(shù)(I)變化范圍0.91(ss01)～1.92(ss32)，平均為1.39。結(jié)果說明木荷種質(zhì)資源具有豐富的遺傳多樣性。

2.2 不同方法構(gòu)建的核心種質(zhì)遺傳多樣性指標(biāo)的比較

不同方法構(gòu)建核心種質(zhì)的遺傳多樣性指標(biāo)見表2。結(jié)果顯示，隨著取樣比例的增加，各級(jí)候選核心種質(zhì)等位基因數(shù)(Na)保留率呈逐漸上升的趨勢。各候選核心種質(zhì)有效等位基因數(shù)(Ne)保留率均在95%以上，其中M策略以15.3%取樣比例構(gòu)建的核心種質(zhì)Ne保留率最高，為115.6%，其次是SANA(10%)，為100.9%。Shannon’s信息指數(shù)(I)僅M策略構(gòu)建的候選核心種質(zhì)高于原有種質(zhì)，其余均低于原有種質(zhì)，但其保留率均在97%以上。SANA和R在10%、15%和20%抽樣比例下的核心種質(zhì)與原有種質(zhì)Nat檢驗(yàn)存在顯著差異，SAGD在10%和20%抽樣比例下的核心種質(zhì)與原有種質(zhì)Nat檢驗(yàn)也存在顯著差異。各候選種質(zhì)的Shannon’s信息指數(shù)(I)、有效等位基因數(shù)(Ne)、觀測雜合度(Ho)和期望雜合度(He)與原有種質(zhì)t檢驗(yàn)無顯著差異。從等位基因保留數(shù)目和比例看，M策略構(gòu)建的核心種質(zhì)等位基因保留比例為93.8%，明顯高于其他3種策略所構(gòu)建的核心種質(zhì)。根據(jù)這5個(gè)遺傳參數(shù)綜合考慮，同時(shí)考慮抽樣數(shù)量，選擇M策略抽取115份(15.3%)資源時(shí)，構(gòu)建的木荷核心種質(zhì)能夠以最小的種質(zhì)份數(shù)最大程度地代表整個(gè)木荷種質(zhì)資源的遺傳多樣性。利用M策略構(gòu)建木荷核心種質(zhì)中包含湖南15份、江西24份、福建27份、廣東13份、浙江21份、貴州9份及重慶6份共115份種質(zhì)材料。

采用基于位點(diǎn)優(yōu)先的M策略構(gòu)建的木荷核心種質(zhì)保留了原有種質(zhì)15.3%的材料，等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、Shannon’s信息指數(shù)(I)等遺傳多樣性指標(biāo)的保留率分別為93.8%，115.6%%，98.8%，104.7%和109.9%；t檢驗(yàn)結(jié)果表明，利用M策略構(gòu)建的木荷核心種質(zhì)和原有種質(zhì)的遺傳多樣性指數(shù)差異不顯著(表3)。這說明利用M策略構(gòu)建的核心種質(zhì)對原有種質(zhì)進(jìn)行了有選擇性的選取，剔除了冗余種質(zhì)后，能夠很好地體現(xiàn)原有木荷種質(zhì)資源的遺傳多樣性。由此認(rèn)為本文利用M策略構(gòu)建的木荷核心種質(zhì)在遺傳多樣性上能很好地代表原木荷種質(zhì)資源。同時(shí)，對核心種質(zhì)和保留種質(zhì)的遺傳多樣性指標(biāo)進(jìn)行比較分析(表3)，t檢驗(yàn)結(jié)果表明在概率0.05水平上，核心種質(zhì)的Ne、I和He均顯著高于保留種質(zhì)。因此，應(yīng)優(yōu)先考慮使用木荷核心種質(zhì)開展高效的木荷育種工作。采用主坐標(biāo)分析法(PCoA)對構(gòu)建的木荷核心種質(zhì)和整個(gè)木荷種質(zhì)資源進(jìn)行分析，以確定其代表性(圖1)，發(fā)現(xiàn)木荷核心種質(zhì)在整個(gè)木荷種質(zhì)資源的主坐標(biāo)圖內(nèi)均勻分布，表明采用M策略(Core Finder軟件)構(gòu)建的木荷核心種質(zhì)具有很好的代表性。

表1 木荷754份種質(zhì)資源遺傳多樣性參數(shù)①Tab. 1 The genetic diversity parameters ofSchima superba germplasm resources

①Na: 等位基因數(shù);Ne: 有效等位基因數(shù);I: Shannon’s信息指數(shù);Ho: 觀測雜合度;He: 期望雜合度。下同。Na: Number of different alleles;Ne: Number of effective alleles;I: Shannon’s information index;Ho: Observed heterozygosity;He: Expected heterozygosity. The same below.

2.4 核心種質(zhì)分子身份信息構(gòu)建

用13對SSR引物擴(kuò)增的全部128條多態(tài)性譜帶構(gòu)建了115份木荷核心種質(zhì)的分子身份信息(圖2)，其帶型全部相同的概率為2.9×10-39，置信概率達(dá)到99.99%。每份核心種質(zhì)材料都有唯一分子身份信息，可以比較容易地將115份木荷核心種質(zhì)材料相互區(qū)分鑒別出來。

表2 不同策略構(gòu)建的核心種質(zhì)遺傳多樣性指標(biāo)比較①Tab. 2 Comparisons of genetic diversity index of core collections constructed by different tactics

①M(fèi)： M策略; R： 隨機(jī)取樣法; SAGD： 遺傳多樣性最大化法; SANA： 等位基因最大化法。*表示在α=0.05水平下核心種質(zhì)與原有種質(zhì)各項(xiàng)指標(biāo)的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)的顯著性。M: Maximization strategy; R: Random sampling; SAGD: Simulated annealing algorithm maximizing the genetic diversity; SANA: Simulated annealing algorithm maximizing the number of alleles. * Significant at 0.05 probability of each index between core collection and original collection.

表3 M策略構(gòu)建的核心種質(zhì)、保留種質(zhì)和原有種質(zhì)遺傳多樣性對比①Tab. 3 Genetic diversity comparison and t-test between original collection, reserve collection and core collection constructed by M strategy

①括號(hào)內(nèi)為保留率。t1值表示核心種質(zhì)與原有種質(zhì)各遺傳參數(shù)t檢驗(yàn)值，t2表示核心種質(zhì)與保留種質(zhì)各遺傳參數(shù)t檢驗(yàn)值。*表示在0.05水平下核心種質(zhì)與保留種質(zhì)間存在顯著差異。The contents in the brackets are the percentage of reserve.t1means thetvalue of genetic diversity parameters between core collection and initial collection, andt2means thetvalue of genetic diversity parameters between core collection and reserve collection. * means significant difference at 0.05 probability between core collection and reserve collection.

圖1 M策略構(gòu)建的核心種質(zhì)與原有種質(zhì)的主坐標(biāo)Fig.1 Principal coordinates plots of core collection constructed by M strategy and initial collection

圖2 13個(gè)SSR標(biāo)記構(gòu)建的115份木荷核心種質(zhì)分子身份信息Fig.2 Molecular identity of 115 core collection set up by SSR markers

3 討論

目前構(gòu)建核心種質(zhì)主要基于形態(tài)標(biāo)記和分子標(biāo)記分析2類(王建成等, 2008)。對樹體高大的多年生林木而言，資源的搜集與保存較為困難，要得到可靠的表型數(shù)據(jù)需要較長的年限(王紅霞等, 2013)。分子標(biāo)記以DNA分子多態(tài)性為基礎(chǔ)，一般不具有生物功能活性，不會(huì)或極少受植物生長期和外界環(huán)境的影響，較形態(tài)標(biāo)記更適用于構(gòu)建核心種質(zhì)和進(jìn)行遺傳多樣性評(píng)價(jià)(劉新龍等, 2014)。SSR是共顯性標(biāo)記，提供的等位基因信息較其他分子標(biāo)記更為豐富，采用SSR數(shù)據(jù)構(gòu)建的核心種質(zhì)較其他標(biāo)記具有較大的優(yōu)勢(張君玉, 2012)。因此，本研究采用13對多態(tài)性SSR引物，采用4種不同的鑒別和篩選方法，有效地得到115份木荷核心種質(zhì)材料，具有重要的理論和實(shí)踐意義。核心種質(zhì)的構(gòu)建中樣本量的大小是衡量核心種質(zhì)是否有效的重要因子之一(楊美等, 2011)。由于物種的特性，核心種質(zhì)的取樣比例應(yīng)以所研究植物的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)而定(李自超等, 2003)。迄今為止，在國內(nèi)外所構(gòu)建的不同植物核心種質(zhì)其所占比例一般為原有種質(zhì)的5%～40%，大多數(shù)在5%～15%(Wangetal., 2007; Escribanoetal., 2008)。王萱等(2016)分析了180份銀杏(Ginkgobiloba)古樹遺傳多樣性，獲得了63份核心種質(zhì)，占原有種質(zhì)的35%。Liang等(2014)利用SSR標(biāo)記獲得了55份蘋果(Malusdomestica)核心種質(zhì)，占原有種質(zhì)的13.2%。Wang等(2014)利用EST-SSR標(biāo)記建立了占原有材料22.9%(22份種質(zhì))的荔枝(Litchichinensis)核心種質(zhì)。這些結(jié)果均表明取樣比例應(yīng)視種質(zhì)資源的數(shù)量和遺傳多樣性而定。M策略基于等位基因(Na)的最大化，同時(shí)兼顧遺傳多樣性，經(jīng)Core Finder軟件自動(dòng)生成合理的取樣比例，獲得的取樣比例最為科學(xué)、可靠(郭大龍等, 2012)。在本研究中，木荷種質(zhì)資源共有754份，通過對不同取樣比例構(gòu)建的核心種質(zhì)進(jìn)行比較分析，結(jié)果表明以15.3%取樣比例(M策略)構(gòu)建的木荷核心種質(zhì)能夠最大程度地代表整個(gè)木荷種質(zhì)資源的遺傳多樣性。

取樣策略是影響構(gòu)建的核心種質(zhì)是否有效的另一重要因子(劉娟等, 2015)。目前多數(shù)研究者采用分層分組和聚類的方法構(gòu)建核心種質(zhì)，但不同的分組和聚類方法構(gòu)建的核心種質(zhì)存在較大的差異(Wangetal., 2007; Ciprianietal., 2010)。因此，應(yīng)對取樣策略進(jìn)行優(yōu)化以獲得最具代表性的核心種質(zhì)。植物基因多樣性是決定其性狀的遺傳因子，而位點(diǎn)和等位基因頻率是種質(zhì)資源基因多樣性的基礎(chǔ)，構(gòu)建的核心種質(zhì)應(yīng)以最小的取樣比例最大限度地保留原有種質(zhì)的等位基因多樣性(劉娟等, 2015)。本研究中，基于等位基因和遺傳多樣性優(yōu)先的取樣策略(M、SANA和SAGD策略)構(gòu)建的木荷核心種質(zhì)其保留的等位基因數(shù)明顯多于隨機(jī)取樣策略(R策略)，遺傳多樣性指標(biāo)也均高于隨機(jī)取樣策略，與前人研究結(jié)果 (劉娟等, 2015) 基本一致。因此，基于等位基因和遺傳多樣性優(yōu)先的M、SANA和SAGD取樣策略構(gòu)建的木荷核心種質(zhì)優(yōu)于R取樣策略。M策略構(gòu)建的核心種質(zhì)以15.3%的取樣比例代表了原有種質(zhì)93.8%的等位基因多樣性，明顯優(yōu)于SANA和SAGD取樣策略，也顯著高于Frankel等(1984)提出的核心種質(zhì)應(yīng)以10%的取樣比例代表原有種質(zhì)70%以上的遺傳多樣性的標(biāo)準(zhǔn)。依據(jù)地理來源對種質(zhì)資源進(jìn)行分組取樣是取得高代表性核心種質(zhì)的一種較好的分組策略(Liuetal., 2005)。本研究中，首先根據(jù)地理來源對木荷種質(zhì)資源進(jìn)行分組取樣，在此基礎(chǔ)上通過4種不同取樣策略(M、R、SANA和SAGD)構(gòu)建木荷核心種質(zhì)，最后通過遺傳多樣性指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果表明先按來源地分組，再利用M策略(Core Finder軟件)分組取樣是構(gòu)建木荷核心種質(zhì)的最優(yōu)取樣策略，構(gòu)建的木荷核心種質(zhì)能有效代表整個(gè)木荷種質(zhì)資源的地理分布和遺傳多樣性，說明保證原有種質(zhì)不同地理來源種質(zhì)的相應(yīng)比例是獲得高遺傳多樣性代表性核心種質(zhì)的最好方法，也表明在核心種質(zhì)取樣時(shí)，應(yīng)盡量包含所有來源地的種質(zhì)資源。本研究最終以M策略得到115份木荷核心種質(zhì)，分別為廣東13份(40.6%)、湖南15份(20%)、貴州9份(75%)、江西24份(14.3%)、浙江21份(19.3%)、福建27份(7.7%)和重慶6份(75%)； 福建省的種質(zhì)資源最多，但抽取的核心種質(zhì)反而較少，這可能與該地區(qū)種質(zhì)資源純合度較高、親緣關(guān)系較近有關(guān)(明軍等, 2005)，也與李自超等(2003)認(rèn)為核心種質(zhì)的取樣數(shù)量應(yīng)視種質(zhì)資源的數(shù)量和遺傳多樣性而定，不能格式化與統(tǒng)一化的觀點(diǎn)相符合。

盡管構(gòu)建的木荷核心種質(zhì)能夠最大程度地代表整個(gè)木荷種質(zhì)資源的遺傳多樣性，但保留種質(zhì)仍不能淘汰，以便從保留種質(zhì)中尋找育種家們需要而在核心種質(zhì)中無法找到的性狀(Ciprianietal., 2010)。對所代表的基因庫中種質(zhì)資源遺傳多樣性的代表程度是評(píng)價(jià)核心種質(zhì)有效性的根本指標(biāo)； 然而基因庫中的材料常常不能完全代表一個(gè)種的全部遺傳多樣性，解決這個(gè)問題最有效的方法是使核心種質(zhì)的大小及內(nèi)容隨時(shí)間而變化(明軍等, 2005)。本研究原有種質(zhì)材料比較多，包含中國7個(gè)省(市)的754份木荷種質(zhì)資源，但部分地區(qū)的種質(zhì)資源相對較少(如重慶市、貴州省收集到的種質(zhì)資源僅分別為8個(gè)和12個(gè))，因此，為保證木荷豐富的物種多樣性，需不斷地補(bǔ)充新搜集的木荷優(yōu)樹種質(zhì)進(jìn)入木荷核心種質(zhì)中。本研究對木荷核心種質(zhì)的研究尚屬首次嘗試，由于標(biāo)記數(shù)量的限制及表型特征數(shù)據(jù)的缺乏，在今后的研究中仍需加以補(bǔ)充和完善。

通過DNA分子標(biāo)記來鑒別品種資源是準(zhǔn)確而有效的方法，這在大量的種質(zhì)資源研究中得到應(yīng)用(唐源江等, 2015; 李婷婷等, 2016)。由于具有特征條帶的材料較少，可以利用2對以上的引物組合來區(qū)分材料，若2對引物組合不能完全區(qū)分開所有材料時(shí)，則可以增加引物組合數(shù)直至區(qū)分開所有種質(zhì)材料(唐源江等, 2015)。SSR為共顯性標(biāo)記，是鑒定種質(zhì)資源的理想標(biāo)記之一(Zhangetal., 2012)，本研究選用13對SSR引物進(jìn)行組合，首次構(gòu)建了系統(tǒng)的木荷核心種質(zhì)分子鑒定、圖譜及數(shù)字化分子身份信息。利用SSR指紋圖譜庫構(gòu)建的115份核心種質(zhì)分子身份信息，其置信概率達(dá)99.99%，說明利用構(gòu)建的分子身份信息足以將115份木荷核心種質(zhì)區(qū)分開來。有限的引物只能適用于一定數(shù)量的樣本群體，本研究木荷核心種質(zhì)達(dá)到了115份，隨著核心種質(zhì)數(shù)量的增加，就需要增加更多合適的引物進(jìn)行鑒定(Heckenbergeretal., 2002)。在今后的工作中，應(yīng)將形態(tài)信息與分子數(shù)據(jù)結(jié)合在一起形成更加完整的木荷核心種質(zhì)指紋圖譜，使育種工作者能夠借助其分子身份信息更有針對性地開展研究，以大大縮短種質(zhì)鑒定時(shí)間。

(1) 隨車輛的前移，結(jié)合梁跨中撓度曲線以波動(dòng)式變化且撓度值逐漸增大，當(dāng)車輛行駛到試驗(yàn)梁跨中附近時(shí)跨中撓度值最大；隨剪力連接度的減小，部分連接結(jié)合梁的剛度降低，在相同車重和車速下，其跨中最大動(dòng)撓度值要高于完全連接結(jié)合梁。

4 結(jié)論

根據(jù)SSR標(biāo)記數(shù)據(jù)構(gòu)建木荷核心種質(zhì)，采用Corefinder軟件以等位基因最大化為原則的M策略優(yōu)于隨機(jī)取樣法(R)、根據(jù)模擬退火算法的等位基因最大化(SANA)和遺傳多樣性最大化(SAGD)為標(biāo)準(zhǔn)的取樣策略，是構(gòu)建木荷核心種質(zhì)的較適宜方法。按地理來源將754份木荷種質(zhì)資源劃分為7組，在各組內(nèi)采用M策略，構(gòu)建了含有115份材料的木荷核心種質(zhì)，保留了原有種質(zhì)15.3%的種質(zhì)材料，等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)和Shannon’s信息指數(shù)的保留率分別達(dá)到93.8%、115.6%和109.9%，表明本研究建立的核心種質(zhì)是有效的。并以13對SSR引物的擴(kuò)增數(shù)據(jù)，構(gòu)建了具有有效性和唯一性的115份木荷核心種質(zhì)的特異分子身份信息。同時(shí)本研究所采用的方法對其他多年生木本植物核心種質(zhì)的構(gòu)建具有重要的參考價(jià)值。

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(責(zé)任編輯 徐 紅)

Construction of Core Collection ofSchimasuperbaBased onSSR Molecular Markers

Yang Hanbo1Zhang Rui1Wang Bangshun2Xu Zhaoyou2Zhou Zhichun1

(1.ZhejiangProvincialKeyLaboratoryofTreeBreedingResearchInstituteofSubtropicalForestryChineseAcademyofForestryHangzhou311400; 2.LongquanForestryResearchInstitute,ZhejiangProvinceLongquan323700)

【Objective】 The most suitable sampling strategy and proportion for core collection ofSchimasuperbawere defined through a comparative analysis and evaluation, and a core collection ofS.superbawas constructed. Molecular identity of the core collection was further studied, providing theoretical basis and core materials for further research and utilization ofS.superbagermplasms. It also provides a basis for the core collection construction of other woody plants.【Method】 Taking 754 accessions ofS.superbaas materials that were come from seven provinces of China. The methods of M strategy (maximization strategy, M), random sampling (R), simulated annealing algorithm maximizing the genetic diversity (SAGD) and simulated annealing algorithm maximizing the number of alleles (SANA) were used to construct the core collections using 13 SSR primer pairs. The parameters of genetic diversity, such as number of alleles (Na), effective number of alleles (Ne) and Shannon’s information index (I), were used to determine the optimal method.【Result】 128 alleles (Na) were detected in 13 SSR primer pairs, the average ofNewas 3.47. High genetic diversity was revealed in the germplasm resources ofS.superba(I=1.39). Comparative analysis showed that the core collection constructed by SANA, SAGD and M strategies were all better than R strategy. The retained ofNain the core collection was low, although the core collection with SANA and SAGD are better representation of the original collection. The retained ofNain the core collection that was constructed by M strategy was apparently higher than other core collections that were constructed by other three strategies. According to the parameters of genetic diversity, and the number of sampling, the core collection constructed by M strategy could preserve the greatest level of genetic diversity of germplasm resources with the minimum sample size, indicating that M strategy was optimal in terms of establishing the most representative core collection, although SANA and SAGD methods all have good representation. The principal coordinate analysis (PCoA) showed that the core collection constructed by M strategy could more comprehensively represent at the genetic diversity level ofS.superba. The 115 accessions ofS.superbaincludes 15.3% samples of the germplasms, the retention ratio ofNa,NeandIwere 93.8%, 115.6% and 109.9%, and the specific molecular identity for 115 core collections were established with 99.99% probability of confidence. These results demonstrated that the 115 accessions could stand for the initial collection, at the same time a set of unique molecular identity was established for 115 accessions based on 13 SSR loci.【Conclusion】 M strategy is a suitable method for constructingS.superbacore collection. These results demonstrated that the 115 accessions as core collection could represent the original germplasms, at the same time this research method of the construction of core collection would provide an example for other tree species.

Schimasuperba； SSR marker； core collection； molecular identity

10.11707/j.1001-7488.20170605

2016-06-29;

2016-08-24。

“十二五”國家科技支撐計(jì)劃課題(2012BAD01B04)；浙江省竹木農(nóng)業(yè)新品種選育重大科技專項(xiàng)竹木育種協(xié)作組項(xiàng)目(2012C12908-6)；福建省林木種苗科技攻關(guān)五期項(xiàng)目木荷課題；江西省林業(yè)廳林業(yè)科技創(chuàng)新專項(xiàng)項(xiàng)目(201503)。

S722; S718.46

A

1001-7488(2017)06-0037-10

*張蕊為通訊作者。