李 濤 袁春桃

(邵陽學(xué)院教務(wù)處，湖南 邵陽 422000)

丹參酮ⅡA對(duì)缺血再灌注損傷大鼠心肌組織和心律失常的保護(hù)作用

李 濤 袁春桃1

(邵陽學(xué)院教務(wù)處，湖南 邵陽 422000)

目的 探討丹參酮ⅡA對(duì)缺血再灌注損傷大鼠心肌組織和心律失常的保護(hù)作用。方法 健康Wistar大鼠30只，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為5組，假手術(shù)組、模型組、丹參酮ⅡA高劑量(20 mg·kg-1·d-1)、中劑量(10 mg·kg-1·d-1)、低劑量組(5 mg·kg-1·d-1)，假手術(shù)組和模型組給予生理鹽水，高、中、低劑量3組分別給予相應(yīng)藥物灌胃7 d，末次給藥2 h后，除假手術(shù)組外均進(jìn)行心肌缺血的造模，記錄各組大鼠的心律失常評(píng)分、T波變化及心肌組織缺血修飾白蛋白(IMA)、心型脂肪酸結(jié)合蛋白(H-FBAP)及心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果 5組實(shí)驗(yàn)大鼠的IMA、H-FABP、Bcl-2 OD值、Bax OD值、Bcl-2/Bax值差異均顯著(P<0.05)；假手術(shù)組、丹參酮ⅡA高劑量組、丹參酮ⅡA中劑量組的IMA顯著低于模型組(P<0.05),假手術(shù)組、丹參酮ⅡA高劑量組H-FABP顯著高于模型組(P<0.05)，假手術(shù)組、丹參酮ⅡA高劑量組、丹參酮ⅡA中劑量組、丹參酮ⅡA低劑量組Bcl-2 OD值、Bax OD值、Bcl-2/Bax值均顯著高于或低于模型組。5組實(shí)驗(yàn)大鼠的心律失常評(píng)分、缺血再灌注T波變化幅度差異顯著(P<0.05)；模型組大鼠的心律失常評(píng)分〔(4.28±1.06)分〕，顯著低于假手術(shù)組、丹參酮ⅡA高劑量組和丹參酮ⅡA中劑量組(P<0.05)；模型組缺血再灌注T波變化幅度(0.447±0.027)mv顯著高于假手術(shù)組、丹參酮ⅡA高劑量組、丹參酮ⅡA中劑量組和丹參酮ⅡA低劑量組(P<0.05)。結(jié)論 丹參酮ⅡA對(duì)缺血再灌注損傷大鼠心肌組織和心律失常具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與抑制IMA、Bax蛋白升高、H-FBAP及Bcl-2蛋白降低有關(guān)。

丹參酮ⅡA；缺血再灌注損傷；心肌組織；心律失常

發(fā)生缺血性心臟病后，盡早恢復(fù)心肌供血是減輕損傷的基本措施，但缺血后再灌注可對(duì)心肌造成損傷，甚至引發(fā)心律失常，是心肌梗死患者早期死亡的主要原因〔1〕。自心肌缺血再灌注損傷的概念首次被提出后〔2〕，對(duì)損傷的發(fā)生機(jī)制及預(yù)防、治療措施的探索一直受醫(yī)學(xué)界重視。近年來，中藥在抗心律失常方面的研究取得了很大的進(jìn)展，其中以中藥丹參為主要成分的丹參片、復(fù)方丹參滴丸等藥物一直位列一線藥物。本文觀察丹參酮ⅡA對(duì)缺血再灌注大鼠心律失常評(píng)分、T波變化及心肌組織缺血修飾白蛋白(IMA)、心型脂肪酸結(jié)合蛋白(H-FBAP)表達(dá)情況的影響，探討丹參酮ⅡA 減輕缺血再灌注心律失常的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物級(jí)分組 健康雄性Wistar大鼠30只，體重250～300 g，平均(273±13.6) g；采用隨機(jī)數(shù)字表法分為5組，假手術(shù)組、模型組、丹參酮ⅡA高劑量(20 mg·kg-1·d-1)、中劑量(10 mg·kg-1·d-1)、低劑量組(5 mg·kg-1·d-1)。

1.2 造模及給藥方法 5組大鼠于實(shí)驗(yàn)前7 d開始進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)，假手術(shù)組和模型組給予生理鹽水，丹參酮ⅡA高、中、低劑量分別按20、10、5 mg·kg-1·d-1標(biāo)準(zhǔn)灌胃7 d，末次給藥4 h后，除假手術(shù)組不采取冠脈結(jié)扎外，其余4組大鼠結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支15 min后松開使再灌注30 min制備模型。

1.3 儀器與試劑 LD4-2型離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠),江灣Ⅰ型微型人工呼吸機(jī),ZS83-1型內(nèi)切式組織勻漿器(浙西機(jī)械廠)，XD-30C三道心電圖機(jī)(上海醫(yī)用電子儀器廠)，ERM-4000石蠟切片機(jī)，徠卡EG1150組織包埋機(jī)，Olympus光學(xué)顯微鏡，RM6240B 型多通道生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)，DHC-1020電熱恒溫水槽，梅特勒AB104-S型萬分之一電子天平，心肌組織IMA、H-FABP試劑盒，Bcl-2蛋白抗體，Bax蛋白抗體(美國(guó)ADL公司)，DAB顯色試劑盒。

1.4 指標(biāo)檢測(cè)方法 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取大鼠左心室心肌，經(jīng)預(yù)冷的生理鹽水洗滌后-80℃保存?zhèn)溆?，檢測(cè)時(shí)取0.2 g心肌組織剪碎后加入4倍體積的裂解液，勻漿提取心肌組織總蛋白，然后轉(zhuǎn)入EP管，4℃靜置0.5 h，12 000 r/min、4℃離心 30 min，取上清按Bradford法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，IMA、H-FABP水平定量檢測(cè)采用雙抗體兩步夾心ELISA法,IMA檢測(cè)靈敏度為1.0 mg/ml，H-FABP檢測(cè)靈敏度為0.01 ng/ml。

1.5 左心室心肌組織Bcl-2和Bax蛋白檢測(cè) 再灌注2 h結(jié)束后，迅速取下左冠狀動(dòng)脈降支支配的左心室心肌，放置于10%甲醛溶液中進(jìn)行固定24 h之后行常規(guī)石蠟包埋，進(jìn)行切片，測(cè)定Bax和Bcl-2基因蛋白表達(dá)水平，封片結(jié)束后，在光學(xué)顯微鏡下觀察(400倍)，采用高清晰HAIPS-2000凸顯分析系統(tǒng)測(cè)定每周光密度值。

1.6 心律失常評(píng)分方法 無心律失?；蛘哂?，但是<5次的室性前期收縮，計(jì)0分；僅有≥5次的室性前期收縮，計(jì)1分； 有一陣<60 s的室性心動(dòng)過速，計(jì)2分；有一陣≥60 s的或多陣?yán)塾?jì)<60 s的室性心動(dòng)過速，計(jì)3分；多陣室性心動(dòng)過速累計(jì)>60 s，計(jì)4分；出現(xiàn)室顫，計(jì)5分；出現(xiàn)持續(xù)5 min以上的室顫或在觀察期間死亡，計(jì)6分。模型組只計(jì)算再灌注期30 min內(nèi)發(fā)生的心律失常。手術(shù)結(jié)束后處死動(dòng)物取左心室，-80℃保存?zhèn)溆?。記錄大鼠缺?5 min后再灌注30 min的心電圖變化情況，測(cè)量T波抬高或降低的情況。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 各組心肌缺血再灌注損傷指標(biāo)水平 各組IMA、H-FABP、Bcl-2 OD值、Bax OD值、Bcl-2/Bax值差異顯著(P<0.05)；假手術(shù)組、丹參酮ⅡA高、中劑量組的IMA顯著低于模型組(P<0.05),假手術(shù)組、丹參酮ⅡA高劑量組的H-FABP顯著高于模型組(P<0.05)，假手術(shù)組、丹參酮ⅡA高、中、低劑量組的Bcl-2 OD值、Bax OD值、Bcl-2/Bax值均顯著高于或低于模型組(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠心肌缺血再灌注損傷指標(biāo)水平比較±s)

與模型組比較：1)P<0.05；與假手術(shù)組比較:2)P<0.05；與丹參酮ⅡA高劑量組比較：3)P<0.05；與丹參酮ⅡA中劑量組比較:4)P<0.05,下表同

2.2 各組心律失常指標(biāo)比較 各組心律失常評(píng)分、缺血再灌注T波變化幅度差異顯著(P<0.05)；模型組心律失常評(píng)分顯著高于假手術(shù)組、丹參酮ⅡA高、中、低劑量組(P<0.05)；模型組缺血再灌注T波變化幅度顯著高于假手術(shù)組、丹參酮ⅡA高、中和低劑量組(P<0.05)。見表2。

表2 各組心律失常指標(biāo)變化情況±s，n=6)

3 討 論

心肌缺血再灌注損傷的概念被提出〔2〕，對(duì)損傷的發(fā)生機(jī)制及預(yù)防、治療措施的探索一直受醫(yī)學(xué)界重視〔3〕。臨床研究逐漸認(rèn)識(shí)到心肌缺血再灌注損傷的發(fā)生過程十分復(fù)雜，簡(jiǎn)要過程大致如下：心肌細(xì)胞缺血→胞內(nèi)Ca2+濃度升高→細(xì)胞膜Na+/H+交換系統(tǒng)被激活→胞內(nèi)Na+濃度升高→Na+/Ca2+交換系統(tǒng)被激活，導(dǎo)致Ca2+大量進(jìn)入細(xì)胞→磷脂酶被激活→產(chǎn)生氧自由基；大量Ca2+移向線粒體導(dǎo)致線粒體功能障礙→引起心律失常。

正常人體中并不存在IMA，但當(dāng)心肌缺血時(shí)，一系列生化指標(biāo)的改變導(dǎo)致血液白蛋白(HSA)氨基末端N受損或被Cu2+結(jié)合，或受游離羥基的損害使氮基末端2～4個(gè)氨基酸改變成為IMA，在心肌缺血5～10 min后血中IMA即可升高，缺血停止后可持續(xù)2～4 h，12 h后恢復(fù)正常。冠心病患者經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療也可導(dǎo)致血液循環(huán)IMA中水平一過性升高；脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP)是一種特異性存在于心肌細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的游離脂肪酸的運(yùn)載體，H-FABP是這種小分子蛋白的一種亞型，這種小分子蛋白的作用是將游離脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體，因而是心肌收縮的主要能量來源，在發(fā)生心肌缺血后，H-FABP分子由于心肌細(xì)胞膜通透性增加而從心肌細(xì)胞大量流失，從而導(dǎo)致心肌細(xì)胞能量代謝物質(zhì)缺乏，加重心肌受損。Bcl-2蛋白是一種存在于膜細(xì)胞器的膜整合蛋白家族，成員中如Bax、Bid 等發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用，Bcl-2、Bcl-x等發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡作用。有研究證實(shí)Bcl-2過度表達(dá)有較強(qiáng)的抗大鼠心肌凋亡作用，但Bcl-2表達(dá)在缺血再灌注時(shí)顯著下降，因而凋亡指數(shù)升高，研究還發(fā)現(xiàn)在人體心肌缺血再灌注中試驗(yàn)中，細(xì)胞凋亡蛋白Bax表達(dá)隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加〔4〕。本研究丹參酮ⅡA對(duì)缺血再灌注損傷及再灌注心肌細(xì)胞損傷具有良好的保護(hù)作用，與文獻(xiàn)相符〔5,6〕,其作用機(jī)制可能與其減輕炎癥反應(yīng)、抑制鈣超載、活化內(nèi)皮一氧化氮合酶/一氧化氮途徑減少心肌梗死面積等有關(guān)〔7～11〕，至于其更多的藥理機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

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〔2015-07-14修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢(mèng)園)

湖南省教育廳科學(xué)研究項(xiàng)目(No.17C1431)；邵陽市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2015NC53)

袁春桃(1982-)，女，主治醫(yī)師，主要從事心血管系統(tǒng)疾病基礎(chǔ)與臨床研究。

李 濤(1980-)，男，講師，主要從事心血管藥理研究。

R285.5

A

1005-9202(2017)13-3154-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.13.014

1 邵陽市中心醫(yī)院