羅 偉，崔 森，冀林華，王紅心，李玉麗，馬曉靜，馬 婕

·論著·

蛋白C基因多態(tài)性及血漿蛋白C水平與慢性高原病易感性的關(guān)系研究

羅 偉*，崔 森，冀林華，王紅心，李玉麗，馬曉靜，馬 婕

目的 探究蛋白C(PC)基因多態(tài)性及血漿PC水平與慢性高原病(CMS)易感性的關(guān)系。方法 選擇2014年1月—2015年10月移居青海省玉樹藏族自治州玉樹縣青年男性漢族CMS患者30例為CMS組，同期移居而未發(fā)生CMS的青年男性漢族健康志愿者30例為對照組。采用PCR直接測序法檢測PC基因-1654C/T、-1641A/G、-1476A/T位點(diǎn)多態(tài)性，采用ELISA法檢測血漿PC水平。比較兩組PC基因不同位點(diǎn)多態(tài)性及血漿PC水平。結(jié)果 CMS組與對照組PC基因-1654C/T位點(diǎn)基因型頻率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；兩組PC基因-1654C/T位點(diǎn)等位基因頻率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。CMS組與對照組PC基因-1641A/G位點(diǎn)基因型頻率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；兩組PC基因-1641A/G位點(diǎn)等位基因頻率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。CMS組與對照組PC基因-1476A/T位點(diǎn)基因型頻率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；兩組PC基因-1476A/T位點(diǎn)等位基因頻率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。CMS組血漿PC水平低于對照組(P<0.05)。結(jié)論 PC基因-1654C/T、-1641A/G及-1476A/T位點(diǎn)多態(tài)性與CMS的易感性之間存在一定關(guān)系，可根據(jù)基因多態(tài)性對CMS易感人群進(jìn)行篩選，進(jìn)而有效預(yù)防CMS的發(fā)生。

高原??；蛋白C；等位基因；多態(tài)性，單核苷酸

羅偉，崔森，冀林華，等.蛋白C基因多態(tài)性及血漿蛋白C水平與慢性高原病易感性的關(guān)系研究[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2017，20(21)：2618-2622.[www.chinagp.net]

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慢性高原病(CMS)是高原居住人群對高原低氧低壓不耐受產(chǎn)生的一系列臨床體征[1]，主要的病理特征為紅細(xì)胞增多及嚴(yán)重的低氧血癥?；颊哐吼仍龈撸骶徛?，呈現(xiàn)血栓前狀態(tài)(PTS)，繼而發(fā)生血液、呼吸、循環(huán)、神經(jīng)、消化、泌尿系統(tǒng)等全身各臟器的系統(tǒng)性疾病[2]，并且隨著海拔高度的增加，發(fā)病率也逐漸增高[3]。目前有關(guān)CMS的發(fā)病原因，學(xué)術(shù)界普遍認(rèn)為高原習(xí)服失衡是其根本原因，高原特殊的低氧低壓環(huán)境容易引起通氣過度、電解質(zhì)失衡、血液改變，進(jìn)而引起高原難以習(xí)服[4-5]。通常非高原居住者來到高原以后多會發(fā)生CMS癥狀，而世居高原的居民則會自然習(xí)服，在高原進(jìn)行正常的生命活動(dòng)，而這意味著高原世居者可能已發(fā)生基因改變[6]。本研究以人類蛋白C(PC)基因?yàn)檠芯糠较?，取基因序列中單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，并檢測血漿PC水平，探究PC與CMS的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2014年1月—2015年10月移居青海省玉樹藏族自治州玉樹縣(海拔3 600～3 700 m)青年男性漢族CMS患者30例為觀察組，平均年齡(37.4±7.2)歲；平均移居時(shí)間(1.7±0.7)年。同期移居而未發(fā)生CMS的青年男性漢族健康志愿者30例為對照組，平均年齡(36.8±8.0)歲；平均移居時(shí)間(1.8±0.6)年。兩組受試者年齡(t=0.442)、移居時(shí)間(t=0.761)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)青海大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員批準(zhǔn)，受試者均對本研究知情同意。

1.2 CMS患者的納入標(biāo)準(zhǔn) (1)均符合2004年第六屆國際高原醫(yī)學(xué)和低氧生理學(xué)術(shù)大會制定的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；(2)移居青海1年以上；(3)除CMS外無其他疾?。?4)無家族性遺傳疾病。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取 所有受試者禁食12 h后于清晨采集空腹靜脈血，EDTA抗凝，低溫(-20 ℃)保存，所有血樣采集完畢后參照血液基因組DNA提取試劑盒說明書提取DNA。

1.3.2 PCR擴(kuò)增和直接測序 從NCBI數(shù)據(jù)庫下載PC基因序列(NC 000002.11)，應(yīng)用軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)引物，同時(shí)在GeneBank中進(jìn)行同源性比對，挑選最佳引物對，最后確定引物對為5′-ATTGGGATGGCATGTC ATTG-3′和5′-CCCTGGCTGGAGGATTCAG-3′，采用Bio-Rad Mycycler PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行目的基因片段擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：基因組DNA 200 ng，引物對各20 pmol，10×Taq buffer 5 μl，dNTP mix 4 μl，TaKaRa+Taq酶2.5 U，滅菌雙蒸水補(bǔ)足至50 μl。PCR相關(guān)試劑均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3.3 基因多態(tài)性分析 對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化后，采用Mutation Surveyor軟件與PC基因序列比對分析，篩選Mutation Surveyor軟件指出的測序結(jié)果與參考序列不一致之處，判斷該樣本是否發(fā)生PC基因突變，并觀察PC基因-1654C/T、-1641A/G、-1476A/T位點(diǎn)多態(tài)性。

1.3.4 血漿PC水平檢測 采用固相雙抗體夾心ELISA法檢測血漿PC水平。

2 結(jié)果

2.1 兩組PC基因-1654C/T、-1641A/G及-1476A/T位點(diǎn)Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)結(jié)果 將所有受試者PC基因-1654C/T、-1641A/G及-1476A/T位點(diǎn)等位基因和基因型進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，CMS組χ2值分別為0.069、0.296、0.097，P值分別為0.789、0.735、0.756；對照組χ2值分別為0.368、0.315、0.021，P值分別為0.575、0.683、0.897，表明所選擇的群體處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。2.2 兩組PC基因-1654C/T位點(diǎn)多態(tài)性比較 兩組PC基因-1654C/T位點(diǎn)基因型頻率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；兩組PC基因-1654C/T位點(diǎn)等位基因頻率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表1、圖1)。

表1 兩組PC基因-1654C/T位點(diǎn)多態(tài)性比較〔n(%)〕

注：CMS=慢性高原病

圖1 兩組PC基因-1654C/T位點(diǎn)多態(tài)性

2.3 兩組PC基因-1641A/G位點(diǎn)多態(tài)性比較 兩組PC基因-1641A/G位點(diǎn)基因型頻率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；兩組PC基因-1641A/G位點(diǎn)等位基因頻率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表2、圖2)。

2.4 兩組PC基因-1476A/T位點(diǎn)多態(tài)性比較 兩組PC基因-1476A/T位點(diǎn)基因型頻率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；兩組PC基因-1476A/T位點(diǎn)等位基因頻率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表3、圖3)。

表2 兩組PC基因-1641A/G位點(diǎn)多態(tài)性比較〔n(%)〕

圖2 兩組PC基因-1641A/G位點(diǎn)多態(tài)性

組別例數(shù)基因型AA AT TT等位基因A T對照組30 2(6.67) 28(93.33)045(75.00)15(25.00)CMS組3011(36.67)19(63.33)048(80.00)12(20.00)χ2值7.9540.430P值0.0050.512

圖3 兩組PC基因-1476A/T位點(diǎn)多態(tài)性

2.5 兩組血漿PC水平比較 CMS組血漿PC水平低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表4)。

表4 兩組血漿PC水平比較

3 討論

PC是由肝臟合成的一種維生素K依賴性糖蛋白[8]，為抗凝系統(tǒng)中的關(guān)鍵成分，人類PC基因位于2號染色體(2q14～21),長11.2 Kb，有8個(gè)外顯子，7個(gè)內(nèi)含子，由419個(gè)氨基酸殘基組成，相對分子量為62 KD，正常人血漿PC水平為3～5 mg/L。PC本身是絲氨酸蛋白酶原，其激活劑為凝血酶，激活實(shí)質(zhì)是一個(gè)酶解過程，即裂解重鏈N2H末端精氨酸(Arg)-異亮氨酸(Ile)肽鍵，解離下一個(gè)12肽而活化[9]。PC被激活成為活化PC(APC)后發(fā)揮抗凝作用：(1)滅活FⅤa和FⅧa。APC在磷脂及Ca2+參與下，裂解FⅤa及FⅧa重鏈，使FⅤa及FⅧa失活，阻止了凝血酶的形成。(2)阻礙FⅩa與血小板結(jié)合。血小板表面存在著FⅩa受體(FⅩaR)，當(dāng)FⅩa與FⅩaR結(jié)合后可使FⅩa活性極大增強(qiáng)。(3)促進(jìn)纖維蛋白溶解。APC能刺激內(nèi)皮細(xì)胞釋放組織型纖溶酶原激活物(t-PA)等纖溶物質(zhì)，同時(shí)滅活纖溶酶原活化物抑制劑-1(PAI-1)，激活纖溶系統(tǒng)，促進(jìn)纖維蛋白溶解。既往研究發(fā)現(xiàn)，低氧可使機(jī)體凝血機(jī)制發(fā)生紊亂，認(rèn)為低氧時(shí)機(jī)體抗凝血系統(tǒng)PC水平降低，導(dǎo)致患者血液黏滯度進(jìn)一步增加，考慮PC的降低是導(dǎo)致CMS發(fā)生、發(fā)展的病理基礎(chǔ)之一[10]。自1981年發(fā)現(xiàn)了第1個(gè)PC基因突變以來，截至2013年1月，在人類基因突變庫中登記的PC基因突變已有262種[11]。突變類型主要有單堿基替代、缺失/插入、剪切位點(diǎn)突變和啟動(dòng)子區(qū)突變等，突變分布于PC基因的各個(gè)區(qū)域。有研究發(fā)現(xiàn)多數(shù)CMS患者存在PC基因啟動(dòng)子區(qū)-1654C/T、-1641A/G及5′-非翻譯區(qū)-1476A/T位點(diǎn)的多態(tài)性[12-13]，并發(fā)現(xiàn)PC基因該區(qū)域-1654C/T、-1641A/G和-1476A/T位點(diǎn)的多態(tài)性可能與血漿PC水平有關(guān)[14-15]。啟動(dòng)子區(qū)一般位于基因表達(dá)的調(diào)控區(qū)，該區(qū)域的改變可導(dǎo)致順式作用元件的改變，從而引起基因表達(dá)水平的改變。如果單核苷酸多態(tài)性存在于基因表達(dá)的調(diào)控區(qū)，其能改變基因的表達(dá)水平，從而對表型產(chǎn)生明顯影響。5′-非翻譯區(qū)包括外顯子1和21 bp顯子2，該區(qū)域不編碼，導(dǎo)致PC基因轉(zhuǎn)錄起始部位與翻譯起始密碼子分離，該區(qū)域及其鄰近的基因變異同樣可能影響基因的表達(dá)調(diào)控[16]。

本研究采用PCR直接測序法檢測PC基因序列中位于啟動(dòng)子區(qū)-1654C/T、-1641A/G及5′-非翻譯區(qū)-1476A/T單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)在高原漢族男性移居人群CMS患者以及相應(yīng)的健康人群的基因頻率分布，以探討PC基因多態(tài)性與CMS的相關(guān)性。首先，CMS組和對照組PC基因-1654C/T、-1641A/G、-1476A/T 3個(gè)位點(diǎn)等位基因和基因型的觀察值和期望值吻合良好，均符合Hardy-Weinberg平衡定律，表明所選人群具有群體代表性。此外，兩組PC基因-1654C/T、-1641A/G、-1476A/T位點(diǎn)基因型頻率間均有差異，表明PC基因多態(tài)性與CMS易感性存在一定關(guān)系。本課題采用固相雙抗體夾心ELISA法檢測血漿PC水平，結(jié)果顯示，CMS患者血漿PC水平明顯低于對照組，與前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果[17]相吻合。

綜上所述，PC基因-1654C/T、-1641A/G及-1476A/T位點(diǎn)多態(tài)性與CMS的易感性之間存在一定關(guān)系。本課題初步得出PC基因-1654C/T、-1641A/G以及5′-非翻譯區(qū)-1476A/T位點(diǎn)多態(tài)性及血漿PC水平與CMS的易感性關(guān)系，從基因水平更深刻的闡明CMS發(fā)生的差異原因和內(nèi)在機(jī)制，通過遺傳標(biāo)記的檢測，進(jìn)一步揭示CMS發(fā)生的遺傳背景，對采取有效的群體預(yù)防措施，預(yù)防CMS發(fā)生具有重要意義，為促進(jìn)高原地區(qū)經(jīng)濟(jì)和社會發(fā)展提供強(qiáng)有力的理論和實(shí)踐指導(dǎo)。

作者貢獻(xiàn)：羅偉、崔森、冀林華進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)；羅偉、冀林華、王紅心進(jìn)行研究的實(shí)施與可行性分析；李玉麗、馬曉靜、馬婕收集數(shù)據(jù)；羅偉、馬曉靜整理數(shù)據(jù)；羅偉、冀林華進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理；羅偉、崔森、冀林華分析并解釋結(jié)果；羅偉、冀林華、馬曉靜撰寫論文；羅偉、崔森、冀林華進(jìn)行論文修訂；羅偉、冀林華負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校；羅偉對文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。

本研究局限性：

(1)進(jìn)一步增加樣本量進(jìn)行群體遺傳學(xué)的研究，盡量減少由于樣本量少而發(fā)生信息偏倚。(2)當(dāng)通過病例-對照研究已揭示在人群水平上某標(biāo)記位點(diǎn)與某些性狀(如疾病)存在某種關(guān)聯(lián)性時(shí)，在未來進(jìn)一步研究中可選擇以受累家系為基礎(chǔ)的內(nèi)在對照組(由雙親及同胞組成)，進(jìn)行單倍型相對風(fēng)險(xiǎn)率分析(HRR)及傳遞/不平衡試驗(yàn)(TDT)，以排除可能的虛假關(guān)聯(lián)。(3)慢性高原病發(fā)生率明顯存在種族差異，青海地域廣闊、氣候復(fù)雜、民族眾多,可進(jìn)一步研究蛋白C等位基因的分布頻率在不同民族之間的差異。

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(本文編輯：毛亞敏)

Association of Protein C Gene Polymorphisms and Plasma Protein C Levels with the Susceptibility to Chronic Mountain Sickness

LUOWei*，CUISen，JILin-hua，WANGHong-xin，LIYu-li，MAXiao-jing，MAJie

DepartmentofHematology,QinghaiUniversityAffiliatedHospital,Xining810001,China

*Correspondingauthor:LUOWei,Associateprofessor，Associatechiefphysician，Mastersupervisor；E-mail：luoweili992@126.com

Objective To explore the association of protein C(PC) gene polymorphism and plasma PC levels with the susceptibility to chronic mountain sickness(CMS).Methods This study was conducted in 60 young males of Han nationality who moved to Yushu County,Yushu Zang Autonomous Prefecture,Qinghai Province from January 2014 to October 2015,including 30 cases with CMS(CMS group),and 30 healthy cases without CMS volunteered for this study(control group).PCR-direct sequencing was used to detect the PC gene polymorphism at the -1654C/T,-1641A/G and -1476A/T loci.Plasma PC levels were determined by ELISA.Comparisons were made between the groups in terms of the PC gene polymorphisms at the three loci and plasma PC levels.Results Significant differences were found between the two groups in the PC gene polymorphism genotype frequencies at the -1654C/T locus(P<0.05),but not in PC gene polymorphism allele frequencies at it(P>0.05).The PC gene polymorphism genotype frequencies at the -1641A/G locus differed significantly between the two groups(P<0.05),while the PC gene polymorphism allele frequencies at it did not(P>0.05).Notable differences were found between the two groups in terms of the PC gene polymorphism genotype frequencies at the -1476A/T locus(P<0.05),but not in PC gene polymorphism allele frequencies at it(P>0.05).The plasma PC levels in CMS group were lower than those in the control group(P<0.05).Conclusion PC polymorphisms at the -1654C/T,-1641A/G and -1476A/T loci genetic loci -1654C/T,-1641A/G and -1476A/T may be associated with the susceptibility to CMS.Therefore,in order to prevent CMS,PC polymorphisms measured can be used for identifying the susceptible population of CMS.

Altitude sickness；Protein C;Alleles；Polymorphism,single nucleotide

青海省科技廳國際合作項(xiàng)目(2014-HZ-808)；青海大學(xué)附屬醫(yī)院中青年科研基金項(xiàng)目(ASRF-2013-12)

R 594.3

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2017.21.012

2017-03-02；

2017-06-03)

810001青海省西寧市，青海大學(xué)附屬醫(yī)院血液科

*通信作者：羅偉，副教授，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師；E-mail：luoweili992@126.com