陳 練 馬莎莎 - 易倫朝 - 顏鴻飛 - 王利兵 - 黎繼烈 -

(1. 湖南出入境檢驗(yàn)檢疫局，湖南 長(zhǎng)沙 410004；2. 中南林業(yè)科技大學(xué)經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410004；3. 昆明理工大學(xué)云南省食品安全研究院，云南 昆明 650500)

砷的不同形態(tài)在石菖蒲中的分布

陳 練1,2CHENLian1,2馬莎莎3MASha-sha3易倫朝3YILun-zhao3顏鴻飛1YANHong-fei1王利兵1,2WANGLi-bing1,2黎繼烈2LIJi-lie2

(1. 湖南出入境檢驗(yàn)檢疫局，湖南 長(zhǎng)沙 410004；2. 中南林業(yè)科技大學(xué)經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410004；3. 昆明理工大學(xué)云南省食品安全研究院，云南 昆明 650500)

建立砷元素6種形態(tài)的分析方法，研究砷的不同形態(tài)在石菖蒲不同部位中的含量、分布及轉(zhuǎn)化。采用高效液相色譜法(HPLC)分離，色譜柱HAMILTON PR-X100陰離子交換柱(4.1 mm×250 mm，10 μm)；流動(dòng)相A為水，流動(dòng)相B為pH 8.5的碳酸銨(50 mmol/L)與甲醇(1%)混合液，梯度洗脫，電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(ICP-MS)測(cè)定不同形態(tài)的砷。該方法線性范圍為0.995～0.999，回收率為89%～97%。建立的檢測(cè)方法準(zhǔn)確、穩(wěn)定、可靠。對(duì)石菖蒲根莖、葉及與外源性三價(jià)砷浸泡后的根莖、葉進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，石菖蒲樣品中只存在砷的無(wú)機(jī)形態(tài)，且三價(jià)砷為主要存在的無(wú)機(jī)形態(tài)。石菖蒲的根莖為無(wú)機(jī)砷的主要富集部位，石菖蒲的根莖、葉均能將部分高毒性的三價(jià)砷轉(zhuǎn)化為毒性較低的五價(jià)砷。

砷；形態(tài)分析；石菖蒲；HPLC-ICP-MS

石菖蒲是一種天南星科、菖蒲屬禾草狀多年生草本植物，具有鎮(zhèn)靜安神、理氣活血、豁痰開(kāi)竅等功效[1-3]。民間常食用石菖蒲以助益智安神。然而，有文獻(xiàn)[4]報(bào)道，石菖蒲中元素砷的含量較高。砷的毒性與其存在的形態(tài)密切相關(guān)[5-7]。在砷的幾種存在形態(tài)中，三價(jià)砷(As III)的毒性最大，五價(jià)砷(As V)的毒性次之；一甲基砷(MMA)、二甲基砷 (DMA)的毒性較?。簧樘鸩藟A(AsB)和砷膽堿(AsC)幾乎沒(méi)有毒性。因此，要客觀地對(duì)元素砷進(jìn)行評(píng)價(jià)，僅考察砷的總量是不夠的，需要進(jìn)一步了解砷的各種形態(tài)的分布和含量。

目前，石菖蒲的研究文獻(xiàn)[8-9]主要涉及有機(jī)物和元素總量，而對(duì)砷形態(tài)分析的文獻(xiàn)[10-12]多側(cè)重于形態(tài)砷的含量分析，鮮見(jiàn)砷的不同形態(tài)的分布和遷移轉(zhuǎn)化研究。石菖蒲中砷的形態(tài)分析尚未見(jiàn)報(bào)道，不同形態(tài)的砷在石菖蒲不同部位分布和轉(zhuǎn)化的文獻(xiàn)也未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用高效液相色譜-電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HPLC-ICP-MS)建立砷的6種形態(tài)的分析方法，研究砷的不同形態(tài)在石菖蒲不同部位的含量、分布及轉(zhuǎn)化。為砷的不同形態(tài)在石菖蒲中以至于植物產(chǎn)品中的分布、轉(zhuǎn)化研究，以及植物產(chǎn)品對(duì)砷的減毒作用研究，提供有價(jià)值的參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)亞砷酸根[三價(jià)砷，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)編號(hào)GBW08666，批號(hào) 1503，摩爾濃度(1.011±0.016) μmol/g]、砷酸根[五價(jià)砷，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)編號(hào)GBW08667，批號(hào)1503，摩爾濃度(0.233±0.005) μmol/g]、一甲基砷[標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)編號(hào)GBW08668，批號(hào) 1412，摩爾濃度(0.335±0.011) μmol/g]、二甲基砷[標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)編號(hào)GBW08669，批號(hào)1412，摩爾濃度(0.706 0±0.002 4) μmol/g]、砷甜菜堿[標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)編號(hào)GBW08670，批號(hào)1412，摩爾濃度(0.518±0.015) μmol/g]、砷膽堿[標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)編號(hào)GBW08671，批號(hào)1305，摩爾濃度(0.374±0.015) μmol/g]：中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院；

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)黃芪：標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)編號(hào)GBW 10028[GSB-18，總砷含量(0.57±0.05) μg/g]，中國(guó)地質(zhì)科學(xué)院地球物理地球化學(xué)勘查研究所；

砷標(biāo)準(zhǔn)溶液：標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)編號(hào)GSB G 62028-90，批號(hào)13011627，濃度1 000 μg/mL，國(guó)家鋼鐵材料測(cè)試中心鋼鐵研究總院；

鍺標(biāo)準(zhǔn)溶液：標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)編號(hào)GSB04-1728-2004，批號(hào)14307-3，濃度1 000 μg/mL，國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心；

碳酸銨、硝酸(65%)、氨水(25%)：優(yōu)級(jí)純，德國(guó)Merck公司；

甲醇：色譜純，德國(guó)Merck公司；

石菖蒲樣品：湖南長(zhǎng)沙，經(jīng)中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院劉韶教授鑒定為石菖蒲(Acorustatarinowii)的根莖葉。

1.2 試驗(yàn)儀器

高效液相色譜儀：1200型，配色譜柱HAMILTON PR-X100陰離子交換柱(4.1 mm×250 mm，10 μm)，美國(guó)Agilent公司；

電感耦合等離子體發(fā)射光譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：820-MS型，配碰撞反應(yīng)器，美國(guó)Varian公司；

超聲波儀：B8510E-MT型，頻率60 HZ，美國(guó)Branson公司；

離心機(jī)：Universal 320型，德國(guó)Heittich公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：LABOROTA 4000型，德國(guó)Heidolph公司；

恒溫水浴搖床：BT300型，日本Yamato公司；

分析天平：MS403S型，瑞士梅特勒-托利多公司。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 儀器條件 ICP-MS儀器條件見(jiàn)表1。ICP-MS測(cè)定75As，開(kāi)啟碰撞模式以消除可能存在的多原子離子35Cl40Ar的干擾。采用內(nèi)標(biāo)元素72Ge補(bǔ)償信號(hào)漂移。

液相色譜條件：色譜柱為HAMILTON PR-X100陰離子交換柱(4.1 mm×250 mm，10 μm)。流動(dòng)相A為水，B為pH 8.5的碳酸銨(50 mmol/L)與甲醇(1%)混合液。洗脫程序：0.0～3.0 min，100% B；3.1～9.0 min，90% B；9.1～9.5 min，100% B。流速1 mL/min；進(jìn)樣體積20 μL。

表1 ICP-MS 儀器參數(shù)表Table 1 Instrument parameters of ICP-MS

1.3.2 溶液的配制

(1) 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制：三價(jià)砷、五價(jià)砷、一甲基砷、二甲基砷、砷甜菜堿、砷膽堿標(biāo)準(zhǔn)溶液用超純水逐級(jí)稀釋為混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，濃度見(jiàn)表2。6種形態(tài)砷標(biāo)準(zhǔn)工作液中保持內(nèi)標(biāo)物質(zhì)鍺的濃度為5 ng/mL。

表2 工作溶液濃度表Table 2 Concentrations of standard solutions nmol/mL

(2) 外源性三價(jià)砷接觸溶液的配制：三價(jià)砷標(biāo)準(zhǔn)溶液用超純水稀釋成50 mL濃度分別為5.06，10.11，50.55，101.10 nmoL/mL 的三價(jià)砷浸泡液。

(3) 流動(dòng)相B的配制：50 mmol 碳酸銨溶解于近1 L甲醇溶液(1%)中，用硝酸和氨水溶液調(diào)節(jié)pH 值為8.5，再用甲醇溶液(1%)定容至1 L，混勻、脫氣備用。

1.3.3 供試品溶液的制備

(1) 石菖蒲樣品供試溶液的制備：將石菖蒲的根莖和葉完全剝離，稱(chēng)取4 g根莖或葉分別置于陶瓷研缽中研磨。用約20 mL 提取液少量多次沖洗研缽與研桿后，溶液及樣品全轉(zhuǎn)移至100 mL三角燒瓶中。60 ℃恒溫水浴振蕩提取2.5 h后，浸提液4 500 r/min離心5 min，取清液過(guò)濾。樣品殘?jiān)俅斡?0 mL提取液按上述過(guò)程提取兩次。過(guò)濾清液置于250 mL圓底蒸餾瓶中旋轉(zhuǎn)蒸餾濃縮后用超純水轉(zhuǎn)移定容到10 mL容量瓶。該溶液中保持內(nèi)標(biāo)物質(zhì)鍺的濃度為5 ng/mL。

(2) 外源性三價(jià)砷接觸樣品供試溶液的制備：稱(chēng)取4 g根莖或葉樣品分別于三價(jià)砷接觸溶液中浸泡一定的時(shí)間。取出晾干后，與石菖蒲樣品相同的方法處理。

(3) 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品供試溶液的制備：稱(chēng)取1 g黃芪標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與樣品同樣處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法的有效性

6種砷的形態(tài)在以上色譜條件下，分離良好，見(jiàn)圖1。采用逐步稀釋測(cè)定3倍信噪比的方法，獲得6種砷形態(tài)的檢出限。對(duì)同一濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算出峰時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，考察重現(xiàn)性。在0～20 nmol/mL濃度范圍內(nèi)，對(duì)6種形態(tài)砷的色譜峰與濃度進(jìn)行擬合?；貧w方程、相關(guān)系數(shù)、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差及檢出限數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。由表3可知，6種形態(tài)砷的色譜峰與濃度間相關(guān)系數(shù)在0.995以上，有良好的線性關(guān)系。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%，方法有良好的精密度。As(III)、As(V)的檢出限可達(dá)0.05 nmol/mL，MMA、DMA、AsB、AsC的檢出限可達(dá)0.03 nmol/mL，方法具有良好的靈敏度。

方法的準(zhǔn)確性用黃芪標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及樣品加標(biāo)回收進(jìn)行驗(yàn)證。黃芪標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中砷的標(biāo)識(shí)值為(0.57±0.05) μg/g，用該方法進(jìn)行測(cè)定，只檢出三價(jià)砷和五價(jià)砷，含量分別為0.10 μg/g及0.45 μg/g，總砷含量為0.55 μg/g，與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)示值相符。實(shí)際樣品添加回收為89%～97%，數(shù)據(jù)見(jiàn)表4。由黃芪標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)測(cè)定值和回收率數(shù)據(jù)可知，方法具有良好的準(zhǔn)確性。

表3 回歸方程、相關(guān)系數(shù)、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差及檢出限Table 3 Regression equation, correlation coefficient, relative standard deviation and detection limit of the method

表4 添加濃度及回收率Table 4 Added concentrations and recoveries

2.2 無(wú)機(jī)砷在石菖蒲不同部位的分布及遷移試驗(yàn)

用建立的方法對(duì)石菖蒲樣品進(jìn)行檢測(cè)，根莖中三價(jià)砷的含量為2.22 μmoL/kg，五價(jià)砷含量為0.3 μmoL/kg，一甲基砷、二甲基砷、砷甜菜堿及砷膽堿均為未檢出；石菖蒲的葉中各種形態(tài)的砷均為未檢出。

三價(jià)砷為各種砷形態(tài)中毒性最大的，也是石菖蒲中砷的主要存在形態(tài)，因此，選擇砷的三價(jià)形態(tài)，研究其在石菖蒲不同部位中的遷移規(guī)律?？疾煸诓煌庠葱匀齼r(jià)砷接觸濃度和不同接觸時(shí)間的影響下，石菖蒲根莖和葉對(duì)無(wú)機(jī)砷吸收積累的量?？鄢浔旧淼娜齼r(jià)砷、五價(jià)砷的量，石菖蒲根莖和葉對(duì)無(wú)機(jī)砷吸收積累的量結(jié)果見(jiàn)表5、6。

2.3 討論

由表5、6可知，在高毒性三價(jià)砷單一來(lái)源接觸的情況下，石菖蒲樣品的根莖和葉均富集了三價(jià)砷和五價(jià)砷?？梢?jiàn)，石菖蒲的根莖和葉均能通過(guò)生物代謝，將部分高毒性的三價(jià)砷轉(zhuǎn)化為較低毒性的五價(jià)砷。這可能是在石菖蒲根莖、葉細(xì)胞中，部分三價(jià)砷可以作為電子供體，被As(III)氧化酶催化從而被氧化為五價(jià)砷[13-14]，達(dá)到部分降低無(wú)機(jī)砷毒性的效果。

表5 不同濃度三價(jià)砷浸泡液浸泡4 d時(shí)石菖蒲根莖、葉中無(wú)機(jī)砷的分布量Table 5 Distribution of inorganic arsenic in rhizomes and leaves of Acori Tatarinowii Rhizoma soaked in different concentrations of As (III) solutions for 4 days

表6 10.11 nmol/mL三價(jià)砷浸泡液浸泡不同時(shí)間石菖蒲根莖、葉中無(wú)機(jī)砷的分布量Table 6 Distribution of inorganic arsenic in rhizomes and leaves of Acori Tatarinowii Rhizoma soaked in 10.11 nmol/mL As (III) solutions for different times

圖1 6種砷形態(tài)的色譜圖Figure 1 Chromatogram of six arsenic speciations

在根莖和葉中，三價(jià)砷、五價(jià)砷的積累量均與外源性三價(jià)砷的濃度及接觸時(shí)間成正比。隨著濃度和時(shí)間的增加，三價(jià)砷積累量的增幅高于五價(jià)砷積累量的增幅?？梢?jiàn)，在三價(jià)砷單一來(lái)源接觸的情況下，三價(jià)砷仍是石菖蒲根莖和葉對(duì)砷的主要富集形態(tài)。

石菖蒲的根莖及葉對(duì)無(wú)機(jī)砷總量的積累與外源性高毒性的三價(jià)砷的濃度及接觸時(shí)間呈正相關(guān)。且在兩個(gè)因素下，石菖蒲的根莖對(duì)無(wú)機(jī)砷的積累總量均高于葉?？梢?jiàn)，石菖蒲的根莖是積累無(wú)機(jī)砷的主要部位。這可能是在石菖蒲的根莖部無(wú)機(jī)砷與巰基化合物絡(luò)合，生成較為穩(wěn)定的砷-巰基絡(luò)合物，影響了無(wú)機(jī)砷向葉部的遷移，使得無(wú)機(jī)砷大部分富集在石菖蒲的根莖部[13-14]。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)建立的6種形態(tài)砷的分析方法靈敏、穩(wěn)定、可靠。運(yùn)用該方法測(cè)定石菖蒲中砷的形態(tài)，發(fā)現(xiàn)石菖蒲中只存在無(wú)機(jī)形態(tài)的砷，其中三價(jià)砷為主要的存在形態(tài)。在有外源性三價(jià)砷接觸的情況下，石菖蒲樣品也只表現(xiàn)出對(duì)無(wú)機(jī)形態(tài)砷的積累。根莖是無(wú)機(jī)形態(tài)砷積累的主要部位。石菖蒲根莖和葉均能將部分三價(jià)砷轉(zhuǎn)化為五價(jià)砷，但三價(jià)砷仍為積累的主要形態(tài)。石菖蒲對(duì)外源性無(wú)機(jī)形態(tài)砷的積累與接觸時(shí)間和濃度呈正比。本試驗(yàn)的研究成果對(duì)砷的不同形態(tài)在石菖蒲中的分布、轉(zhuǎn)換研究有重要的參考價(jià)值；可為砷的不同形態(tài)在植物產(chǎn)品中的分布、轉(zhuǎn)化及植物產(chǎn)品對(duì)砷的減毒作用研究提供了參考數(shù)據(jù)。

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Distribution Research of Arsenic speciationinAcoriTatarinowii

(1.HunanEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Changsha,Hunan410004,China; 2.KeyLaboratoryofCultivationandProtectionNon-woodForestTrees,MinistryEducation,CentralSouthUniversityofForestryandTechnology,Changsha,Hunan410004,China; 3.YunnanFoodSafetyResearchInstitute,KunmingUniversityofScienceandTechnology,Kunming,Yunnan650500,China)

The speciation analytical method was developed to detect the arsenic (As) and research its styles, contents and distribution inAcoritatarinowii. The arsenic speciation was separated by high performance liquid chromatograph with anion exchange column (HAMILTON PR-X100, 4.1 mm×250 mm，10 μm). Mobile phases were ultra-pure water (A) and 50 mmol/L ammonium carbonate with 1% methanol(pH 8.5, B). Inductively coupled plasma emission and mass spectrometry was involved to detect arsenic speciation. The linear ranges were between 0.995 and 0.999, and the rate of recovery ranged from 89% to 97%. The method was confirmed to be accurate, stable and reliable. The results showed that leaves soaked in different contents As (III) solution for different times, only inorganic speciation of As was found, among which As (III) was the main speciation. The rhizome ofA.tatarinowiiwas the main enrichment position absorbing the inorganic arsenic. Both the rhizome and the leaves could transform the As (III) to As (V).

arsenic; speciation research;Acoritatarinowii; HPLC-ICP-MS

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.04.005

湖北省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：2015BHE015)；湖北省自然科學(xué)基金(編號(hào)：2014CFB891)；國(guó)家國(guó)際科技合作與交流項(xiàng)目(編號(hào)：2014DFG32310)

楊寧，男，武漢輕工大學(xué)助理實(shí)驗(yàn)師，碩士。

何靜仁(1974—)，男，武漢輕工大學(xué)教授，博士。 E-mail：jingren.he@whpu.edu.cn

2017-02-08