黃偉鵬+黃燕芬+陳建真+金波+譚佳寧+丁志山

[摘要] 查爾酮類化合物是一種廣泛存在于多種藥用植物中的黃酮類化合物，具有抑制細(xì)胞成脂分化的作用。為研究山核桃葉中提取分離得到的球松素查爾酮對(duì)小鼠胚胎間充質(zhì)干細(xì)胞（C3H10T1/2）成脂分化的影響，該實(shí)驗(yàn)利用MTS[3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-5-（3-carboxymethoxyphenyl）-2-（4-sulfophenyl）- 2H-tetrazolium，內(nèi)鹽]法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況；油紅O染色和異丙醇萃取法檢測(cè)細(xì)胞成脂分化情況；GAP-PAP酶法檢測(cè)細(xì)胞中甘油三酯含量；分別采用熒光RT-PCR和Western blot檢測(cè)成脂分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ），CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α （C/EBPα）和分化標(biāo)志物脂肪型脂肪酸結(jié)合蛋白（FABP4） mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示當(dāng)球松素查爾酮濃度小于等于50 μmol·L^-1，對(duì)C3H10T1/2細(xì)胞的增殖活性無(wú)影響；油紅O染色和異丙醇萃取法及GAP-PAP酶法檢測(cè)結(jié)果表明球松素查爾酮能明顯減少C3H10T1/2細(xì)胞成脂分化和甘油三酯含量；熒光RT-PCR和Western blot檢測(cè)表明球松素查爾酮能下調(diào)FABP4，PPARγ和C/EBPα mRNA和蛋白的表達(dá)（P<0.05或P<0.01）。結(jié)果提示，球松素查爾酮能夠明顯抑制C3H10T1/2細(xì)胞成脂分化。

[關(guān)鍵詞] 球松素查爾酮； 成脂分化

[Abstract] Chalcones is a flavonoid wildly presented in many herbs. It has the effect to inhibit cells adipogenic differentiation. In order to study the effect of pinostrobin chalcone extracted and isolated from leaves of hickoryes on the adipogenic differentiation of murine embryonic mesenchymal stem cell （C3H10T1/2）， MTS [3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-5-（3-carboxymethoxyphenyl）-2-（4-sulfophenyl）- 2H-tetrazolium] method was used to detect the cell proliferation； adipogenic differentiation was characterized by oil red O staining and isopropanol extraction； the triglyceride content was detected by GAP-PAP enzyme method； and the C3H10T1/2 cell differentiation into adipocytes was also examined by the mRNA and protein expression of PPARγ， C/EBPα and FABP4 by RT-PCR and Western blot respectively. Results indicated that pinostrobin chalcone almost had no effect on cell proliferation activity when the concentration was less than or equal to 50 μmol·L^-1； the oil red O staining， isopropanol extraction and GAP-PAP enzyme method showed that pinostrobin chalcone significantly decreased the C3H10T1/2 adipogenic differentiation and triglyceride content in the cytoplasm of adipocytes； the RT-PCR and Western blot analysis showed that pinostrobin chalcone can down-regulate the mRNA and protein levels of FABP4， PPARγ and C/EBPα in C3H10T1/2 cells（P<0.05 or P<0.01）. The experiment results suggest that pinostrobin chalcone can inhibit C3H10T1/2 adipogenic differentiation.

[Key words] pinostrobin chalcone； adipogenic differentiation

隨著生活水平提高，肥胖已經(jīng)成為影響人類健康的重要因素。肥胖癥是由于脂肪細(xì)胞過(guò)度分化和脂肪顆粒在脂肪細(xì)胞中過(guò)度沉積而引起的慢性炎癥性疾病[1]。肥胖被視為心腦血管疾病、2型糖尿病、消化系統(tǒng)疾病等的危險(xiǎn)因素[2]。間充質(zhì)干細(xì)胞是一類可進(jìn)行自我復(fù)制并能向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等多方向分化的成體干細(xì)胞[3]。間充質(zhì)干細(xì)胞受PPARγ和CCAAT調(diào)節(jié)/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白（C/EBP）等轉(zhuǎn)錄因子的影響，導(dǎo)致脂結(jié)合蛋白4、脂聯(lián)素等成脂分化標(biāo)志基因表達(dá)增加，進(jìn)而使胞內(nèi)甘油三酯逐步累積，形成脂肪細(xì)胞[4]。

球松素查爾酮是本實(shí)驗(yàn)室從山核桃葉總黃酮中分離[5]，同時(shí)還公開(kāi)了山核桃葉提取物制備用于預(yù)防或治療雌激素分泌不足相關(guān)疾病藥物的新用途的一項(xiàng)發(fā)明專利[6]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，查爾酮類化物具有抑制細(xì)胞成脂分化的作用[7]。提示山核桃葉總黃酮中的球松素查爾酮可能具有減肥的功效。本實(shí)驗(yàn)旨在研究球松素查爾酮對(duì)C3H10T1/2細(xì)胞成脂分化的影響，為黃酮類化合物治療肥胖相關(guān)疾病提供理論基礎(chǔ)和藥物來(lái)源。

1 材料

1.1 細(xì)胞株 C3H10T1/2細(xì)胞株，購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。

1.2 藥物與試劑 球松素查爾酮為本實(shí)驗(yàn)室提取[8]（浙江中醫(yī)藥大學(xué)分子遺傳研究所制備，純度達(dá)99.4%）；DMEM高糖培養(yǎng)液（杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司）；無(wú)支原體胎牛血清、牛胰島素、地塞米松、羅格列酮、油紅O（美國(guó)Sigma公司）；MTS（美國(guó)Promega公司）；甘油三酯試劑盒（南京建成科技有限公司）；TRizol（美國(guó)Invitrogen公司）；cDNA第1鏈合成試劑盒（日本Takara公司）；PCR上下游引物均由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成，見(jiàn)表1。

1.3 儀器 AR1140電子天平（美國(guó)奧豪斯公司）；SW-CJ-1F超凈工作臺(tái)（蘇凈集團(tuán)安泰公司）；ECLIPSE Ti-DH熒光倒置顯微鏡（日本尼康公司）；MQX 200酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTeK公司）；StepOne Plus Real-Time PCR System（美國(guó)Applied Biosystems公司）；凝膠成像儀（美國(guó)Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 C3H10T1/2細(xì)胞培養(yǎng) 使用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，于37 ℃，5%CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合至80%左右時(shí)，按1∶3傳代。

2.2 MTS檢測(cè)球松素查爾酮對(duì)細(xì)胞增殖抑制的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期C3H10T1/2細(xì)胞密度稀釋至1×104個(gè)/mL細(xì)胞懸液，按100 μL/孔接種于96孔板，在5%CO₂，37 ℃培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞融合度達(dá)80%左右，繼續(xù)培養(yǎng)于含有不同濃度的球松素查爾酮（20，40，60，80，100 μmol·L^-1）培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h。每孔加入20 μL MTS孵育2 h，在490 nm波長(zhǎng)處用酶標(biāo)儀測(cè)量吸光度。

2.3 C3H10T1/2細(xì)胞成脂分化誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期C3H10T1/2細(xì)胞密度稀釋至1×104個(gè)/孔的細(xì)胞懸液接種到24孔板中，于37 ℃，5%CO₂飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2～3 d，待細(xì)胞融合達(dá)到接觸抑制后，加入含球松素查爾酮的分化誘導(dǎo)劑A（1.0 μmol·L^-1地塞米松，10 mg·L^-1胰島素，1.0 μmol·L^-1羅格列酮[9]），3 d后更換含球松素查爾酮的成脂誘導(dǎo)液B（10 mg·L^-1胰島素，1.0 μmol·L^-1羅格列酮）進(jìn)行維持，之后每隔24 h換1次含藥誘導(dǎo)液B，誘導(dǎo)10 d后檢測(cè)。

2.4 油紅O染色檢測(cè)及半定量分析 油紅O用無(wú)水異丙醇配制成0.5%（W/V）儲(chǔ)存液，使用時(shí)與雙蒸水按3∶2配制成工作液。用預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞2次，福爾馬林固定液在室溫下固定30 min。棄去固定液，用PBS清洗2次，加入油紅O染色液于室溫下染色30 min，PBS清洗非特異性結(jié)合染料，于倒置顯微鏡下拍照；吸出孔中液體并在每孔加入200 μL（24孔板）無(wú)水異丙醇，使脂滴結(jié)合的油紅O全部被溶解，于500 nm處測(cè)吸光度。

2.5 甘油三酯含量 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期C3H10T1/2細(xì)胞，按5×104個(gè)/孔的密度接種到6孔板中，成脂誘導(dǎo)第10天用胰酶將細(xì)胞消化下來(lái)，12 000 r·min^-1離心5 min，棄上清，加入100 μL細(xì)胞裂解液，于冰上裂解30 min，測(cè)定蛋白濃度，按試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定甘油三酯含量。

2.6 熒光定量PCR檢測(cè) C3H10T1/2細(xì)胞成脂分化誘導(dǎo)10 d后（同2.5項(xiàng)），Trizol法抽提細(xì)胞總RNA。按照TaKaRa試劑盒步驟合成cDNA。通過(guò)熒光定量PCR對(duì)PPARγ，C/EBPα，F(xiàn)ABP4和GAPDH的mRNA表達(dá)進(jìn)行分析。反應(yīng)體系包括cDNA 0.5 μL，SYBR Premix EX TaqTMⅡ 10 μL，F(xiàn)orward primer 1 μL，Reverse primer 1 μL，ddH₂O 7.5 μL，總體積20 μL。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，共35個(gè)循環(huán)。根據(jù)公式2-ΔΔC t計(jì)算PPARγ，C/EBPα，F(xiàn)ABP4的相對(duì)表達(dá)量。

2.7 Western blot檢測(cè)C3H10T1/2細(xì)胞成脂分化 誘導(dǎo)10 d后（同2.5項(xiàng)），收集各組細(xì)胞，加入適量的裂解液，放冰上裂解30 min，12 000 r·min^-1 4 ℃離心15 min，取上清得總蛋白，用BCA試劑盒對(duì)樣品進(jìn)行濃度測(cè)定；取40 μg蛋白樣品上樣到10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，以濕轉(zhuǎn)法將蛋白印跡至硝酸纖維素膜上，以FABP4，PPARγ，C/EBPα和β-actin抗體4 ℃孵育過(guò)夜，加入二抗室溫孵育1.5 h，化學(xué)發(fā)光液顯影，凝膠電泳成像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。以蛋白的灰度值/β-actin灰度值表示。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)以±s表示，采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)分析采用單因素方差分析。

3 結(jié)果

3.1 球松素查爾酮對(duì)C3H10T1/2細(xì)胞增殖的影響 與空白組相比，高濃度的球松素查爾酮都能顯著地降低C3H10T1/2細(xì)胞的增殖活性，而當(dāng)其濃度較低時(shí)，幾乎對(duì)C3H10T1/2細(xì)胞的增殖活性無(wú)影響。具體表現(xiàn)為：球松素查爾酮濃度≥60 μmol·L^-1時(shí)，能顯著抑制細(xì)胞的增殖活性（P<0.05或P<0.01），且呈劑量依賴性。因此，在此基礎(chǔ)上選擇5，10，30，50 μmol·L^-1濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，見(jiàn)圖1。

3.2 球松素查爾酮對(duì)C3H10T1/2細(xì)胞成脂分化的影響 不同濃度的球松素查爾酮處理C3H10T1/2細(xì)胞，成脂誘導(dǎo)10 d后，油紅O染色觀察?？瞻捉M幾乎無(wú)油紅O著色；誘導(dǎo)組被油紅O染為鮮紅色；球松素查爾酮30，50 μmol·L^-1組油紅O染色較誘導(dǎo)組明顯減少。這與酶標(biāo)儀測(cè)定的吸光度分析結(jié)果較為一致，見(jiàn)圖2和圖3。

3.3 球松素查爾酮對(duì)C3H10T1/2細(xì)胞成脂分化后甘油三酯含量的影響 不同濃度的球松素查爾酮處理C3H10T1/2細(xì)胞，成脂誘導(dǎo)10 d后，GAP-PAP酶法檢測(cè)甘油三酯含量。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析可知，與誘導(dǎo)組相比，球松素查爾酮50 μmol·L^-1組能顯著降低細(xì)胞中甘油三酯的含量（P<0.05或P<0.01），見(jiàn)圖4。

3.4 球松素查爾酮對(duì)C3H10T1/2細(xì)胞成脂分化標(biāo)志因子及關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子mRNA表達(dá)的影響 與誘導(dǎo)組相比，球松素查爾酮50 μmol·L^-1組能顯著降低成脂分化標(biāo)志因子FABP4、關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子PPARγ，C/EBPα mRNA的表達(dá)（P<0.01），見(jiàn)表2。

3.5 球松素查爾酮對(duì)C3H10T1/2細(xì)胞成脂分化標(biāo)

志因子及關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子蛋白表達(dá)的影響 與誘導(dǎo)組相比，球松素查爾酮50 μmol·L^-1組顯著降低PPARγ和C/EBPα蛋白的表達(dá)（P<0.05或P<0.01）；球松素查爾酮30，50 μmol·L^-1組顯著降低FABP4蛋白的表達(dá)（P<0.05或P<0.01）；從以上結(jié)果可得出，球松素查爾酮能夠減少成脂關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子PPARγ，C/EBPα和成脂分化標(biāo)志因子FABP4蛋白的表達(dá)，見(jiàn)圖5。

4 討論

間充質(zhì)干細(xì)胞在誘導(dǎo)分化為成熟脂肪細(xì)胞的過(guò)程中會(huì)受到諸多轉(zhuǎn)錄因子的多重調(diào)控，之后一系列脂肪組織特異性基因依次被激活表達(dá)，接著經(jīng)過(guò)蛋白水平的復(fù)雜調(diào)控后分化為成熟脂肪細(xì)胞。在誘導(dǎo)分化過(guò)程中，過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）和CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白（C/EBPs）是與成脂相關(guān)最主要的2類轉(zhuǎn)錄因子，它們?cè)诔芍只^(guò)程中發(fā)揮著決定性作用。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，一些黃酮類藥物能夠通過(guò)激活ERK信號(hào)通路、抑制MAPK信號(hào)通路調(diào)控，抑制AKT的磷酸化來(lái)下調(diào)PPARγ和C/EBPα的表達(dá)達(dá)到抑制前脂肪細(xì)胞分化的效果[10]。楊蕾等人發(fā)現(xiàn)番石榴葉天然成分槲皮素-3-O-（6″-阿魏酸）-β-D-吡喃半乳糖苷能夠劑量依賴性地抑制成脂分化，并且降低絲氨酸蛋白酶脂肪因子adipsin，CCTTA增強(qiáng)子結(jié)合蛋白C/EBPα和PPARγ mRNA及后兩者蛋白表達(dá)[11]。

PPARγ被認(rèn)為是脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中必需的轉(zhuǎn)錄因子；若機(jī)體中缺少PPARγ，脂肪細(xì)胞內(nèi)部的脂滴將無(wú)法積累，進(jìn)而引發(fā)一系列脂營(yíng)養(yǎng)不良的疾病，甚至?xí)?dǎo)致早期胚胎致死[12]；C/EBPs在脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中是首個(gè)被證明具有重要作用的轉(zhuǎn)錄因子，具有特異性激活靶基因增強(qiáng)子CCAAT的功能[13]。研究表明，C/EBPα作為C/EBPs的亞型在成脂分化后期發(fā)揮作用，若缺失C/EBPα的小鼠出生后脂肪細(xì)胞會(huì)大量減少，最終死于低血糖。過(guò)表達(dá)C/EBPα基因會(huì)縮短3T3-L1前體脂肪細(xì)胞分化為成熟脂肪細(xì)胞；相反，過(guò)低表達(dá)C/EBPα基因RNAi則會(huì)阻斷此分化。在脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中，C/EBPs和PPARγ家族成員均發(fā)揮至關(guān)重要的作用，它們相互協(xié)同，相互影響來(lái)激活與成脂分化相關(guān)基因的表達(dá)。成脂分化中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子PPARγ在誘導(dǎo)因子的存在下被激活，并且表達(dá)增加。它能夠進(jìn)一步調(diào)節(jié)C/EBPα，ap2等成脂標(biāo)志因子的表達(dá)。C/EBPβ和C/EBPδ作為早期調(diào)控因子最先表達(dá)，隨后誘導(dǎo)PPARγ和C/EBPα表達(dá)而啟動(dòng)生成脂滴[14-16]。同時(shí)脂肪型脂肪酸結(jié)合蛋白4（fatty acid binding protein，F(xiàn)ABP4）作為細(xì)胞成脂分化的標(biāo)志物之一，后期表達(dá)極高。有研究表明超表達(dá)FABP4正調(diào)控3T3-L1脂肪細(xì)胞分化和脂質(zhì)沉積，顯著促進(jìn)PPARγ，CEBPα的表達(dá)，而干擾FABP4則抑制PPARγ，CEBPα的表達(dá)[17]。在脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中，PPARγ和C/EBPα均會(huì)出現(xiàn)一個(gè)逐漸上升的趨勢(shì)[18-21]。譚佳寧等在研究小檗堿對(duì)C3H10T1/2細(xì)胞增殖與成脂分化的影響中發(fā)現(xiàn)，小檗堿能夠顯著下調(diào)C3H10T1/2細(xì)胞中PPARγ mRNA和C/EBPα mRNA及FABP4 mRNA的表達(dá)抑制其細(xì)胞成脂分化，降低胞內(nèi)甘油三酯含量[9]。高敏等發(fā)現(xiàn)白楊素能降低小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中LPL及PPAR-γ2的轉(zhuǎn)錄水平，抑制小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化[22]。

本實(shí)驗(yàn)采用地塞米松和胰島素及羅格列酮聯(lián)合誘導(dǎo)的C3H10T1/2成脂分化模型研究山核桃葉總黃酮分離得到的球松素查爾酮對(duì)小鼠胚胎間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化的影響。油紅O染色顯示球松素查爾酮可減少C3H10T1/2成脂分化中脂滴的數(shù)量。GAP-PAP酶法檢測(cè)甘油三酯含量發(fā)現(xiàn)，與誘導(dǎo)組相比，球松素查爾酮50 μmol·L^-1組能顯著降低細(xì)胞中甘油三酯的含量（P<0.05或P<0.01）。已有的研究表明，PPAR信號(hào)通路是影響細(xì)胞成脂分化的重要通路之一，在本實(shí)驗(yàn)的熒光定量PCR和Western blot的結(jié)果中顯示，球松素查爾酮能降低PPARγ，C/EBPα和FABP4的基因和蛋白表達(dá)，從而抑制C3H10T1/2成脂分化。本實(shí)驗(yàn)為黃酮類藥物在臨床上用于治療脂代謝相關(guān)疾病提供了理論依據(jù)，具有深遠(yuǎn)意義。

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[責(zé)任編輯 張寧寧]