曹俊俊+姜旭+孫珊珊+胡欣+宋建臣

（延邊大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)系）

摘 要：以RT-PCR方法從雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）培養(yǎng)物中擴(kuò)增出gp27片段，將RT-PCR產(chǎn)物重組到質(zhì)粒栽體pUC19中，并對重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切分析及序列測定。對市場銷售的雞蛋進(jìn)行了gp27抗原檢測。結(jié)果表明，克隆片段720bp為完整目的基因，與國外分離株同源性達(dá)97.4%，市售雞蛋gp27抗原檢出率7%。

關(guān)鍵詞：禽白血病病毒；gp27基因；克隆測序

禽白血病（Aian Leukosis）是由反轉(zhuǎn)錄病毒科的禽白血病病毒（Aian Leukosis Virus， ALV）和肉瘤病病毒（Avian Sarcoma Virus， ASV）群中的病毒引起的禽類多種腫瘤性疾病的統(tǒng)稱。本病在世界各地均有發(fā)生，是危害養(yǎng)禽業(yè)的主要疾病之一[1]。P27是病毒的主要核心蛋白，分子量為27ku，為主要的群特異性抗原。在禽白血病/肉瘤病毒的檢測試驗(yàn)中，均以p27作為抗原制備群特異性抗體，從而建立相應(yīng)的病毒檢測方法。

1 材料與方法

1.1 病毒及質(zhì)粒

SR-RSV（Schmidt-Ruppin）株，克隆載體質(zhì)粒pUC19 由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試劑

RNA提取試劑盒、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶購自美國Gibco BRI公司；UNIQ-5柱離心式DNA膠回收試劑盒購自上海生物工程有限公司；限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶等購自大連寶生物工程有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank收錄的RSV核苷酸序列，用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)軟件Oligo設(shè)計(jì)了1對引物P1、P2，兩引物間的跨幅為720 bp，上游引物（P1：5' -CCCGTGGAATTCATGGCTGTAGTGATTAAG-3'）設(shè)計(jì)有Eco R I 酶切位點(diǎn)和起始密碼子ATG，下游引物（P2：5' -CATACTCGAGGGCTGGATAGCAGACTACAT-3'）設(shè)計(jì)有Xho I酶切位點(diǎn)和終止密碼子。引物由北京六合華大基因有限公司合成。

1.4 核酸提取

將SR-RSV接種于雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）上，8 d后收毒，用RNA提取試劑盒（按操作說明書進(jìn)行）提取核酸。

1.5 RT-PCR擴(kuò)增gp27基因

RT反應(yīng)在20？滋L體系中進(jìn)行。取上述提取核酸2？滋L作為模板，加10 pmol/？滋L引物P11？滋L，90℃10min，立即冰浴5min，加入40U/？滋L核糖核酸酶抑制劑0.5？滋L，dNTP（各2.5mmol/L）2？滋L，5×反轉(zhuǎn)錄緩沖液（first strand buffer）4？滋L，200U/？滋L M-Mulv 1？滋L，加DEPC處理的雙蒸水至20？滋L，混勻，37℃45min，95℃5min滅活反轉(zhuǎn)錄酶。以上述反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板的PCR反應(yīng)在50？滋L體系中進(jìn)行。反應(yīng)條件為94℃ 1min，57℃ 1min，72℃ 2min，循環(huán)擴(kuò)增25次，最后72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物于含EB的8g/L瓊脂糖凝膠中電泳。

1.6 PCR產(chǎn)物的定向克隆

按UNIQ-5柱離心式DNA膠回收試劑盒使用說明回收 Klenow 酶處理的PCR產(chǎn)物和Sma I酶切處理的pUC19質(zhì)粒，用T4 DNA連接酶連接后轉(zhuǎn)化于感受態(tài)宿主菌，用藍(lán)自斑法篩選重組質(zhì)粒。

1.7 重組質(zhì)粒的PCR和酶切鑒定

按1.6的反應(yīng)條件進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物于8g/L瓊脂糖凝膠中電泳。用Eco R I、Xho I 進(jìn)行酶切鑒定。

1.8 重組質(zhì)粒的序列測定與分析

DNA序列由大連寶生物工程有限公司測定，借助于核苷酸序列分析軟件進(jìn)行分析.并與GenBank中的相關(guān)毒株RSV J02342株進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 PCR反應(yīng)

從接毒雛雞翅膀腫塊和接毒CEF培養(yǎng)物中擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物，經(jīng)8 g/L瓊脂糖凝膠電泳得到與預(yù)期結(jié)果相符的720bp的片段（見圖1）。

2.2 重組質(zhì)粒的PCR鑒定與酶切鑒定

重組質(zhì)粒的PCR產(chǎn)物經(jīng)8g/L瓊脂糖凝膠電泳，得到與預(yù)期結(jié)果相符的720 bp的片段。重組質(zhì)粒經(jīng)Pvu Ⅱ酶切得到與預(yù)期結(jié)果相符的片段（見圖2）。

2.3 重組質(zhì)粒的序列測定及分析

對構(gòu)建的重組質(zhì)粒進(jìn)行序列測定及分析，并與已經(jīng)發(fā)表的RSV J02342株核苷酸序列進(jìn)行比較，同源性達(dá)97.7%，表明克隆的片段為gp27基因。

2.4 市售雞蛋的gp27抗原檢測

在本市不同超市隨機(jī)購買了240枚雞蛋，利用本實(shí)驗(yàn)的方法對雞蛋蛋清進(jìn)行了gp27檢測。結(jié)果表明，市售雞蛋gp27抗原檢出率7%。

3 討論

禽白血病是世界性分布的歷史悠久而又不斷出現(xiàn)新型病例的禽類病毒性可傳染的腫瘤性疾病，是嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展的最重要疫病之一。由于病毒亞群個(gè)毒株的多樣性、相關(guān)內(nèi)源性病毒存在的廣泛性，以及傳播途徑和發(fā)病情況的復(fù)雜性，使本病很難根除。其危害性不僅是引起病禽（主要是雞，特別是肉種雞）的死亡和淘汰，而且引起雞群生產(chǎn)能力的普遍降低，也影響蛋（胚）源或雞源細(xì)胞的醫(yī)學(xué)研究和生物制品的發(fā)展。1997年以來J亞群禽白血病在世界范圍內(nèi)爆發(fā)，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。禽白血病病毒的主要蛋白質(zhì)組分有g(shù)ag基因編碼的核心蛋白，pol基因編碼的3種酶，env基因編碼的兩種糖蛋白。在gag編碼的非糖基化蛋白中，p27是主要的群特異性抗原，他的保守性高，在病毒中的含量高，是制備檢測抗體的首選抗原。

RSV核心蛋白gp27基因是其主要的免疫原基因，具有RSV和ALV群特異性，以RSV gp27為抗原建立的免疫瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等檢測方法，其特異性及靈敏性與完整病毒粒子抗原相同。目前適用于大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查和凈化的檢測方法主要還是針對ALV保守抗原P27的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。

至今人類對禽白血病的防治還無計(jì)可施，既沒有疫苗可以利用，也沒有有效的藥物治療，控制禽白血病的主要方法是通過病原檢測，淘汰陽性雞，從而凈化種群。目前國際金標(biāo)準(zhǔn)的最優(yōu)凈化方案是，對核心雞群全部采血，接種DF-1細(xì)胞進(jìn)行外源性ALV的分離鑒定，淘汰全部陽性雞進(jìn)行種雞群凈化。

參考文獻(xiàn)

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通訊作者：宋建臣，副教授。