張鶴+趙飛+高廣慧

摘 要：本文采用超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜檢測(cè)南瓜子中泛酸含量的方法，并進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。樣品經(jīng)а-淀粉酶酶解后，調(diào)節(jié)提取液的pH值，沉淀蛋白后，經(jīng)石油醚除油后，采用ACQUITY UPLC C18（50mm×2.1mm，1.7μm）色譜柱梯度洗脫分離，用超高效液相色譜電噴霧離子源串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜檢測(cè)，可在2.5 min內(nèi)完成一批次待測(cè)液的檢測(cè)。泛酸在0.05-5 μg/mL范圍內(nèi)有良好的線性，相關(guān)系數(shù)大于0.999，回收率在97.8 %～107 %之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.5 %～6.0 %。研究結(jié)果表明，該方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，可快速檢測(cè)南瓜子中泛酸的含量。

關(guān)鍵詞：泛酸；超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜；南瓜子

中圖分類號(hào)：D919 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1671-2064（2017）11-0041-03

隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步和經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展，人們的飲食文化也呈現(xiàn)多樣化發(fā)展的趨勢(shì)，對(duì)于食品的攝入不僅要求健康安全，同時(shí)要求食物帶來(lái)更多的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充。維生素是人體必須的營(yíng)養(yǎng)成分，因此全面建立食品中維生素的檢測(cè)方法顯得尤為重要。

泛酸又稱“遍多酸”，是維生素B族的一種。它廣泛存在于多種干果食品中。目前泛酸的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法、微生物法。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)保健食品、嬰幼兒配方食品和乳粉中泛酸的檢測(cè)采用高效液相色譜法，其余食品中泛酸的檢測(cè)采用GB/T 5009.210-2008微生物法，沒有理化檢測(cè)方法，因此本研究中以南瓜子為例，建立了南瓜子中泛酸的檢測(cè)方法，意在為食品加工和生產(chǎn)領(lǐng)域選擇原材料及優(yōu)化加工流程提供支持；同時(shí)可為檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)進(jìn)行干果及其制品中泛酸檢測(cè)做參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Acquity UPLC-Xevo TQD型超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀、BEH C18 1.7μm 2.3×50mm色譜柱 美國(guó)WATERS公司；高速冷凍離心機(jī)美國(guó)Thermo公司；渦旋混合儀 德國(guó)IKA公司；分析天平德國(guó)Sartorius公司。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：泛酸鈣（純度>98.0%）美國(guó)SUPELCO公司；

甲酸（色譜純）美國(guó)Sigma公司；乙腈（色譜純）美國(guó)Fisher公司；а-淀粉酶（生物試劑）AOBOX公司活度3.7U/mg；鹽酸（分析純） 北京化學(xué)試劑研究所；硫酸鋅（分析純）國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；石油醚（分析純）國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)用水均為一級(jí)水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱取泛酸鈣標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)適量，用水溶解并定容至10mL，配制成1.0mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3 樣品前處理

分別準(zhǔn)備未經(jīng)加工處理和經(jīng)加工處理的南瓜子若干。未經(jīng)加工處理的南瓜子是由超級(jí)市場(chǎng)購(gòu)買的南瓜中取出南瓜子，并經(jīng)洗凈、晾干、去皮處理，經(jīng)加工的南瓜子購(gòu)于超級(jí)市場(chǎng)，并經(jīng)去皮處理，并于粉碎機(jī)中粉碎均勻。

稱取粉碎均勻的南瓜子樣品5g（精確至0.0001g）于50mL離心管中，向離心管中依次加入0.2gа-淀粉酶、20mL40-50℃溫水，渦旋半分鐘后，置于50-60℃水浴中震蕩酶解40min，待酶解完成放至室溫，用鹽酸溶液調(diào)節(jié)酶解液的pH值至4.5±0.1，向其中再加入5mL硫酸鋅溶液，靜置30min，5000r/min離心10min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一50mL離心管，用水定容至30mL。向離心管中加入10mL石油醚（沸程為30-60℃），渦旋半分鐘，靜置分層，棄去上層，下層重復(fù)上述操作兩次，下層清液稀釋10倍后，經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾至棕色進(jìn)樣瓶中待測(cè)。

1.4 UPLC色譜條件

色譜柱：C18 1.7μm 2.1×50mm；柱溫：30℃；樣品室溫度：10℃；進(jìn)樣量：5μL；流動(dòng)相：A相：乙腈、B相：0.1%甲酸溶液，梯度洗脫條件見表1。

1.5 MS/MS質(zhì)譜條件

電噴霧離子源；正離子模式；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；毛細(xì)管電壓2.0KV；離子源溫度150℃；脫溶劑氣溫度500℃；錐孔氣流量50L/h；脫溶劑氣流量800L/h。泛酸的定量和定性離子對(duì)、錐孔電壓和碰撞能量參數(shù)見表2。

2 結(jié)果與討論

2.1 線性關(guān)系及相關(guān)系數(shù)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明泛酸濃度在0.05-5μg/mL范圍內(nèi)與其定量離子對(duì)的峰面積響應(yīng)值具有良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=42552x+1796.3，相關(guān)系數(shù)為0.9991。

2.2 方法精密度與樣品溶液穩(wěn)定性

取回收率試驗(yàn)一點(diǎn)每日連續(xù)進(jìn)樣6次，檢測(cè)3次，測(cè)得結(jié)果見表3，結(jié)果符合分析要求，方法精密度良好，處理后的樣品溶液在室溫避光放置4天對(duì)測(cè)定結(jié)果無(wú)影響。

2.3 回收率

取已知含量的南瓜子樣品，進(jìn)行三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)添加水平（分別向樣品中添加相當(dāng)于泛酸0.3、0.6、0.9mg的標(biāo)準(zhǔn)溶液）的回收率實(shí)驗(yàn)，每個(gè)回收率添加水平平行進(jìn)行6份，分別計(jì)算加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表4。泛酸的三個(gè)水平加標(biāo)回收率在97.8-107%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.5-6.0%，滿足實(shí)際樣品分析需求。

2.4 實(shí)際樣品檢測(cè)

分別將粉碎均勻的經(jīng)加工和未經(jīng)加工的南瓜子按照本文建立的方法進(jìn)行預(yù)處理并且測(cè)定，計(jì)算結(jié)果見表5。

3 結(jié)果與討論

3.1 樣品前處理的優(yōu)化

南瓜子樣品含有大量蛋白質(zhì)、脂肪，同時(shí)含有淀粉，為使處理得到的待測(cè)液雜志含量較低、干擾較少，本文中針對(duì)不同的雜質(zhì)采用了不同的除雜方法。先后加入了淀粉酶、硫酸鋅溶液、調(diào)節(jié)待測(cè)液pH值、石油醚，分別分解樣品中的淀粉、除蛋白質(zhì)、除脂肪，效果較好。

3.2 色譜條件優(yōu)化

分別采用乙腈-水和乙腈-0.1%甲酸溶液作為流動(dòng)相，檢測(cè)同一濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，結(jié)果顯示加入甲酸的流動(dòng)相因甲酸的存在使得待測(cè)液中泛酸的離子化效率更高，響應(yīng)更好，因此選擇后者作為流動(dòng)相。同時(shí)調(diào)整了流動(dòng)相梯度洗脫程序，獲得較好的峰形和響應(yīng)值。

3.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

本方法采用質(zhì)譜直接進(jìn)樣，查找定性定量離子對(duì)的方式，分別優(yōu)化了錐孔電壓、碰撞電壓、脫溶劑氣流量、錐孔氣流量等條件，最終確定條件見表。

4 取得成果及創(chuàng)新點(diǎn)

通過(guò)研究建立了超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)南瓜子中泛酸含量的方法，并用該方法檢測(cè)了經(jīng)加工和未經(jīng)加工的南瓜子中泛酸的含量。該法準(zhǔn)確度高，精密度好，為食品中泛酸含量的檢測(cè)提供了技術(shù)支持。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)及取得的成果主要有以下幾方面：

（1）建立了南瓜子中泛酸檢測(cè)的樣品前處理方法，通過(guò)查閱文獻(xiàn)資料，我們發(fā)現(xiàn)食品中泛酸的檢測(cè)除嬰幼兒食品和乳品可采用微生物法和高效液相色譜法外，其余均使用微生物法。而本研究建立的方法采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜，多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)方式大大提高了選擇性和靈敏度，該法重現(xiàn)性好，處理操作簡(jiǎn)單。

（2）本研究采用串聯(lián)四極桿質(zhì)譜檢測(cè)南瓜子中泛酸的含量，通過(guò)定性離子與定量離子的豐度比對(duì)檢出成分進(jìn)行定性確證，再通過(guò)定量離子的響應(yīng)強(qiáng)度對(duì)樣品中泛酸的含量進(jìn)行定量分析。此法較液相色譜法通過(guò)保留時(shí)間進(jìn)行定性更為準(zhǔn)確可靠，選擇性更高；同時(shí)采用多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)，使得靈敏度更高。

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