戴銀 單文杰 胡曉苗 趙瑞宏 侯宏艷　沈?qū)W懷　潘孝成　周學(xué)利 張丹俊

摘要 [目的]探索主要組織相容性復(fù)合體 Ⅰ 類分子（Major Histocompatibility Complex，MHC Ⅰ）提高抗原呈遞效率的方法，獲得具有免疫學(xué)活性的抗原肽-MHC Ⅰ 分子單鏈三聚體。[方法]采用基因重組技術(shù)，通過連接肽（G4S）3將雞新城疫病毒抗原表位短肽HN（aa346-353）與雞MHC Ⅰ（B-F）分子二聚體的編碼基因共價串聯(lián)，構(gòu)建帶有綠色熒光標簽蛋白的真核表達載體pEGFP-HN346-353-B-Fβ2m-α。[結(jié)果]轉(zhuǎn)染真核細胞293T后，熒光顯微鏡觀察可見，重組融合蛋白HN346-353-B-Fβ2m-α分子三聚體主要表達定位于真核細胞的內(nèi)膜系統(tǒng)。Western Blot結(jié)果表明，在預(yù)期蛋白分子量大小位置有明顯的特異反應(yīng)帶，重組蛋白與其相應(yīng)抗體可發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)。[結(jié)論]重組質(zhì)粒能夠在真核細胞中表達，且融合蛋白具有良好的生物學(xué)活性。

關(guān)鍵詞 雞MHC B-F分子；單鏈三聚體；真核表達

中圖分類號 S188+.2 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）01-0139-04

Construction and Expression of Single Chain Trimer of Chicken MHCⅠMolecular

DAI Yin1， SHAN Wenjie2， HU Xiaomiao1， ZHANG Danjun1* et al

（1.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science， Anhui Academy of Agricultural Science， Hefei， Anhui 230031；2.College of Animal Science and Technology， Anhui Agricultural University， Hefei， Anhui 230036）

Abstract [Objective] To improve the efficiency of antigen presentation of MHCⅠmolecule， the single chain trimer of pepideMHCⅠmolecules were obtained. [Method]The chicken MHCⅠ（BF） gene and the epitope protein HN （aa346353） of Newcastle disease virus were linked by a linker with sequences encoding（G4S）3. Then the recombinant plasmids （pEGFPHN346-353BF β2mα） with green fluorescent protein was constructed. Further the recombinant plasmid was transfected into eukaryotic cell 293T. [Result]The gene product of recombinant plasmid was mainly located to endomembrane system of the cells by fluorescence microscopy. Moreover， the positive reactions were observed by the method of Western Blot， in accordance with the target proteins， and the proteins had the binding reaction with specific antibodies. [Conclusion]The recombinant plasmid was expressed in eukaryotic cells with a good biological activity.

Key words Chicken MHC BF molecule；Single chain trimer；Eukaryotic expression

雞主要組織相容性復(fù)合體（Major Histocompatibility Complex，MHC）分子又被命名為B復(fù)合體，位于16號染色體上，包括B-F、B-L和B-G 3個基因座。其中B-F、B-L所編碼的抗原在結(jié)構(gòu)和功能上分別類似于哺乳動物MHC的 Ⅰ 類和 Ⅱ 類抗原[1-2]。雞MHC分子與多種傳染性疾病的遺傳抗性密切相關(guān)[3]。研究發(fā)現(xiàn)，B2和B21單倍型雞對馬立克氏病具有不同程度的抗性，而B19高度易感[4-7]；此外，B15和B4單倍型雞對勞氏肉瘤病病毒較易感，而B12單倍型雞能夠產(chǎn)生明顯的抗腫瘤反應(yīng)[8]。同時國外一些公司已經(jīng)由此培育出了相關(guān)的抗病遺傳品系。

與人類MHC Ⅰ 分子相似，B-F分子是一種膜結(jié)合糖蛋白，由α鏈和β2m微球蛋白組成，兩者呈非共價鍵結(jié)合，主要負責(zé)內(nèi)源性抗原肽的呈遞。研究表明，利用基因工程技術(shù)將抗原短肽以及MHC Ⅰ 類分子的α和β2m鏈，用連接肽串聯(lián)為融合基因，表達的蛋白能以更穩(wěn)定的單鏈三聚體（Single Chain Trimer，SCT）在細胞表面表達，且能更有效地激活CD8 + T細胞免疫應(yīng)答[9-11]。該結(jié)構(gòu)在提高內(nèi)源性抗原肽呈遞效率的研究方面具有重要意義，同時也為MHC Ⅰ 類分子呈遞外源性抗原肽提供了一條新思路。筆者前期已經(jīng)構(gòu)建了具有免疫學(xué)活性雞MHC Ⅰ 類（B-F）分子的α和β2m鏈的二聚體結(jié)構(gòu)，將構(gòu)建抗原短肽與MHC Ⅰ 類分子的單鏈三聚體結(jié)構(gòu)，以期為構(gòu)建以MHC Ⅰ 分子為基礎(chǔ)的高效DNA疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 工具酶、質(zhì)粒、菌株和細胞及主要試劑

T4 DNA連接酶、Premix Ex Taq DNA聚合酶、Hind Ⅲ、Sal Ⅰ 和Nhe Ⅰ 均購自寶生物工程（大連）有限公司；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒 XfectTM購自 Clontech 公司；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購自 GIBCO 公司；標簽蛋白GFP單克隆抗體、超純質(zhì)粒抽提試劑盒、細胞裂解液、膜顯色液等購自碧云天生物技術(shù)有限公司。雞MHC B-Fα蛋白的鼠源多抗血清、重組質(zhì)粒pMD18-T-B-F-HN346-353、pMD18-T-B-Fβ2m-α、綠色熒光載體pEGFP-N1、Rosetta（DE3）菌株、293T細胞均由安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計。參照GenBank數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表的雞MHC B-Fα和β2m鏈cDNA序列（GenBank登陸號為GU451331和M84767），以及編碼連接肽（G4S）3的基因序列和真核表達載體pEGFP-N1序列，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計2條特異性引物?；蚱蜭eader（β2m）-HN346-353-Linker（G4S）3的擴增引物，P-HN346-353-F：5′-CTAGCTAGCGGAGCCATGGGGAAGGC-3′，P-HN345-353-R：5′-CCCAAGCTTTGATCCGCCTCCACCTGA-3′；雞MHC B-Fβ2m-α二聚體的兩端擴增引物，pEGFP-β-F：5′-CCCAAGCTTCAGGCCGACCTGACGC-3′，pEGFP-α-R：5′-ATGTCGACATGGAGGGGTTGCTCCCGGGCGCG-3′。

基因片段Leader（β2m）-HN346-353-Linker（G4S）3長度為150 bp，依次包括編碼B-F分子β2m鏈的信號肽序列、新城疫病毒HN蛋白抗原短肽HN346-353（DEQDYQIR）和連接肽（G4S）3的基因序列，兩端引入Nhe Ⅰ 和Hind Ⅲ 的酶切位點。B-Fβ2m-α二聚體的擴增長度為1 334 bp，依次包括編碼B-F分子β2m鏈成熟肽，連接肽（G4S）3和B-F分子α鏈成熟肽的基因序列，兩端引入Hind Ⅲ 和Sal Ⅰ 的酶切位點。

1.2.2 基因的擴增。分別以重組質(zhì)粒pMD18-T-B-F-HN346-353和pMD18-T-B-Fβ2m-α為模板，擴增Leader（β2m）-HN346-353-Linker（G4S）3和 B-Fβ2m-α基因序列。反應(yīng)體系為Premix Ex Taq 20.0 μL，上下游引物各1.0 μL，質(zhì)粒DNA 1.0 μL，加雙蒸水補足50.0 μL。擴增程序為95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，33 個循環(huán)，72 ℃延伸10 min；95 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30 個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。

1.2.3

pEGFP-HN346-353-B-Fβ2m-α重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定。首先將B-Fβ2m-α的擴增產(chǎn)物，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，用DNA凝膠回收試劑盒回收，然后連入pEGFP-N1載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP-B-Fβ2m-α。16 ℃水浴過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta感受態(tài)，涂布于含氨芐青霉素（Amp）的LB瓊脂平板上，37 ℃溫箱培養(yǎng)過夜，PCR初步篩選陽性克隆后，用小量堿法提取質(zhì)粒。隨后，將Leader（β2m）-HN346-353-Linker（G4S）3基因 PCR產(chǎn)物純化后，連入重組載體pEGFP-B-Fβ2m-α，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，PCR初步篩選陽性克隆后，提取質(zhì)粒。分別用Nhe Ⅰ 和Hind Ⅲ，Nhe Ⅰ 和Sal Ⅰ 雙酶切重組質(zhì)粒，陽性重組質(zhì)粒進行測序，測序結(jié)果與已報道的相應(yīng)基因序列比對。

1.2.4 超純質(zhì)粒的提取及瞬時轉(zhuǎn)染。超純質(zhì)粒DNA的提取方法，按照超純質(zhì)粒純化試劑盒說明書進行。轉(zhuǎn)染前1 d，取無菌爬片于6孔培養(yǎng)板中，以每孔293T細胞量為0.5×105～2.0×105個進行鋪板；轉(zhuǎn)染時每孔準備1.5 mL離心管2個；將5 μg的空載體質(zhì)粒和重組質(zhì)粒分別溶于一管100 μL染試劑Xfect Buffer，輕輕混勻；同時分別將1.5 μL Xfect polymer溶于一管98.5 μL Buffer中；然后充分混合以上2管溶液，孵育10 min；將200 μL轉(zhuǎn)染混合物置入每孔細胞培養(yǎng)基中，使充分混勻；細胞板置5%CO2、37 ℃培養(yǎng)。24 h后，進行表達蛋白的檢測分析。

1.2.5 熒光顯微鏡檢測。吸棄細胞培養(yǎng)板各孔中培養(yǎng)液，用PBS洗3次；4%多聚甲醛固定液固定15～20 min；洗3次。取出細胞爬片，固定后在熒光顯微鏡400倍視野下觀察。

1.2.6 Western Blot分析。于細胞轉(zhuǎn)染48 h后，棄去各孔培養(yǎng)基，PBS洗滌3次，每孔用150 μL細胞裂解液收集蛋白，12 000 r/min離心3 min，收集上清蛋白，-20 ℃保存?zhèn)溆?。取蛋白樣品加適量蛋白Loading Buffer，沸水煮3 min，冷卻后用10%分離膠的SDS-PAGE電泳，隨后轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜（PVDF），封閉后分別以1 ∶4 000的GFP蛋白單克隆抗體和1 ∶100稀釋的一抗血清37 ℃孵育2 h，1 ∶5 000稀釋的二抗HRP-羊抗鼠IgG孵育2 h，充分洗滌后適量顯色液顯色，并拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因的擴增

分別以重組質(zhì)粒pMD18-T- B-F-HN346-353和pMD18-T-B-Fβ2m-α為模板進行擴增，瓊脂糖電泳檢測。結(jié)果分別獲得了150 bp和1 334 bp的目的基因片段Leader（β2m）-HN346-353-Linker（G4S）3和B-Fβ2m-α，與預(yù)期條帶大小相等（圖1和2）。

3基因的PCR產(chǎn)物；3.陰性對照

Note： M.DL2000 DNA Marker；1 and 2.PCR products of Leader（β2m）-HN346-353-Linker（G4S）3 gene；3.Negative control

圖1 Leader（β2m）-HN346-353-Linker（G4S）3基因的PCR擴增

Fig.1 PCR amplification of Leader（β2m）-HN346-353-Linker（G4S）3 gene

注： M.DNA 標準分子量；1～4.B-Fβ2m-α基因的PCR產(chǎn)物；5.陰性對照

Note： M.DL2000 DNA Marker；1-4.PCR products of Leader（β2m）-HN346-353-Linker（G4S）33 gene；5.Negative control

圖2 B-Fβ2m-α基因的PCR擴增

Fig.2 PCR amplification of B-Fβ2m-α gene

2.2 pEGFP-HN346-353-B-Fβ2m-α重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

以篩選的陽性重組質(zhì)粒pEGFP-HN346-353-B-Fβ2m-α為模板，以及相應(yīng)引物進行PCR擴增，初步鑒定重組質(zhì)粒。陽性重組質(zhì)粒分別用內(nèi)切酶Nhe Ⅰ 和Hind Ⅲ，Nhe Ⅰ 和Sal Ⅰ 酶切，結(jié)果在分子量約為150 bp和1 484 bp處有預(yù)期DNA條帶（圖3）。重組質(zhì)粒送生物公司測序，序列比對結(jié)果與目的基因完全一致，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.3 重組質(zhì)粒在真核細胞中的表達

分別用空質(zhì)粒pEGFP

-N1、重組質(zhì)粒pEGFP-HN346-353-B-Fβ2m-α轉(zhuǎn)染293T

細胞，24 h后用熒光顯微鏡觀察。結(jié)果空載體、重組載體的轉(zhuǎn)染效果良好；空質(zhì)粒pEGFP-N1表達的綠色熒光蛋白均勻分布于整個細胞，而重組質(zhì)粒表達的融合蛋白則主要表達定位于293T細胞的內(nèi)膜系統(tǒng)（圖4）。

2.4 Western Blot檢測分析

空載體和重組載體的細胞裂解液上清經(jīng)SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)至PVDF膜上，分別與雞MHC Ⅰ α和熒光蛋白GFP的相應(yīng)一抗反應(yīng)。以熒光蛋白GFP抗體為一抗的反應(yīng)，結(jié)果可見分子量約為27.0 ku和86.4 ku的特異性反應(yīng)帶，與預(yù)期GFP標簽熒光蛋白和HN346-353-B-Fβ2m-α融合蛋白大小一致；以雞MHC Ⅰ α蛋白抗體為一抗的反應(yīng)，結(jié)果可見大小約86.4 ku的特異性反應(yīng)帶，而空載體轉(zhuǎn)染的細胞相應(yīng)位置未見條帶（圖5）。表明融合蛋白與相應(yīng)抗體發(fā)生了特異性結(jié)合，具有較好的免疫學(xué)活性。

3 結(jié)論與討論

在免疫系統(tǒng)中，MHC Ⅰ 類分子最重要的功能是與被提呈的抗原肽分子結(jié)合，以抗原肽-MHC復(fù)合物的形式表達于抗原提呈細胞的表面，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生T細胞免疫應(yīng)答。研究發(fā)現(xiàn)，MHC Ⅰ 分子α和β2m鏈的組裝，及其與抗原肽的穩(wěn)定結(jié)合，對于MHC Ⅰ 分子成功呈遞抗原肽、刺激機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答具有極其重要的意義[12-13]。因此，如果通過一段短的連接肽將三者以共價鍵的方式串聯(lián)，將更有助于MHC Ⅰ 類分cDNA序列與小鼠的MHC Ⅰ 類分子連接，構(gòu)建了OVA-β2m-Kb的融合基因，結(jié)果表明，該結(jié)構(gòu)能更有效地引起抗原特異性T細胞免疫。Kim等[15]將小鼠的MHC Ⅰ 類通過一段短肽與李斯特氏菌的抗原短肽連接，形成穩(wěn)定表達的SCT結(jié)構(gòu)，同樣能有效地誘導(dǎo)機體產(chǎn)生T細胞應(yīng)答反應(yīng)。相對普通MHC Ⅰ 類分子，在抗原肽-MHC Ⅰ 類分子的SCT結(jié)構(gòu)中，α和β2m鏈被共價鍵連接，不需要重新組裝；同時被固定的抗原短肽，可避開其他抗原肽的競爭，與MHC Ⅰ 類分子復(fù)合體更穩(wěn)定地在細胞表面表達，也因此能更好地刺激T細胞免疫應(yīng)答[16]。該結(jié)構(gòu)對于抗病毒及抗腫瘤等的免疫治療具有重要意義[17-18]，此外該特點也為MHC Ⅰ 類分子呈遞外源性抗原肽提供了可能性。

研究發(fā)現(xiàn)，在融合基因中連接肽既要合適的氨基酸長度，又要有較好的疏水性和伸展性，其中含Gly-Ser單位，尤其是以（Gly4Ser）3和（Gly4Ser）4長度序列的連接肽，已被較多地用于構(gòu)建融合蛋白[19-20]。筆者前期通過連接肽（G4S）3 將雞B-F分子的α和β2m鏈成功偶聯(lián)，形成了穩(wěn)定的二聚體。由于與MHC Ⅰ 類分子結(jié)合的肽，通常是長度為8～11個氨基酸的伸展狀短肽，該研究選用8個氨基酸的新城疫病毒抗原表位短肽HN346-353（DEQDYQIR）[21]。通過連接肽（G4S）3，將細胞表位短肽HN346-353加載于雞B-F分子二聚體，成功構(gòu)建了HN346-353-B-Fβ2m-α單鏈三聚體。真核表達后熒光觀察發(fā)現(xiàn)，該單鏈三聚體結(jié)構(gòu)能夠穩(wěn)定表達，定位于細胞內(nèi)膜系統(tǒng)；Western Blot檢測結(jié)果顯示，該聚合體能夠識別相應(yīng)特異性抗體，具有良好生物活性，可進一步用于以MHC Ⅰ 類分子為基礎(chǔ)的疫苗載體，以及外源性抗原肽呈遞的研究。

參考文獻

[1] MILLER M M，BACON L D，HALA K，et al.Nomenclature for the chicken major histocompatibility（B and Y）complex[J].Immunogenetics，2004，56（4）：261-279.

[2] 吳春梅，趙桂蘋，陳國宏.雞主要組織相容性復(fù)合體及其相關(guān)基因的研究進展[J].中國家禽，2007，29（8）：51-53.

[3] VUKMANOVIC ' S，NEUBERT T A，SANTORI F R.Could TCR antagonism explain associations between MHC genes and disease？ [J].Trends in molecular medicine，2003，9（4）：139-146.

[4] BACON L D，WITTER R L.Efficacy of Mareks disease vaccines in Mhc heterozygous chickens：Mhc congenic × inbred line F1 matings[J].J Hered，1995，86（4）：269-273.

[5] GARCIACAMACHO L，SCHAT K，BROOKS R，et al.Early cellmediated immune responses to Mareks disease virus in two chicken lines with defined major histocompatibility complex antigens[J].Vet Immunol and Immunop，2003，95（3/4）：145-153.

[6] SHERMAN M A，GOTO R M，MOORE R E，et al.Mass spectral data for 64 eluted peptides and structural modeling define peptide binding preferences for class I alleles in two chicken MHCB haplotypes associated with opposite responses to Mareks disease[J].Immunogenetics，2008，60（9）：527-541.

[7] BLANKERT J J，ALBER G A，BRILES W E，et al.The effect of serologically defined major histocompatibility complex haplotypes on Mareks disease resistance in commercially bred white Leghorn chickens[J].Avian Dis，1990，34（4）：818-823.

[8] WALLNY H J，AVILA D，HUNT L G，et al.Peptide motifs of the single dominantly expressed class I molecule explain the striking MHCdetermined response to Rous sarcoma virus in chickens [J].Proc Natl Acad Sci，2006，103（5）：1434-1439.

[9] CARMON L，BOBILEVPRIEL I，BRENNER B，et al.Characterization of novel breast carcinomaassociated BA46derived peptides in HLAA2.1/Dbβ2mtransgenic mice [J]. J Clin Invest，2002，110（4）：453-462.

[10] PALMOWSKI M J，PARKER M，CHOUDHURI K，et al.A singlechain H2Db molecule presenting an influenza virus nucleoprotein epitope shows enhanced ability at stimulating CD8+ T cell responses in vivo [J].J Immunol，2009，182（8）：4565-4571.

[11] SAMANTA D，MUKHERJEE G，RAMAGOPAL U A，et al.Structural and functional characterization of a singlechain peptideMHC molecule that modulates both naive and activated CD8+ T cells[J].P Nati Acad Sci USA，2011，108（33）：13682-13687.

[12] KOCH J，TAMP R.The macromolecular peptideloading complex in MHC class Idependent antigen presentation[J].Cellular and molecular life sciences，2006，63（6）：653-662.

[13] WANG M，HARHAJI L，LAMBERTH K，et al.Modified human beta 2microglobulin（desLys58）displays decreased affinity for the heavy chain of MHC class I and induces nitric oxide production and apoptosis[J].Scand J Immunol，2009，69（3）：203-212.

[14] YU Y Y L，NETUSCHIL N，LYBARGER L，et al.Cutting edge：Singlechain trimers of MHC class I molecules form stable structures that potently stimulate antigenspecific T cells and B cells[J].J Immunol，2002，168（7）：3145-3149.

[15] KIM S，ZUIANI A，CARRERO J A，et al.Single chain MHC I trimerbased DNA vaccines for protection against Listeria monocytogenes infection[J].Vaccine，2012，30（12）：2178-2186.

[16] LYBARGER L，YU Y Y，MILEY M J，et al.Enhanced immune presentation of a singlechain major histocompatibility complex class I molecule engineered to optimize linkage of a Cterminally extended peptide[J].J Biol Chem，2003，278（29）：27105-27111.

[17] HUNG C F，CALIZO R，TSAI Y C，et al.A DNA vaccine encoding a singlechain trimer of HLAA2 linked to human mesothelin peptide generates antitumor effects against human mesothelinexpressing tumors [J].Vaccine，2007，25（1）：127-135.

[18] HUANG C H，PENG S，HE L，et al.Cancer immunotherapy using a DNA vaccine encoding a singlechain trimer of MHC class I linked to an HPV16 E6 immunodminant CTL epitope[J].Gene Ther，2005，12（15）：1180-1186.

[19] 徐楊玉，溫世杰，李海芬，等.綠色木霉TvALP-linker-TvRBL 融合基因的構(gòu)建與原核表達[J].生物技術(shù)通報，2015，31（1）：131-137.

[20] KIKUCHI Y，UNO S，YOSHIMURA Y，et al.A bivalent singlechain Fv fragment against CD47 induces apoptosis for leukemic cells[J].Biochem Biophys Res Commun，2004，315（4）：912-918.

[21] LIU X L，SHAN W J，XU S S，et al.The efficacy of chimeric vaccines constructed with PEP1 and IiKey linking to a hybrid epitope from heterologous viruses[J].Biologicals，2015，43（5）：377-382.