蔡天舒 李瑋瑋 梁婷

摘要 [目的]研究經(jīng)不同加工處理后表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌活性的影響，從而為EGCG在食品生產(chǎn)加工中的抑菌應(yīng)用提供依據(jù)。[方法]利用3種不同加工方式對(duì)EGCG進(jìn)行處理，采用最低抑菌濃度測定法（MIC法）與紙片瓊脂擴(kuò)散法（KB法）檢測EGCG的抑菌效果，利用BairdParker平板計(jì)數(shù)法檢測EGCG對(duì)牛奶中金黃色葡萄球菌的抑制效果。[結(jié)果]EGCG抑菌能力隨著濃度的增高而提升。相同濃度下，EGCG經(jīng)過不同加工方式后抑菌能力大小依次為巴氏殺菌法（72 ℃，20 s）>高壓蒸汽滅菌法（121 ℃，15 min）>薄膜過濾法（0.22 μm），最低殺菌濃度（MBC）依次為0.062 5 、0.125 0和1.000 0 mg/mL，經(jīng)巴氏殺菌法處理的EGCG抑菌效果最強(qiáng)。而EGCG在牛奶中的抑菌作用不顯著。[結(jié)論]在多種食品加工條件下，EGCG對(duì)金黃色葡萄球菌具有良好的抑菌活性。

關(guān)鍵詞 表沒食子兒茶素沒食子酸酯；金黃色葡萄球菌；食品加工；牛奶

中圖分類號(hào) TS201.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2017）34-0066-03

Abstract [Objective]To research and find the best treatment mode of Epigallocatechin gallate （EGCG） against Antibacterial Action of Staphylococcus Aureus， which will provide a reference for application of EGCG in food production and processing. [Method]The EGCG were processed in three different ways. Minimal Inhibitory Concentrations（MIC） and KirbyBauer testing measured the antibacterial effect of EGCG. The antibacterial effect of EGCG against S.aureus in milk was measured by the BairdParker Plate Count Method. [Result]The antibacterial capability of EGCG increased with increasing concentration. The antibacterial capacity of EGCG against S.aureus in three different treatments were ordered as Pasteurization （72 ℃， 20 s）>High Pressure Steam Sterilization （121 ℃， 15 min） >Filtration （0.22 μm）， and the minimum bactericidal concentration （MBC） were ordered as 0.062 5 ， 0.125 0 and 1.000 0 mg/mL respectively. It coud be concluded that EGCG treated by pasteurization has the strongest antibacterial activity against S.aureus. However， effect of EGCG against S.aureus in milk was unremarkable. [Conclusion]Under various food processing conditions， EGCG has strong antibacterial capability against S.aureus.

Key words Epigallocatechin gallate （EGCG）； Staphylococcus aureus；Food processing；Milk

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）廣泛分布于自然界中，是最常見的食源性致病菌之一，由腸毒素引發(fā)細(xì)菌性食物中毒，與食品加工和醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域的安全息息相關(guān)[1]。在我國，由金黃色葡萄球菌所引起的食物中毒事件逐年上升，其在乳制品、生鮮牛奶、生肉和水產(chǎn)品等多種食品中均有較高的檢出率，由此引發(fā)的食品安全問題已成為重點(diǎn)研究課題[2-3]。目前主要利用化學(xué)防腐劑如山梨酸、苯甲酸等通過破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)來抑制食品中微生物生長，延長貯藏時(shí)間和保持品質(zhì)[4]。同時(shí)，天然植物型防腐劑的研究和應(yīng)用越來越廣泛，食用安全性和廣譜抗菌能力得到了充分的證實(shí)[5]。

表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）是茶葉中多酚類物質(zhì)的重要活性成分之一，作為一種天然提取物，具有活性強(qiáng)、毒副作用低、安全性良好的特點(diǎn)[6-7]。研究表明，EGCG具有很強(qiáng)的抗氧化、清除自由基、抗腫瘤、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)、抑菌和抑制細(xì)菌毒力的性能[8]。EGCG具有廣譜抑菌能力，對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、腐敗希瓦氏菌等均具有良好的抑制作用[9-10]。目前，針對(duì)EGCG作為食品防腐劑，在不同加工方式下對(duì)其抑菌活性作用的影響，以及EGCG在牛奶中抑菌效果的研究鮮有報(bào)道。因此，筆者以金黃色葡萄球菌為研究對(duì)象，采用高壓蒸汽滅菌法、薄膜過濾法、巴氏殺菌法3種最為主要的食品加工方式對(duì)EGCG進(jìn)行處理，研究不同處理方式對(duì)EGCG抑菌活性的影響，旨在為EGCG在食品加工中的抑菌應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株。金黃色葡萄球菌（ATCC29213）。

1.1.2 培養(yǎng)基。MuellerHinton肉湯、MuellerHinton瓊脂、BirdParker培養(yǎng)基，均購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

1.1.3 試劑和耗材。EGCG（E4143，Sigma），牛奶（市售超高溫滅菌乳），Φ 6 mm無菌空白藥敏紙片（OXOID），96孔板（Thermo），0.22 μm針頭式過濾器（Millipore）。

1.1.4 儀器與設(shè)備。酶標(biāo)儀（邁瑞），微生物培養(yǎng)箱（賓得），麥?zhǔn)媳葷醿x（梅里埃），高壓蒸汽滅菌鍋（博迅）。

1.2 方法

1.2.1 EGCG溶液的配制。分別采用高壓蒸汽滅菌法（121 ℃，15 min）、薄膜過濾法（0.22 μm針頭式過濾器對(duì)所配制的EGCG溶液進(jìn)行過濾處理）、巴氏殺菌法（72 ℃，20 s）3種方式對(duì)2 mg/mL的EGCG溶液進(jìn)行無菌處理，然后使用MH肉湯培養(yǎng)基進(jìn)行梯度稀釋，使其終濃度依次為2.000 0、1.000 0、0.500 0、0.250 0、0.125 0、0.062 5、0.031 3、0.015 7、0.007 8、0.003 9 mg/mL。為保證EGCG溶液質(zhì)量，采取現(xiàn)配現(xiàn)用的方式。

1.2.2 菌液的制備。

將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的金黃色葡萄球菌ATCC29213菌懸液，3 000 r/min離心15 min，棄去上清液，菌體沉淀用生理鹽水復(fù)溶，并將菌懸液調(diào)至0.5麥?zhǔn)蠞岫?，此時(shí)菌懸液濃度約1.0×108 CFU/mL。

1.2.3 EGCG對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌能力的測定。

按照“1.2.1”與“1.2.2”方法制備EGCG溶液與菌懸液，其中菌懸液以1∶10倍稀釋獲得1.0×107 CFU/mL。利用最低抑菌濃度測定法（MIC），采用96孔板，每孔分別對(duì)應(yīng)加入190 μL的10種不同濃度的EGCG溶液和MH肉湯培養(yǎng)基，同時(shí)每孔內(nèi)加入稀釋后的菌液10 μL，使菌液終濃度至5×105 CFU/孔。另設(shè)置不同濃度的EGCG溶液和MH肉湯培養(yǎng)基作空白對(duì)照，置于37 ℃孵育24 h后，利用酶標(biāo)儀在波長600 nm下測定吸光度值。

1.2.4 EGCG對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑的測量。

采用紙片瓊脂擴(kuò)散法（KB法）觀察不同處理方式下EGCG對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用。按照“1.2.1”方法配制10種不同濃度EGCG溶液。將無菌藥敏紙片置于上述10種濃度EGCG溶液中充分浸泡12 h，備用。MH肉湯培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照。用無菌棉簽將濃度為0.5麥?zhǔn)蠞舛鹊木鷳乙壕鶆蛲坎冀臃N于MH瓊脂平板，涂布3次，每次平板旋轉(zhuǎn)60°，最后沿平板內(nèi)沿涂抹一周，室溫干燥3～5 min，用無菌鑷子取藥敏紙片，貼于含菌瓊脂表面。將以上平板37 ℃倒置培養(yǎng)24 h，用游標(biāo)卡尺測量EGCG抑菌圈直徑。

1.2.5 EGCG在牛奶中的抑菌檢測。

將50和25 mg EGCG粉末分別加入99 mL牛奶中，使其終濃度分別為0.50和0.25 mg/mL，并進(jìn)行巴氏消毒處理。同時(shí)將1 mL金黃色葡萄球菌液（1.0×107 CFU/mL）加入牛乳中充分混勻，菌液終濃度為1.0×105 CFU/mL。 對(duì)照組僅將1 mL菌液加入99 mL牛奶中，不添加EGCG粉末，充分混勻。將上述試驗(yàn)組和對(duì)照組牛奶于37 ℃靜置培養(yǎng)，并分別于0、2、4、6、8、 10、12 h取出培養(yǎng)物，按照GB 4789.10—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》中的第二法BairdParker平板計(jì)數(shù)法檢測牛奶中金黃色葡萄球菌的數(shù)量，從而測定EGCG在牛奶中的抑菌效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 EGCG對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌能力 最低殺菌濃度（MBC）指抗菌藥物完全殺滅細(xì)菌所需要的最低濃度，是衡量藥物抗菌活性大小的重要指標(biāo)[11]。該研究利用不同加工方式處理EGCG后，其對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果如表1所示。通過對(duì)比研究表明，隨著EGCG濃度的增加，其抑菌效果逐步增強(qiáng)；巴氏殺菌法、高壓蒸汽滅菌法和薄膜過濾法MBC分別為0.062 5、0.125 0和1.000 0 mg/mL；當(dāng)EGCG濃度為0.062 5 mg/mL時(shí)，巴氏殺菌法抑菌率為100%，而高壓蒸汽滅菌法為59%，薄膜過濾法僅為45%；當(dāng)采用EGCG最低檢測濃度0.003 9 mg/mL時(shí)，巴氏殺菌法處理后EGCG抑菌能力降至21%，高壓蒸汽滅菌法為18%，薄膜過濾法僅為4%。由以上結(jié)果可看出，經(jīng)過巴氏殺菌法處理的EGCG對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌活性優(yōu)于高壓蒸汽滅菌法和薄膜過濾法。

2.2 EGCG對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑的測量

采用紙片瓊脂擴(kuò)散法（KB法）進(jìn)一步測定不同加工處理方式對(duì)EGCG抑制金黃色葡萄球菌的能力。結(jié)果顯示（表2），巴氏殺菌法>高壓蒸汽滅菌法>薄膜過濾法。其中巴氏殺菌法（72 ℃，20 s）作用下的EGCG抑菌效果最好，其濃度為2.000 0、1.000 0、0.500 0和0.250 0 mg/mL時(shí)，均可見明顯的透明抑菌圈，表現(xiàn)出顯著的抑菌能力，此后隨著EGCG濃度的降低，其抑菌活性也隨之下降，當(dāng)濃度降至0.031 3 mg/mL時(shí)，抑菌圈完全消失。EGCG經(jīng)過高壓蒸汽滅菌法和薄膜過濾法處理后，抑菌圈分別在濃度為0.062 5和0.125 0 mg/mL時(shí)完全消失。

2.3 EGCG在牛奶中對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果 根據(jù)上述不同處理方式對(duì)EGCG抑菌能力影響的結(jié)果，選擇巴氏殺菌法檢測EGCG在牛奶中對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果。由于EGCG在濃度0.500 0和0.250 0 mg/mL時(shí)對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制率均達(dá)100%，且具有明顯抑菌圈，故選擇這2個(gè)濃度條件下研究EGCG在牛奶中的抑菌效果。研究結(jié)果顯示（圖1），當(dāng)金黃色葡萄球菌初始濃度為105 CFU/mL時(shí)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，對(duì)照組與試驗(yàn)組中金黃色葡萄球菌數(shù)量均呈現(xiàn)上升趨勢，至12 h時(shí)，對(duì)照組中金黃色葡萄球菌的數(shù)量達(dá)到109 CFU/mL，而分別加入0.500 0與0.250 0 mg/mL的EGCG試驗(yàn)組牛奶中的菌落數(shù)分別為6.3×108和6.5×108 CFU/mL。雖然試驗(yàn)組菌落數(shù)相比對(duì)照組略有降低，但無顯著性差異。由此可見，EGCG在牛奶中對(duì)金黃色葡萄球菌無顯著抑制效果。

3 結(jié)論與討論

金黃色葡萄球菌污染食品后導(dǎo)致其腐敗變質(zhì)，并產(chǎn)生腸毒素引起食源性中毒和胃腸炎癥，是引起細(xì)菌性食物中毒的主要原因之一[12]。當(dāng)食物中金黃色葡萄球菌濃度為105～106 CFU/g時(shí)，即可產(chǎn)生足夠濃度的腸毒素進(jìn)而使易感人群出現(xiàn)中毒癥狀[13]。EGCG作為食品抗氧化劑茶多酚的主要生物活性成分之一，其抗氧化能力和清除自由基能力最強(qiáng)，同時(shí)對(duì)促進(jìn)人體健康有積極作用，如抑制細(xì)菌生長、調(diào)節(jié)血脂、抵抗腫瘤、抑制肥胖等[14]。

為探究EGCG作為食品添加劑在多種食品加工和無菌處理環(huán)節(jié)中的生物活性，該研究以金黃色葡萄球菌為目標(biāo)菌，EGCG經(jīng)高壓蒸汽滅菌、巴氏殺菌和薄膜過濾處理后，均具有較強(qiáng)的抑菌效果與殺菌能力。不同處理方式對(duì)EGCG活性具有一定的影響，其抑菌能力由大到小依次為巴氏殺菌>高壓蒸汽滅菌>薄膜過濾法。其中巴氏殺菌法處理方式下的EGCG抑菌活性效果最強(qiáng)，其MBC為0.062 5 mg/mL，當(dāng)采用最低EGCG濃度（0.003 9 mg/mL）時(shí)，其抑菌率仍為21%。EGCG常溫下在水溶液中的溶解性較差，巴氏殺菌法通過72 ℃加熱20 s，適當(dāng)?shù)亩虝r(shí)高溫使難溶性于水的EGCG在培養(yǎng)基中的溶解能力增強(qiáng)，抑菌能力提升。EGCG經(jīng)過高壓蒸汽滅菌后后對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制能力下降。李邦玉等[15]通過紫外可見光譜法研究發(fā)現(xiàn)，EGCG在高溫條件下會(huì)發(fā)生部分降解。在薄膜過濾法中，由于EGCG水溶性差，過濾時(shí)在0.22 μm無菌濾膜中有附著殘留，降低了實(shí)際有效抑菌濃度，導(dǎo)致其抑菌能力下降。由此可見，EGCG在溶劑中的溶解能力是影響其抑菌生物活性的重要原因，抑菌活性隨著溶解性的增大而增強(qiáng)，并呈現(xiàn)劑量依賴模式，這與申羽佳等[16]的研究結(jié)果是一致的。

EGCG在食品中的抑菌應(yīng)用研究鮮有報(bào)道。駱曉波[17]制備了EGCG納米脂質(zhì)體與EGCG納米脂質(zhì)體可食用膜并將其應(yīng)用于鱈魚保鮮，有效延長了保藏期，EGCG表現(xiàn)出良好的抑菌效果。同時(shí)有研究表明，茶多酚可應(yīng)用于三文魚[18]、微凍鯽魚[19]等食品的貯藏保鮮和抑菌，而EGCG作為茶多酚的主要活性成分，也必然發(fā)揮重要的抑菌功能。然而該研究發(fā)現(xiàn)，EGCG在牛奶中的抑菌效果不顯著。研究發(fā)現(xiàn)，EGCG通過破壞細(xì)菌細(xì)胞膜、細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)或抑制生長代謝相關(guān)酶類活性，導(dǎo)致細(xì)菌結(jié)構(gòu)變形和生長抑制甚至死亡[20-21]。而牛奶中的酪蛋白可與綠茶中EGCG等多酚類活性物質(zhì)結(jié)合，致其抗菌能力減弱[22-23]。這可能是導(dǎo)致EGCG在牛奶中抑菌效果不顯著的主要原因之一。

鑒于EGCG在多種無菌化加工處理后仍具有優(yōu)良的抑菌活性，在下一步作為食品添加劑的實(shí)際應(yīng)用中，應(yīng)考慮食物自身潛在的EGCG拮抗成分，以便實(shí)現(xiàn)合理、有效的應(yīng)用。該研究為EGCG作為抑菌劑在食品防腐保鮮、生物防控以及藥物開發(fā)應(yīng)用奠定了重要基礎(chǔ)。

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