朱芳賢 陳家宏 許海濤

摘要 [目的]探索適宜的地方山羊品種超數(shù)排卵方案。[方法]以黔北麻羊?yàn)樵囼?yàn)動(dòng)物，比較不同品牌促卵泡素（FSH）、相同品牌不同劑量FSH的超數(shù)排卵效果。[結(jié)果]41只黔北麻羊的平均黃體數(shù)14.59個(gè)，平均有效胚數(shù)8.39枚。日本產(chǎn)FSH 20.0 AU/只劑量組平均黃體數(shù)13.90個(gè)，平均有效胚數(shù)10.21 枚；加拿大產(chǎn)FSH 160 mg/只劑量組平均黃體數(shù)14.00個(gè)，平均有效胚數(shù)7.33 枚。[結(jié)論] 日本產(chǎn)FSH的適宜劑量為20.0 AU/只，加拿大產(chǎn)FSH的適宜劑量為160 mg/只，日本產(chǎn)FSH的超數(shù)排卵效果優(yōu)于加拿大產(chǎn)FSH，但差異不顯著。

關(guān)鍵詞 黔北麻羊；超數(shù)排卵；促卵泡素；有效胚

中圖分類號 S826 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）34-0089-03

Abstract [Objective]To explore the optimal superovulation scheme for local goats. [Method] Taking Qianbei brown goat as test amimals， the superovulation effects among different brands of FSH， same brand FSH with different dosages were compared. [Result]

The luteum （CL） number of 41 Qianbei brown goats was 14.59， the number of effective embryos was 8.39.In the group of Japanese FSH with the dose of 20.0 AU/head， the luteum （CL） number was 13.90， the number of effective embryos was 10.21.In the group of 160 mg/head FSH from Canada， the luteum （CL） number was 14.00， the number of effective embryos was 7.33. [Conclusion]The appropriate dose of FSH from Japan was 20.0 AU/head， the suitable dose of FSH from Canada was 160 mg/head， and the superovulation effect of FSH from Japan was better than that of FSH from Canada， but there was no significant difference.

Key words Qianbei brown goat；Superovulation；Folliclestimulating hormone；Effective embryo

黔北麻羊是經(jīng)過長期選育的特色地方山羊品種，具有適應(yīng)性強(qiáng)、抗病力強(qiáng)、耐粗飼和肉質(zhì)優(yōu)良等特點(diǎn)[1]。為了避免在發(fā)展過程中因雜交、近交、環(huán)境變化等造成的優(yōu)良基因流失，開展了貴州良種黔北麻羊保種胚胎收集保存工作。利用冷凍胚胎保存動(dòng)物遺傳資源與其他保存技術(shù)相比具有突出的優(yōu)越性，胚胎保存了品種的全部基因，若有數(shù)量充足的胚胎，可保存與現(xiàn)有物種遺傳多樣性一致的遺傳資源。細(xì)胞可在超低溫條件下長期保存，即使活物消失，只要存在同種物種，通過胚胎移植和核移植技術(shù)就可以恢復(fù)這些遺傳資源，因此在保護(hù)動(dòng)物遺傳資源，尤其是挽救瀕危動(dòng)物方面，冷凍胚胎技術(shù)發(fā)揮著越來越重要的作用[2]。筆者比較了不同品牌FSH、同一品牌不同劑量FSH對黔北麻羊的超數(shù)排卵效果，旨在為提高黔北麻羊品種保存、良種山羊擴(kuò)繁技術(shù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 供體羊

從主產(chǎn)區(qū)挑選純種優(yōu)良黔北麻羊在國家肉羊產(chǎn)業(yè)體系貴陽綜合試驗(yàn)站花溪區(qū)麥坪示范基地開展試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)時(shí)間

2015年9—10月進(jìn)行超數(shù)排卵處理、胚胎回收和胚胎冷凍保存。

1.3 主要藥品與儀器

1.3.1

主要藥品。日本（JP）產(chǎn)FSH（促卵泡素），劑量10 AU/支；加拿大（CAN）產(chǎn)Follitropin FSH，劑量400 mg/支；促黃體素釋放激素A3（促排3號），由寧波三生藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，劑量20 μg/支；氯前列烯醇（PG），由上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所生產(chǎn)，0.2 mg/支；普魯卡因，由北京市永康藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，40 mg/支；黃體酮陰道緩釋劑（CIDR），由新西蘭DEC國際有限公司生產(chǎn)，劑量1.9 g/支。

1.3.2 主要儀器與耗材。體視顯微鏡、羊用二通式?jīng)_卵管、滯留針、集卵杯、恒溫水浴鍋、手術(shù)器械、自制手術(shù)保定架。

1.4 供體超數(shù)排卵處理方案

將供體母羊隨機(jī)分成5組：① Ⅰ 組，注射日本產(chǎn)FSH，劑量為16.0 AU/只；② Ⅱ 組，注射日本產(chǎn)FSH，劑量為20.0 AU，第0天放栓，第9天開始注射，間隔12 h注射1次，注射量依次為3.6、3.2、3.0、2.6、2.4、2.0、1.8、1.4 AU/只，第5次注射時(shí)注射PG 0.2 mg/只，第7次注射時(shí)撤掉CIDR栓；③Ⅲ組，注射日本產(chǎn)FSH，劑量為24.0 AU/只；④Ⅳ組，注射加拿大產(chǎn)FSH，劑量 160 mg/只，第0天放栓，第9天開始注射，間隔12 h注射1次，注射量依次為28、24、22、22、18、18、14、14 mg/只，第5次注射時(shí)注射PG 0.2 mg/只，第7次注射時(shí)撤掉CIDR栓；⑤Ⅴ組，注射加拿大產(chǎn)FSH，劑量 200 mg/只。各試驗(yàn)組放置CIDR和配種時(shí)各注射維生素ADE注射液3 mL，撤栓時(shí)用0.9%生理鹽水沖洗陰道，配種時(shí)注射促排3號3/4支。

1.5 供體羊配種

待觀察到第1次站立發(fā)情12 h后配種，此后間隔10～12 h再配種1次，連續(xù)配種2～3次。

1.6 胚胎的采集與質(zhì)量鑒定

以發(fā)情之日為第0天，第7天采用手術(shù)法回收胚胎。用含1%血清的杜氏磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗兩側(cè)子宮角，每側(cè)20～30 mL 。子宮回流液靜置3～5 min后在實(shí)體顯微鏡下?lián)斐雎炎樱⒈４嬖诒４嬉褐?。根?jù)形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行胚胎分級，通常說的有用胚胎或可移胚胎包括A、B、C級胚胎，由于保種需要，該試驗(yàn)中有效胚胎為A、B級胚胎。分級標(biāo)準(zhǔn)如下：

①A級。胚胎形態(tài)完整，輪廓清晰，呈球形，分裂球大小均勻，結(jié)構(gòu)緊湊，色調(diào)和透明度適中，無附著的細(xì)胞和泡液，變性細(xì)胞少于15%。

②B級。輪廓清晰，色調(diào)及細(xì)胞密度良好，可見到少量附著的細(xì)胞和泡液，變性細(xì)胞少于50%。

③C級。輪廓不清晰，色調(diào)發(fā)暗，結(jié)構(gòu)較為松散，游離的細(xì)胞或泡液較多，變性細(xì)胞少于75%。

④D級。16細(xì)胞以下的受精卵，或有碎片、輪廓不清晰、結(jié)構(gòu)松散，變性細(xì)胞在75%以上。

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用單因素方差分析對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。超數(shù)排卵有效而沖卵失敗的個(gè)體不計(jì)入個(gè)體數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同F(xiàn)SH劑量超數(shù)排卵效果的比較

由表1可知，不同劑量日本產(chǎn)FSH處理中，Ⅱ組超數(shù)排卵效果最佳，平均黃體數(shù)、平均卵泡發(fā)育數(shù)（黃體數(shù)與卵泡數(shù)之和）、平均回收卵數(shù)、卵子回收率、平均有效胚數(shù)、有效胚率（有效胚占回收卵的比例）分別為13.90個(gè)、14.74個(gè)、11.40個(gè)、77%、10.21枚和90%，Ⅲ組平均卵泡發(fā)育數(shù)為22.80個(gè)，極顯著高于 Ⅰ 組和 Ⅱ 組（P<0.01），Ⅲ組平均卵泡數(shù)為3.60個(gè)，高于 Ⅰ 組和 Ⅱ 組（P>0.05）；Ⅰ 組和 Ⅲ 組平均回收卵數(shù)、卵子回收率、平均有效胚數(shù)、有效胚率均低于Ⅱ組，但差異均不顯著（P>0.05）。由表2可知，不同劑量加拿大產(chǎn)FSH處理中Ⅳ組超數(shù)排卵效果最佳，平均黃體數(shù)、平均卵泡發(fā)育數(shù)、平均回收卵數(shù)、卵子回收率、平均有效胚數(shù)、有效胚率分別為14.00個(gè)、15.17個(gè)、7.67個(gè)、51%、7.33枚和96%；Ⅴ組平均卵泡發(fā)育數(shù)（17.25個(gè)）和平均回收卵數(shù)（8.50個(gè)）均高于Ⅳ組，但差異均不顯著（P>0.05）；Ⅴ組卵子回收率、平均有效胚數(shù)、有效胚率均低于Ⅳ組，但差異不顯著（P>0.05）。

2.2 不同品牌FSH超數(shù)排卵效果的比較

由表3可知，加拿大產(chǎn)FSH處理組平均卵泡發(fā)育數(shù)、有效胚率均高于日本產(chǎn)FSH處理組（P>0.05），但平均回收卵數(shù)、卵子回收率、平均有效胚數(shù)均低于日本產(chǎn)FSH處理組（P>0.05），說明日本產(chǎn)FSH的超數(shù)排卵效果優(yōu)于加拿大產(chǎn)FSH。

3 討論

超數(shù)排卵對于供體牛而言是一個(gè)復(fù)雜的生理過程，超數(shù)排卵處理方法通常是根據(jù)供體本身血清激素水平的變化而設(shè)計(jì)的，但對于不同品種、不同個(gè)體和不同藥物，其處理方法也不盡相同，超數(shù)排卵結(jié)果也不一。適宜FSH劑量是獲得最佳超數(shù)排卵效果的關(guān)鍵因素之一。若劑量過高會造成較強(qiáng)的激素應(yīng)答反應(yīng)。劉廣振[3]認(rèn)為較強(qiáng)的激素應(yīng)答反應(yīng)使得部分個(gè)體優(yōu)勢卵泡排卵過早，黃體功能不全，分泌孕酮水平較低，從而造成胚胎退化。譚景和等[4]、范必勤等[5]也認(rèn)為較強(qiáng)的激素應(yīng)答反應(yīng)使得卵巢過度增大，卵泡過度增多，可能卵母細(xì)胞質(zhì)量下降，排卵后卵子未進(jìn)入輸卵管中而直接掉入腹腔，最終卵子回收率低、未受精卵多、可用胚率也很低，A、B級胚胎更少。該試驗(yàn)中日本產(chǎn)FSH大劑量組（24.0 AU/只）、加拿大產(chǎn)FSH大劑量組（200 mg/只）組卵泡發(fā)育多，但回收到的卵子少，尤其是有效胚胎少，可能卵子質(zhì)量差，造成受精率低和退化胚胎多。該試驗(yàn)證實(shí)了以上說法，同時(shí)也說明黔北麻羊適宜FSH劑量為20.0 AU/只的日本產(chǎn)FSH和160 mg/只的加拿大產(chǎn)FSH。

超數(shù)排卵所用激素不同品牌、不同批次也是影響超數(shù)排卵效果的主要因素之一。桑潤滋[6]認(rèn)為，不同品牌、不同批次都存在質(zhì)量差異和效價(jià)不穩(wěn)定，純度及所含促黃體素（LH）活性成分的多少，以及用于不同品種、不同個(gè)體超數(shù)排卵效果也不相同。該試驗(yàn)中日本產(chǎn)FSH超數(shù)排卵效果優(yōu)于加拿大FSH，但差異不顯著，說明日本產(chǎn)FSH更適合貴州黔北麻羊，同時(shí)也建議大規(guī)模進(jìn)行超數(shù)排卵前應(yīng)做預(yù)試驗(yàn)。

4 結(jié)論

該試驗(yàn)中用促卵泡素處理41只貴州黔北麻羊，平均黃體數(shù)14.59個(gè)，平均獲有效胚8.39 枚，日本產(chǎn)FSH的適宜劑量為20.0 AU/只，平均黃體數(shù)13.90個(gè)，平均回收卵數(shù)14.74個(gè)，平均獲有效胚10.21 枚；加拿大產(chǎn)FSH的適宜劑量為160 mg/只，平均黃體數(shù)14.00個(gè)，平均回收卵數(shù)7.67個(gè)，平均獲有效胚7.33 枚；日本產(chǎn)FSH效果優(yōu)于加拿大產(chǎn)FSH，但差異不顯著，說明日本產(chǎn)FSH更適合貴州黔北麻羊，同時(shí)也建議大規(guī)模進(jìn)行超數(shù)排卵前應(yīng)做預(yù)試驗(yàn)。

參考文獻(xiàn)

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[4] 譚景和，秦鵬春.超數(shù)排卵及其存在的問題（綜述）[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，1987（5）：33-37.

[5] 范必勤，熊慧卿，邵春榮.家兔超數(shù)排卵的研究[J].中國養(yǎng)兔雜志，1987（1）：25-30.

[6] 桑潤滋.動(dòng)物繁殖生物技術(shù)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2002：220-225.