高 瑛 劉勝鳳 張成華

(川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，四川 南充 637000)

碘對(duì)自身免疫性甲狀腺疾病大鼠血清與甲狀腺組織IP-10 mRNA表達(dá)的影響

高 瑛 劉勝鳳 張成華1

(川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，四川 南充 637000)

目的 探討碘對(duì)自身免疫性甲狀腺疾病大鼠血清與甲狀腺組織IP-10 mRNA表達(dá)水平的影響。方法 選取4周齡的特殊清潔級(jí)(SPF)級(jí)雌性Wistar大鼠90只，按照隨機(jī)數(shù)字法分為對(duì)照組(NC)、模型組(TG)、適碘組(NI)、模型組+適碘組(TG+NI)、高碘組(HI)、模型組+高碘組(TG+HI)，每組15只。剔除造模失敗、死亡、瘦弱的大鼠，選擇每組10只。NC組和TG組飲用不含碘的去離子水，NI組合TG+NI組飲用含150 μg/L碘的去離子水，HI組和TG+HI組飲用含3 000 μg/L碘的去離子水。在第10周結(jié)束時(shí)處死所有大鼠。放射免疫法(RIA)測(cè)定甲狀腺自身抗體水平；分光光度計(jì)法測(cè)定大鼠組織碘和尿碘；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)血清IP-10含量；RT-PCR法檢測(cè)甲狀腺組織IP-10 mRNA表達(dá)水平。結(jié)果 6組大鼠血清的TGAb和TMAb水平及甲狀腺組織IP-10 mRNA水平組間比較均差異顯著(P<0.05)，同等碘處理?xiàng)l件下，模型組的血清水平均顯著高于非模型組(P<0.05)。6組大鼠的甲狀腺組織碘和尿碘水平組間比較均有顯著差異(P<0.05)，且隨著碘攝入量的增高甲狀腺組織碘及尿碘水平均顯著升高(P<0.05)；同等碘處理?xiàng)l件下，所有模型組的甲狀腺組織碘和尿碘水平均低于非模型組。而6組大鼠血清IP-10含量比較無(wú)顯著差異(P>0.05)。結(jié)論 大鼠對(duì)碘過(guò)量具有很強(qiáng)的耐受能力，可以適應(yīng)高碘現(xiàn)象，當(dāng)?shù)膺^(guò)量時(shí)，會(huì)降低機(jī)體甲狀腺組織重IP-10 mRNA的表達(dá)，以此提高高碘的耐受能力。

自身免疫性甲狀腺炎；碘；IP-10

自身免疫性甲狀腺疾病(AITD)屬于一種非常常見(jiàn)的器官特異性的自身免疫性疾病，主要包括Graves眼病、慢性淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎、產(chǎn)后甲狀腺炎等〔1〕。AITD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜并且與多種因素有關(guān)，不僅與自身機(jī)體的免疫因素、遺傳因素、環(huán)境因素有關(guān)，還與因自由基導(dǎo)致的氧化應(yīng)激等相關(guān)〔2〕。甲狀腺激素由甲狀腺合成分泌，其中碘作為該過(guò)程中的必需微量元素參與其中〔3〕。趨化因子是一類(lèi)細(xì)胞因子，具有化學(xué)引誘物特性，能夠引發(fā)大量免疫效應(yīng)細(xì)胞進(jìn)入炎癥組織，起到啟動(dòng)和維持自身免疫過(guò)程的作用。近年來(lái)，越來(lái)越多研究人員關(guān)注趨化因子IP-10在發(fā)病過(guò)程中的作用，如腎炎、慢性乙肝、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等〔4〕。本研究采用豬甲狀腺球蛋白誘導(dǎo)大鼠形成實(shí)驗(yàn)性自身免疫性甲狀腺炎(EAT)模型，觀察碘量差異對(duì)大鼠血清IP-10水平及甲狀腺I(mǎi)P-10 mRNA含量的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選取4周齡的特殊清潔級(jí)(SPF)級(jí)雌性Wistar大鼠90只，體重120～140 g，按照隨機(jī)數(shù)字法分為對(duì)照組(NC)、模型組(TG)、適碘組(NI)、模型組+適碘組(TG+NI)、高碘組(HI)、模型組+高碘組(TG+HI)，每組15只。剔除造模失敗、死亡、瘦弱的大鼠，選擇每組10只。

1.2 動(dòng)物飼養(yǎng) 根據(jù)美國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)(AIN)的嚙齒類(lèi)動(dòng)物純化配方的要求〔5〕，配制合成飼料對(duì)各組大鼠進(jìn)行喂食(所有成分均按照配方要求進(jìn)行配置，但是混合礦物質(zhì)配置時(shí)不加碘)。NC組和TG組飲用不含碘的去離子水，NI組及TG+NI組飲用含150 μg/L碘的去離子水，HI組及TG+HI組飲用含3 000 μg/L碘的去離子水。

1.3 EAT動(dòng)物模型 將100 mg豬甲狀腺球蛋白完全溶于50 ml無(wú)菌雙蒸水中，取10 ml溶解液分別與10 ml完全弗氏佐劑和不完全弗氏佐劑混合形成濃度為200 μg/ml的油包水狀乳劑抗原。實(shí)驗(yàn)第2周對(duì)大鼠進(jìn)行初次免疫，在其右后足皮下注射0.5 ml乳劑抗原；實(shí)驗(yàn)第5周進(jìn)行加強(qiáng)免疫，在其背部皮下注射0.5 ml乳劑抗原，每周注射1次，共注射6次，在第10周結(jié)束時(shí)處死所有大鼠。迅速取出甲狀腺，測(cè)定組織含碘；死前1 w收集尿液進(jìn)行尿碘測(cè)定。

1.4 EAT大鼠自身抗原檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)第10周所有大鼠眼靜脈取血置于離心管，室溫靜止30 min后3 600 r/min離心10 min，分離血清，放射免疫法檢測(cè)TGAb及TMAb，試劑盒均購(gòu)于坊三維生物工程集團(tuán)有限公司，設(shè)置陰性血清管、陽(yáng)性血清管和樣本管，所有管中均加入標(biāo)記物，再加入免疫分離劑，離心去上清，測(cè)沉淀放射性計(jì)數(shù)，具體步驟參考說(shuō)明書(shū)所述。

1.5 血清IP-10含量檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)第10周所有大鼠眼靜脈取血置于離心管，室溫靜止30 min后3 600 r/min離心10 min，分離血清，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)IP-10含量，試劑盒購(gòu)于美國(guó)Peprotech公司，在酶標(biāo)板孔內(nèi)加入標(biāo)準(zhǔn)品和樣品，450 nm處測(cè)定OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品濃度，具體步驟參考說(shuō)明書(shū)所述。

1.6 甲狀腺組織IP-10 mRNA檢測(cè) 采用RT-PCR方法，實(shí)驗(yàn)第10周，解剖各組大鼠，從甲狀腺組織中利用Trizol法提取總RNA，利用大連TAKARA公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。PCR引物序列：IP-10：正義：5′-CAAGGCTTCCCAATTCTC-3′，反義：5′-ACCTGGACTGCATTTGA-3′，退火溫度57℃，長(zhǎng)度202 bp；GAPDH：正義：5′-GGCACAGTCAAGGCTGAATG-3′，反義：5′-ATGGTGGTGAACGCCAGTA-3′。退火溫度57℃，長(zhǎng)度143 bp。各組的mRNA相對(duì)表達(dá)量以2-△△CT值表示。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件，計(jì)量資料兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠血清TGAb及TMAb水平 6組大鼠血清TGAb及TMAb水平組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，同等碘處理?xiàng)l件下，模型組的血清水平均顯著高于非模型組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.2 甲狀腺組織碘及尿碘水平 6組大鼠的甲狀腺組織碘和尿碘水平組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；隨著碘攝入量的增高，甲狀腺組織碘及尿碘水平均顯著升高(P<0.05)。同等碘處理?xiàng)l件下，模型組的水平均低于非模型組，見(jiàn)表1。

2.3 血清IP-10含量及甲狀腺組織IP-10 mRNA水平 6組大鼠血清IP-10含量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而甲狀腺組織IP-10 mRNA水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，隨著不斷增加碘的攝入量，IP-10 mRNA表達(dá)水平均高于NC組；同等碘處理?xiàng)l件下，模型組的IP-10 mRNA的表達(dá)水平均高于非模型組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血清TGAb、TMAb水平甲狀腺組織碘、尿碘、血清IP-10含量及甲狀腺組織IP-10 mRNA比較

與NC組比較：1)P<0.05；與TG組比較:2)P<0.05；與NI組比較:3)P<0.05；與HI組比較:4)P<0.05

3 討 論

本試驗(yàn)采用的EAT模型，被認(rèn)為是研究AITD的標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物模型〔6〕。EAT大鼠模型成功建立的標(biāo)準(zhǔn)之一為血清中TMAb及TGAb含量較高。碘量攝入過(guò)多也能夠增強(qiáng)TMAb及TGAb的免疫原性〔7〕。本實(shí)驗(yàn)中，模型組大鼠血清中TMAb及TGAb含量均高于正常對(duì)照組；此外，TMAb及TGAb升高促使甲狀腺淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)程度，加快穿孔素釋放激活凋亡系統(tǒng)，最終加速凋亡、破壞濾泡上皮細(xì)胞。根據(jù)上述結(jié)果，我們可以認(rèn)定實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ驮炷３晒Α?/p>

NC和TG組喂養(yǎng)10 w后檢測(cè)尿碘含量及甲狀腺組織中碘的含量，表現(xiàn)出顯著的碘缺乏。HI組雖然每天的攝入碘量是NI組的20倍，但是檢測(cè)出的甲狀腺組織碘的含量并未表現(xiàn)出成倍地增加，只是出現(xiàn)輕微的升高；卻發(fā)現(xiàn)尿碘的含量成倍增加，增加幅度與攝入量較一致。表明甲狀腺具有嚴(yán)格調(diào)控碘攝入的能力。

趨化因子是一類(lèi)細(xì)胞因子，能夠激發(fā)白細(xì)胞的趨化性，誘導(dǎo)單核、中性粒巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞進(jìn)入到炎癥灶，增強(qiáng)炎性細(xì)胞在炎癥過(guò)程中的吞噬殺傷能力，還能影響細(xì)胞因子在免疫系統(tǒng)中的作用〔8〕。根據(jù)功能和生成趨化因子的細(xì)胞類(lèi)型，可將趨化因子分為4個(gè)亞族：C、CC、CXC、CX3C，其中C表示一個(gè)半胱氨酸，X表示氨基酸殘基〔9〕。IP-10是CXC亞族中比較具有代表性的趨性因子，可由干擾素(IFN)-γ誘導(dǎo)產(chǎn)生，在炎癥反應(yīng)中IP-10能夠結(jié)合CXCR3受體趨化活化諸多淋巴細(xì)胞遷移至炎癥部位〔10〕。本實(shí)驗(yàn)中，不斷增加碘的攝入量，大鼠血清中的IP-10水平與甲狀腺中IP-10 mRNA表達(dá)水平均高于正常對(duì)照組，并且升高趨勢(shì)一致。TG+NI組比正常碘給予組的甲狀腺分泌了更多的IP-10。還有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，血清中IP-10水平僅僅在剛被確診為ETA的患者體內(nèi)升高，如果患者屬于長(zhǎng)期患病，則其體內(nèi)血清IP-10水平降低，反而出現(xiàn)另一種趨化因子CCL22水平升高〔11〕。從結(jié)果來(lái)看，當(dāng)攝碘量高至一定濃度時(shí)，大鼠機(jī)體會(huì)發(fā)生代償性紊亂，也可能因?yàn)镋TA病情的加重，另一種趨化因子開(kāi)始影響，這需要通過(guò)后續(xù)試驗(yàn)進(jìn)行深入研究。

綜上所述，大鼠對(duì)過(guò)量碘具有很強(qiáng)的耐受能力，可以適應(yīng)高碘現(xiàn)象。其機(jī)制之可能為當(dāng)?shù)膺^(guò)量時(shí)，會(huì)降低機(jī)體甲狀腺組織IP-10 mRNA的表達(dá)，以此提高高碘的耐受能力。

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〔2016-11-19修回〕

(編輯 李相軍)

Effect of iodine on the expression of IP-10 mRNA in serum and thyroid tissue of autoimmune rats

GAO Ying, LIU Sheng-Feng, ZHAGN Cheng-Hua.

Affiliated Hospital of Chuanbei Medical College, Nanchong 637000, Sichuan, China

Objective To investigate the effect of iodine on the expression of IP-10 mRNA in serum and thyroid tissue of autoimmune rats.Methods 90 SPF female Wistar rats were randomly divided into control (NC), model (TG), normal iodine (NI), model and normal iodine (TG+NI) and high iodine (HI), model and high iodine (TG+HI) groups, 15 cases each. NC and TG groups were given no iodine water, NI and TG+NI groups deionized water containing 150 g/L deionized water, HI and TG+HI groups water containing 3 000 g/L, NC and TG groups deionized water with out iodine, NI and TG+NI groups deionized water containing 150 μg/L of water, HI and TG+HI groups deionized water containing 3 000 μg/L. Radioimmunoassay (RIA) was used to determine the levels of thyroid autoantibodies; spectrophotometry was used to determine iodine and iodine in rat tissues; enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to determine serum IP-10 content; RT-PCR method was used to detect the expression of IP-10 mRNA in thyroid tissue.Results The serum TGAb and TMAb levels and thyroid tissue IP-10 mRNA levels were significantly different between two groups (P<0.05); in the same iodine treatment conditions, serum TGAb and TMAb levels of all of the model groups were significantly higher than those of non model groups (P<0.05). The thyroid iodine and urinary iodine levels had significant differences(P<0.05); and with the increase of iodine intake, iodine of thyroid tissue and urinary iodine levels were significantly increased (P<0.05).Conclusions Rats have a strong tolerance to iodine excess, to adapt to the phenomenon of high iodine, when under excessive iodine, it will reduce the IP-10 mRNA expression of thyroid tissue, in order to improve the tolerance of high iodine.

Autoimmune thyroiditis; Iodine; IP-10

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目(No.21503026)

張成華(1985-)，女，博士，講師，主要從事基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究及教學(xué)工作。

高 瑛(1988-)，女，在讀碩士，主要從事基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究。

R581.4

A

1005-9202(2017)13-3135-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.13.006

1 川北醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院