王亞男 范思靜

摘要 [目的]研究低溫脅迫對水稻幼苗DNA甲基化水平及模式變化。[方法]以水稻幼苗為材料，利用66個不同的引物組合對來自對照（CK）、4 ℃低溫脅迫1 d（T1）、4 ℃低溫脅迫2 d（T2）、4 ℃低溫脅迫3 d（T3）和恢復2 d（T4）的水稻DNA樣品進行甲基化敏感擴增多態(tài)性（MSAP）分析，探討低溫脅迫和恢復后，DNA的甲基化水平及模式變化。[結(jié)果]甲基化水平分析表明，CK、T1、T2、T3處理樣本中總甲基化率分別為37.19%、33.79%、33.67%和32.67%。進一步分析表明低溫脅迫處理導致水稻DNA總甲基化水平降低，然而恢復處理組（T4）減緩了這種趨勢。[結(jié)論]水稻基因組部分位點的甲基化可能參與了水稻對低溫脅迫的響應(yīng)。

關(guān)鍵詞 低溫脅迫；水稻；甲基化敏感擴增多態(tài)性；DNA甲基化

中圖分類號 S511 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）04-0135-03

MSAP Analysis of Genomic DNA Methylation in Oryza sativa under Low Temperature Stress

WANG Ya-nan ， FAN Si-jing

（Anhui Jinpeiyin Technology Co.，Ltd.，Hefei，Anhui 230088）

Abstract [Objective]Effects of low temperature stress on genomic DNA methylation levels and patterns in Oryza sativa were studied.[Method]In this study， rice seedlings were used as materials to carry out MSAP analysis by using 66 different primer combinations. The experiment included a control group and four treatment groups. T1-T3 were under 4 ℃ for 1-3 days， T4 was the two-days recovery group after low temperature stress. [Result]The methylation levels of CK， T1， T2， T3 treatment were 37.19%， 33.79%， 33.67% and 32.67%， respectively. Further analysis showed that the level of global DNA methylation in O.sativa were decreased under low temperature stress， while normal temperature recovery treatment could alleviate the trend. [Conclusion]Methylation in some loci of rice genome may participate in response of rice to low temperature stress.

Key words Low temperature stress；Oryza sativa；MSAP；DNA methylation

低溫引起的冷應(yīng)力是較常見的環(huán)境壓力之一，它是影響植物生長和發(fā)育的一個主要因素。按照低溫程度和植物受害情況可分為冷害（零上低溫對植物的傷害）和凍害（零下低溫對植物的傷害）兩大類[1]。

為了應(yīng)對環(huán)境變化，將植物事先暴露于低溫環(huán)境中，使其獲得對寒冷的耐受性，這涉及細胞代謝、組織結(jié)構(gòu)的重塑、基因表達的重新編程。

DNA甲基化是生物界中普遍存在的DNA共價修飾方式。大量研究表明，DNA甲基化直接參與植物對干旱、重金屬、低溫等逆境脅迫的響應(yīng)，調(diào)控基因的表達，從而導致植物表型發(fā)生變化[2-4]。DNA甲基化已被假設(shè)為植物表型臨時變化的潛在機制之一。

目前，研究植物基因組中的DNA甲基化方法主要有甲基化敏感擴增多態(tài)性（MSAP）技術(shù)、亞硫酸鹽測序法、焦磷酸測序法和高分辨率熔解曲線法。甲基化敏感擴增多態(tài)性技術(shù)是采用限制性內(nèi)切酶Hpa II和Msp I識別DNA序列中的5′-CCGG位點進行酶切，然后對酶切產(chǎn)物進行接頭的連接，再對PCR反應(yīng)進行后續(xù)擴增片段多態(tài)性分析。由于其操作簡單、重復性高，已廣泛應(yīng)用于多種植物DNA甲基化的研究[5-9]。

水稻是喜溫作物，在其整個生長歷程中，尤其是幼苗階段，由于季節(jié)原因，經(jīng)常遭遇低溫冷害。低溫脅迫給水稻生產(chǎn)造成巨大的損失，導致稻種萌發(fā)率低，幼苗生長遲緩，甚至死亡。該研究以中秈兩系雜交稻品種兩優(yōu)9526幼苗為材料，利用甲基化敏感擴增多態(tài)性技術(shù)研究低溫脅迫及恢復過程中兩優(yōu)9526幼苗DNA甲基化水平以及模式的變化，為深入了解水稻對低溫脅迫的響應(yīng)機制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與處理方法

試驗以中秈兩系雜交稻品種兩優(yōu)9526為材料。篩選飽滿的種子進行發(fā)芽，然后盆栽，待水稻出苗后，進行正常培養(yǎng)，光照100 μmol/（m2·s），光周期14 h/10 h（L/D），溫度（28±2）℃。待幼苗第4片葉長出，倒三葉完全伸展時，取生長一致的幼苗進行后續(xù)試驗。以正常處理為對照（CK）；4 ℃低溫處理1 d為T1處理；4 ℃低溫連續(xù)處理2 d為T2處理；4 ℃低溫連續(xù)處理3 d為T3處理；4 ℃低溫連續(xù)處理3 d后，恢復2 d為T4處理，每個處理設(shè)3次重復，取葉片用液氮冷凍，–80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因組DNA的提取

水稻葉片總DNA提取參照改良CTAB法[9]，DNA純度采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，同時利用NanoDrop ND-2000超微量分光光度計測定230、260 nm處的OD值，將純度較高的DNA放置在冰箱中保存，以備后續(xù)的酶切與PCR擴增試驗。

1.3 DNA甲基化多態(tài)性分析

采用雙酶切組合EcoR Ⅰ/Msp Ⅰ和EcoR Ⅰ/Hpa Ⅱ?qū)NA進行酶切，具體試驗操作參照Xiong等[10]的方法。酶切后的DNA采用接頭進行連接，然后進行PCR擴增反應(yīng)，連接的接頭與PCR擴增引物在表1中列出。擴增產(chǎn)物經(jīng)變性后采用6%聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，電泳結(jié)束后的顯影參照Sanguinetti法[11]采用銀染顯色。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫對兩優(yōu)9526幼苗DNA甲基化水平的影響

從圖1可看出，經(jīng)酶切、PCR反應(yīng)擴增后，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，共檢測出3個甲基化類型，Ⅰ型為無甲基化或單鏈內(nèi)甲基化，電泳結(jié)果為都有帶；Ⅱ型為單鏈外甲基化，Hpa Ⅱ酶切位點有帶，Msp Ⅰ酶切位點無帶；Ⅲ型為雙鏈內(nèi)甲基化，Hpa Ⅱ酶切位點無帶，Msp Ⅰ酶切位點有帶。

為了檢測水稻幼苗在響應(yīng)低溫脅迫及恢復過程中的DNA甲基化水平變化，利用66個不同的引物組合（表1）對來自對照（CK）、低溫脅迫1 d（T1）、低溫脅迫2 d（T2）、低溫脅迫3 d（T3）和恢復2 d（T4）處理組的水稻幼苗DNA樣品進行MSAP分析。CK、T1、T2、T3、T4處理組DNA甲基化圖譜中總擴增位點數(shù)分別為1 835、1 808、1 806、1 812和1 830（表2）。從低溫脅迫處理前后甲基化率 [（Ⅱ + Ⅲ）/（Ⅰ + Ⅱ + Ⅲ）×100%]和全甲基化率[Ⅲ/ （Ⅰ+ Ⅱ + Ⅲ）× 100%]的變化來看，低溫處理導致水稻幼苗DNA總甲基化水平、全甲基化水平降低；而恢復處理組（T4）減緩了這種趨勢，DNA總甲基化、全甲基化水平均有所回升。

2.2 低溫脅迫過程中兩優(yōu)9526幼苗DNA甲基化模式的變化

經(jīng)低溫處理后，水稻幼苗DNA甲基化的變化主要分為3類，共包括13種帶型，其中A類帶型（A1～A3）是表示單態(tài)性的甲基化位點，即對照與處理間的甲基化位點一致、無變化；B類帶型（B1～B5）是指發(fā)生去甲基化的位點，與對照相比，經(jīng)低溫處理后，原先甲基化的位點發(fā)生了去甲基化，甲基化位點數(shù)有所減少；C類帶型（C1～C5）是指未甲基化或單鏈外甲基化的位點發(fā)生了超甲基化，即與對照相比，原先甲基化或單鏈外甲基化的位點經(jīng)低溫處理后發(fā)生了超甲基化，甲基化的總位點數(shù)有所增加。從表3可以看出，與對照相比，隨著低溫脅迫時間的增加，水稻幼苗基因組中發(fā)生DNA甲基化的位點數(shù)逐漸降低，而恢復處理改變了這種趨勢。由此可見，低溫脅迫主要誘導植株發(fā)生較高比例的去甲基化。進一步分析低溫造成的DNA甲基化多態(tài)性位點發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)生的超甲基化（C3、C4、C5型）帶型是主要的多態(tài)性帶型（圖2），分別占總甲基化位點數(shù)的7.33%、7.69%、7.40%。

3 討論

DNA甲基化是植物正常生長發(fā)育所必需的，甲基化水平不足或過高，都會導致植物生長發(fā)育不正常和形態(tài)結(jié)構(gòu)異常[12]。研究表明，非生物脅迫（熱脅迫、重金屬脅迫、鹽脅迫等）對DNA的甲基化水平會造成影響[13-15]。Kovarik等[15]的研究表明，鹽和滲透脅迫可誘導煙草懸浮細胞的異染色質(zhì)區(qū)發(fā)生超甲基化，而恢復正常條件后，發(fā)生超甲基化的位點又會去甲基化，可見，基因組的甲基化、超甲基化可能是植物適應(yīng)非生物脅迫機制的內(nèi)在反應(yīng)。該試驗中，在低溫處理后，利用MSAP分析方法檢測發(fā)生甲基化和超甲基化的位點，說明DNA甲基化反應(yīng)可能參與了水稻對低溫脅迫的響應(yīng)。

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