鄭小東， 許 然， 池田実， 谷口順彥

(1. 中國海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，山東 青島 266003； 2. 中國海洋大學(xué)海洋生物多樣性與進(jìn)化研究所，山東 青島266003； 3. 東北大學(xué)農(nóng)學(xué)部，日本 仙臺(tái)981-8555)

基于COI基因的西北太平洋金烏賊群體遺傳學(xué)研究?

鄭小東1,2， 許 然1,2， 池田実3， 谷口順彥3

(1. 中國海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，山東 青島 266003； 2. 中國海洋大學(xué)海洋生物多樣性與進(jìn)化研究所，山東 青島266003； 3. 東北大學(xué)農(nóng)學(xué)部，日本 仙臺(tái)981-8555)

對(duì)中日海域5個(gè)金烏賊群體123個(gè)個(gè)體的線粒體細(xì)胞色素氧化酶亞基I(COI)基因片段進(jìn)行測(cè)序，并應(yīng)用于群體遺傳多樣性分析。經(jīng)比對(duì)得到454 bp的核苷酸序列，并發(fā)現(xiàn)34個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，單突變位點(diǎn)15個(gè)，簡約信息位點(diǎn)19個(gè)，38個(gè)單倍型。群體遺傳多樣性較高，總?cè)后w的平均單倍型多樣性指數(shù)Hd為0.904，平均核苷酸多樣性Pi為0.007 7，平均核苷酸差異數(shù)K為3.490。遺傳分化系數(shù)(Fst)及遺傳距離均顯示中國日照群體與日本群體之間遺傳差異遠(yuǎn)大于日本群體之間的遺傳差異。日照群體與日本4個(gè)群體之間的遺傳分化系數(shù)(Fst)和遺傳距離分別為0.642 9～0.725 9和0.012 8～0.014 3之間；日本愛知、愛媛、長崎、福井等群體之間遺傳分化較小。單倍型網(wǎng)絡(luò)圖及貝葉斯樹均表明5個(gè)金烏賊群體分為2大支系，4個(gè)日本群體為一個(gè)支系，中國日照群體單獨(dú)為一支系。Tajima’D檢驗(yàn)和Fu’sFs檢驗(yàn)及核苷酸錯(cuò)配分布說明，5個(gè)群體近期可能經(jīng)歷過種群擴(kuò)張事件。

金烏賊；細(xì)胞色素氧化酶亞基I；群體遺傳；遺傳多樣性

金烏賊(Sepiaesculenta)俗稱墨魚，主要分布于中國沿海、日本南部沿海、菲律賓群島等海域[1-2]，多群居于暖溫帶淺海性地區(qū)，水深在10～100 m左右。金烏賊成體胴體長約20 cm，體型較大，生命周期多為1 a。產(chǎn)卵季節(jié)多移至淺海，產(chǎn)卵量較大，分多次產(chǎn)卵，1次產(chǎn)卵量約為23～65個(gè)，附著于大型藻類或細(xì)枝、細(xì)繩上[3-4]。金烏賊是我國北方地區(qū)重要的海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)種類，其肉質(zhì)鮮美，營養(yǎng)豐富，墨汁有極高的藥用保健價(jià)值，因而具有極高的市場價(jià)值[5]。近年來，因捕撈量過大，環(huán)境污染，產(chǎn)卵場所被破壞等多種人為原因?qū)е陆馂踬\的資源量急劇下降。為恢復(fù)金烏賊種質(zhì)資源，山東等多地開展了金烏賊的增殖放流工作。

近年來，國內(nèi)已開展了眾多金烏賊相關(guān)的研究，主要包括金烏賊生物學(xué)特性研究[6]、增養(yǎng)殖技術(shù)研究[7]、胚胎發(fā)育研究[8]及遺傳多樣性研究[9]等。而在分子遺傳學(xué)方面做的研究較少，僅Zheng等[9]使用微衛(wèi)星序列對(duì)中日沿海地區(qū)金烏賊群體遺傳變異進(jìn)行過研究。線粒體COI基因因其進(jìn)化速率高，不發(fā)生重組，結(jié)構(gòu)簡單，被廣泛用于頭足類動(dòng)物的分子鑒定和系統(tǒng)學(xué)研究中[10]，但尚未見用于金烏賊群體遺傳學(xué)的相關(guān)報(bào)道。

本研究利用線粒體COI基因作為分子標(biāo)記對(duì)來自中日海域的5個(gè)金烏賊群體的多樣性水平及群體遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，旨在為種質(zhì)資源保護(hù)和合理開發(fā)利用提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

于2005年10月—2006年3月間采集中日沿岸5個(gè)金烏賊群體：其中福井(Fukui)(135°34′E, 35°24′N)群體共22只，長崎(Nagasaki)(129°21′E, 32°30′N)群體共21只，愛媛(Ehime)(132°39′E，33°45′N)群體共25只，愛知(Aichi)(137°03′E，34°31′N)群體共26只，中國日照(Rizhao)(119°21′E，35°05′N)群體共計(jì)29只

(見圖 1)。取小塊胴體部肌肉保存至75%酒精中用于實(shí)驗(yàn)，剩余部分先用10%福爾馬林固定一周后再轉(zhuǎn)至75%的酒精中長期保存[11]。

圖1 金烏賊群體采樣分布點(diǎn)

1.2 DNA提取和PCR擴(kuò)增

取胴體部肌肉約0.1 g，采用改良的十六烷基3甲基溴化銨法(CTAB)法提取DNA并檢測(cè)質(zhì)量。利用COI的通用引物L(fēng)CO1490和HCO2198進(jìn)行PCR擴(kuò)增[12]。反應(yīng)體系為50 μL∶5 μL Buffer，5 μL dNTP，0.25 μLTaq酶，上下游引物各1 μL，36.75 μL dH2O。PCR擴(kuò)增的程序?yàn)椋?4 ℃(3 min)，94 ℃(45 s)，50 ℃(1 min)，72 ℃(1 min)，34個(gè)循環(huán)，72 ℃(15 min)，12 ℃。PCR產(chǎn)物使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)后采用ABI PRISM 377 DNA自動(dòng)測(cè)序儀測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

將得到的雙向序列用SeqMan軟件根據(jù)峰值圖進(jìn)行比對(duì)，拼接矯正[13]。將拼接矯正后的DNA序列導(dǎo)入MEGA 6.0軟件，進(jìn)行ClusterW同源序列比對(duì)，確定序列的長度、 遺傳距離及堿基組成等， 并基于遺傳

距離建立Neighbor-joining(NJ)樹[14]。利用DNAsp計(jì)算堿基突變位點(diǎn)，總?cè)后w及各個(gè)群體的單倍型數(shù)和單倍型指數(shù)，多態(tài)性位點(diǎn)，平均核苷酸差異數(shù)等基因多樣性指數(shù)[15]。使用ARLEQUIN[16]軟件進(jìn)行分子變異方差分析(AMOVA)，并計(jì)算群體內(nèi)及群體間的遺傳分化系數(shù)(Fst)，重復(fù)次數(shù)為10 000次。使用Popart1.7基于TCS法建立單倍型網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖[17]。使用Jmodeltest 2.1分析最佳模型[18]，并用該模型在Mrbeyes軟件中建立貝葉斯樹[19]，結(jié)果在Figtree 1.4中呈現(xiàn)[20]。利用Tajima’D檢驗(yàn)和Fu’sFs檢驗(yàn)來測(cè)試中性假說是否成立，用錯(cuò)配分布來檢測(cè)群體歷史上群體動(dòng)態(tài)是否發(fā)生變化。根據(jù)公式t=τ/ (2μk)計(jì)算種群擴(kuò)張時(shí)間，其中k為序列長度，μ為核苷酸突變的速率。

2 結(jié)果與分析

2.1 金烏賊群體遺傳多樣性分析

測(cè)序得到550 bp左右序列，經(jīng)SeqMan矯正去引物序列后得到454 bp的等長同源序列。利用ClusterW比對(duì)對(duì)金烏賊5個(gè)群體123條COI序列進(jìn)行分析，其中A、T、C、G含量分別為28.3%，36%，19%，16.7%，AT含量明顯高于GC含量，各群體堿基組成相近。123條同源序列中共出現(xiàn)34個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，單突變位點(diǎn)15個(gè)，簡約信息位點(diǎn)19個(gè)；38個(gè)單倍型，其中愛媛群體最多13個(gè)，長崎群體最少9個(gè)，愛知，福井和日照群體各10個(gè)?？?cè)后w的平均單倍型多樣性指數(shù)為0.904，平均核苷酸多樣性為0.007 7，平均核苷酸差異數(shù)為3.490，多樣性指數(shù)均顯示金烏賊的遺傳多樣性相對(duì)較高。金烏賊5個(gè)群體的單倍型多樣性指數(shù)在0.694 6～0.866 7之間，日照群體的單倍型指數(shù)Hd最低，長崎群體的單倍型指數(shù)Hd最高，如表1所示。5個(gè)群體核苷酸多樣性指數(shù)Pi在0.002 9～0.005 1之間，平均核苷酸差異數(shù)K在1.332 3～2.304 8之間。核苷酸多樣性指數(shù)是衡量群體多樣性的一個(gè)重要指標(biāo)，愛知和福井群體的多樣性相對(duì)較低而長崎群體遺傳多樣性最高。

表1 金烏賊各群體遺傳多樣性參數(shù)

Note：①Sampling sites; ②Number of sequence; ③Number of haplotypes; ④Number of transition; ⑤Number of transversion; ⑥Haplotype diversity; ⑦Nucleotide diversity; ⑧Mean number of pairwise differences

2.2 金烏賊群體遺傳結(jié)構(gòu)

中國日照群體與4個(gè)日本群體之間存在顯著遺傳差異。如表2所示，日照群體與4個(gè)日本群體間的遺傳分化系數(shù)在0.642 3～0.725 9之間，顯著大于4個(gè)日本群體相互之間的遺傳分化系數(shù)。愛知群體與其它3個(gè)日本群體的遺傳分化系數(shù)(Fst)在0.207 3～0.300 8之間，且呈顯著水平，大于其它3個(gè)日本群體相互間的遺傳分化系數(shù)。愛媛與福井、長崎及福井之間遺傳分化系數(shù)Fst差異不顯著。各群體之間的遺傳距離也顯示，日照群體與其他4個(gè)日本群體的遺傳距離顯著大于日本群體相互之間的遺傳距離，日照群體與其他4個(gè)群體的遺傳距離在0.012 8～0.014 7之間，而4個(gè)日本群體之間的遺傳距離在0.039～0.052之間，差異不大。

表2 金烏賊群體之間遺傳分化系數(shù)(左下)及遺傳距離(右上)

注：*表示差異顯示，P<0.05。

Note：*Indicates significant level atP<0.05。

單倍型網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖(見圖2)顯示，4個(gè)日本群體以H3和H1為中心聚在一起，而中國日照群體主要以H28為中心呈放射狀分布，H1和H28之間存在5個(gè)堿基的差異。根據(jù)距離法建立NJ樹如圖3所示，NJ樹顯示的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)中日照群體單獨(dú)成一支系，與4個(gè)日本群體形成姐妹支系。4個(gè)日本支系中福井和愛媛先聚為1支，再與愛知聚在一起，最后與長崎群體聚成一支。利用Jmodel test選擇得到的最佳進(jìn)化模型為GTR+I，使用該模型建立貝葉斯系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖4所示，5個(gè)群體的聚類分析可分為2大支系，即中國日照支系(clade CHN)和日本支系(clade JPN)。中國日照群體與日本群體之間存在顯著的遺傳分化，除2個(gè)日照個(gè)體外，其他日照群體均聚成一支。日本支系中因愛知群體與其他3個(gè)日本群體之間存在遺傳分化，而福井、長崎、愛媛3個(gè)群體之間未發(fā)現(xiàn)顯著遺傳結(jié)構(gòu)，聚類分析中日本支系又分為3個(gè)分支系，分支系1 (Subclade 1) 以日本愛媛，福井和長崎3個(gè)群體為主，愛知所占比例較少，分支系2 (Subclade 2) 則以愛知群體為主，部分來自其他四個(gè)群體的個(gè)體，分支系3 (Subclade 3) 則由2個(gè)日照個(gè)體和1個(gè)愛知個(gè)體組成。AMOVA分析中(見表3)，將5個(gè)群體分為1組時(shí)，群體間差異占54.83%，群體內(nèi)差異占45.17%；而將4個(gè)日本群體分成1組，日照群體單獨(dú)分成1組時(shí)，結(jié)果顯示，組間的差異占67.23%，組內(nèi)群體間差異占4.41%，群體間差異占28.37%，進(jìn)一步表明中日群體之間存在顯著的遺傳結(jié)構(gòu)。

圖2 金烏賊5個(gè)群體單倍型網(wǎng)絡(luò)圖

變異來源①自由度②方差總和③變異組分④變異貢獻(xiàn)率⑤群體間⑥4129．341．27607Va??54．83群體內(nèi)⑦118124．041．05123Vb??45．17組間⑧1113．4502．43634Va67．23組內(nèi)群體間⑨314．3130．15968Vb??4．41群體間⑩118121．3141．02808Vc??28．37

注：**表示差異極顯著，P<0.01。

Note：** indicat significant level at P<0.01.

①Source of variation; ②Degree of freedom; ③Sum of squares; ④Variance component; ⑤Percentage variation; ⑥Among population; ⑦Within population; ⑧Among groups; ⑨Among populations within group; ⑩Within groups

圖 3 基于遺傳距離建立的金烏賊群體NJ樹

2.3 金烏賊群體歷史動(dòng)態(tài)性分析

如表4所示，對(duì)金烏賊5個(gè)群體進(jìn)行的Tajima’D和Fu’sFs分析，結(jié)果均為負(fù)值。但是在Tajima’D分析中福井群體和日照群體結(jié)果顯著偏離中性突變，其他3個(gè)群體結(jié)果不顯著；而Fu’sFs顯示，愛知，愛媛和福井群體結(jié)果顯著偏離中性突變，而日照和長崎結(jié)果不顯著。利用ARLEQUIN進(jìn)行錯(cuò)配分析研究群體歷史動(dòng)態(tài)，SSD(Sum of the Square Deviations )和Rag(Raggedness index)的P值都顯著大于0.05，不拒絕群體擴(kuò)張假說。綜上，本文認(rèn)為金烏賊群體歷史上可能經(jīng)歷過種群擴(kuò)張事件。本文采用軟體動(dòng)物COI基因的替代速率為每百萬年2%[21]，由公式t=τ/ (2μk)估算出日本群體的種群擴(kuò)張時(shí)間約在6～10萬年前，而日照群體的擴(kuò)張時(shí)間約為45萬年前。

圖4 基于線粒體COI基因的貝葉斯系統(tǒng)發(fā)生樹

群體PopulatronsτSSD(PSSD)Rag(PRag)Tajima’DFu’sFs福井Fukui1．45310．0016(0．8602)0．0651(0．5270)-1．6397?-6．0127?長崎Nagasaki1．15630．0025(0．8242)0．0340(0．7778)-1．2976-2．5806愛媛Ehime1．86130．0028(0．8102)0．0209(0．9572)-1．4988-7．5911?愛知Aichi1．44340．0071(0．3581)0．0977(0．2095)-1．3982-5．7245?日照Rizhao8．26170．0422(0．5174)0．0935(0．6590)-1．6169?-2．9332

注：*表示差異顯示，P<0.05。

Note:*indicate significant lavel atP<0.05.

3 討論

近年來，分子標(biāo)記技術(shù)如微衛(wèi)星標(biāo)記(SSR)、單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記(SNP)、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性標(biāo)記(AFLP)及線粒體COI基因等已被廣泛應(yīng)用于群體遺傳學(xué)研究中。這些分子標(biāo)記均能較好揭示群體的遺傳多樣性但也有不足之處[22-23]。線粒體COI基因雖為母系遺傳基因，但因其進(jìn)化速率快，靈敏度高，目前仍廣泛使用于群體遺傳學(xué)研究[24-25]。

物種的遺傳變異是進(jìn)化和種群歷史事件平衡的結(jié)果，導(dǎo)致不同群體間同質(zhì)性或者異質(zhì)性的轉(zhuǎn)變。群體內(nèi)和群體間的遺傳變異揭示了物種經(jīng)歷的遺傳與進(jìn)化事件，如基因漂變、種群遷移、自然選擇、種群擴(kuò)張等[26]。物種遺傳變異的高低以遺傳多樣性來反應(yīng)，遺傳多樣性較高的物種對(duì)生態(tài)的適應(yīng)能力強(qiáng)于遺傳多樣性低的物種。本文研究的金烏賊群體的遺傳多樣性相對(duì)較好，甚至高于同科的無針烏賊(Sepiellajaponica)[27]。5個(gè)金烏賊群體中，長崎的遺傳多樣性較高，而愛知和福井的多樣性相對(duì)較差。中國日照群體與日本群體之間有顯著遺傳分化，除2個(gè)個(gè)體外，其它日照個(gè)體全聚為1支，中日群體存在明顯的遺傳結(jié)構(gòu)。在中日群體形成的2大支系中有少數(shù)單倍型在不同支系之間出現(xiàn)交叉，這可能與群體之間的遺傳滲透有關(guān)。日本東北部海岸的愛知群體與日本愛媛、長崎、福井3個(gè)群體之間存在遺傳分化(Fst: 0.207 3～0.300 8)，但愛知群體與其他3個(gè)群體之間遺傳距離差異較小，因此4個(gè)日本群體之間沒有明顯的遺傳結(jié)構(gòu)。

對(duì)于多數(shù)游泳性的海洋生物而言，海洋環(huán)境缺乏有效的屏障，海洋生物的遺傳結(jié)構(gòu)與生物的擴(kuò)散能力有很大關(guān)系[28-29]。金烏賊營底棲生物，卵多附著于淺海海藻、珊瑚或細(xì)枝上，進(jìn)行長距離的運(yùn)動(dòng)能力有限[1]。Tajima’D和Fu’sFs及核苷酸錯(cuò)配分布結(jié)果說明這5個(gè)群體可能經(jīng)歷過歷史上的種群擴(kuò)張事件。日本群體擴(kuò)張時(shí)間在6～10萬年前，日照群體擴(kuò)張約發(fā)生在45萬年前，結(jié)合當(dāng)時(shí)的歷史事件，我們推測(cè)造成這種分布格局的因素可能與冰期事件及金烏賊本身的擴(kuò)散能力有關(guān)。因?yàn)樵摃r(shí)期的冰川作用，很多邊緣海裸露成陸地，大量棲息地喪失，很多海洋動(dòng)物被迫向深海避難所遷移。冰期后，海平面上升，各避難所的種群重新擴(kuò)張，占據(jù)新的棲息地，從而造成了中日之間群體遺傳結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)[30-31]。

4 結(jié)語

中日群體之間有顯著的遺傳結(jié)構(gòu)，愛知、愛媛、福井、長崎群體之間無明顯遺傳結(jié)構(gòu)。此外，本研究也為金烏賊的種質(zhì)資源保護(hù)和增殖放流工作提供了重要啟示。單倍型多樣性是衡量群體遺傳變異的重要指標(biāo)之一。日照群體的單倍型多樣性相對(duì)較差，因此，今后應(yīng)對(duì)該地區(qū)的金烏賊資源進(jìn)行合理保護(hù)和管理。

致謝：感謝日本愛媛縣中予水產(chǎn)試驗(yàn)場清水孝昭先生、愛知縣水產(chǎn)試驗(yàn)場服部克也先生、福井縣水產(chǎn)試驗(yàn)場畑中宏之先生及西海區(qū)水產(chǎn)研究所中川雅弘博士在樣品采集方面提供的幫助。感謝日本海洋地球科學(xué)與技術(shù)局奧谷喬司教授在樣品鑒定上的大力幫助。

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Abstract: Barcoding fragments of mitochondrialcytochromecoxidaseI(COI) gene of 123 individuals from fiveSepiaesculentapopulations along coastal waters of China and Japan was amplified and sequenced to explore the population genetics of this species. After blast analysis, a total length of 454 bp nucleotides was obtained including 34 polymorphic sites (15 singleton sites and 19 parsimony informative sites) and 38 haplotypes. Relative high genetic diversity was detected, and the average haplotypes diversity (Hd) was 0.904, while the nucleotide diversity(Pi) and the average number of nucleotide differences(k) were 0.007 7 and 3.490 respectively. BothFst and genetic distance of five populations indicated that pairwise divergence between China population(Rizhao) and Japan populations was larger than those among Japan populations.Fst and genetic distance between Rizhao and the other four populations were 0.642 9～0.725 9 and 0.012 8～0.014 3 respectively. And genetic differentiation in pairwise Aichi, Ehime, Nagasaki and Fukui was relatively small. All the five populations fall into two major clades which comprised of one Rizhao population and four Japan populations respectively in Haplotypes network and Bayesian phylogenetic tree.Tajima’D, Fu’sFs test and mismatch distributions all suggested that the possibility of historical expansion.

Key words:Sepiaesculenta； mitochondrialCOI； population genetics； genetic diversity

責(zé)任編輯 高 蓓

Population Genetics onSepiaesculenta(Cephalopoda: Sepiida) in the Northwestern Pacific Based on MitochondrialCytochromecOxidaseI

ZHENG Xiao-Dong1, XU Ran1, Minoru Ikeda2, Nobuhiko Taniguchi2

(1. Ocean University of China, Fisheries College, Qingdao 266003, China; 2. Institute of Evolution and Marine Biodiversity, Ocean University of China, Qingdao 266003, China；3. Tohoku University, Graduate School of Agricultural Science, Sendai 981-8555, Japan)

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30600463)資助 Supported by the National Natural Science Foundation of China (30600463)

2017-03-13；

2017-04-19

鄭小東(1971-)，男, 教授。E-mail: xdzheng@ouc.edu.cn

S931.5

A

1672-5174(2017)09-055-07

10.16441/j.cnki.hdxb.20170078

鄭小東， 許然， 池田実, 等. 基于COI基因的西北太平洋金烏賊群體遺傳學(xué)研究[J]. 中國海洋大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2017, 47(9): 55-61.

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