余靜喜

[摘要] 目的 分析膽固醇代謝紊亂的SD大鼠肝細(xì)胞膜生物泵糖蛋白（Pgp）及相關(guān)生化指標(biāo)與正常大鼠的差異性。 方法 選取SD大鼠30只，隨機(jī)均分為對(duì)照組與觀察組，每組各15只；觀察組大鼠以高脂飼料喂養(yǎng)法制備為膽固醇代謝紊亂模型，對(duì)照組大鼠常規(guī)喂養(yǎng)保持健康；以免疫組化法分析兩組大鼠肝臟Pgp表達(dá)水平并進(jìn)行比較，同時(shí)比較兩組大鼠肝勻漿的各項(xiàng)相關(guān)生化指標(biāo)。 結(jié)果 對(duì)照組大鼠肝臟Pgp平均光度值為（1.01±0.13），肝指數(shù)為（1.69±0.68）；觀察組大鼠肝臟Pgp平均光度值為（5.36±1.21），肝指數(shù)（3.35±0.37）；觀察組肝臟Pgp平均光度值與肝指數(shù)均顯著高于對(duì)照組（P<0.01）。觀察組肝臟脂肪病變+++的發(fā)生率為53.33%，對(duì)照組無(wú)+++級(jí)別肝臟脂肪病變發(fā)生，觀察組整體肝臟脂肪病變程度較對(duì)照組嚴(yán)重（P<0.01）。觀察組與對(duì)照組大鼠初始體質(zhì)量、肝勻漿TBA，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；觀察組與對(duì)照組大鼠血清Tch比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；兩組其他各項(xiàng)指標(biāo)均差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。肝臟脂肪病變程度與肝臟Pgp光度值呈顯著高度正相關(guān)性，0.8

[關(guān)鍵詞] 膽固醇代謝紊亂；P-糖蛋白；肝臟；內(nèi)分泌

[中圖分類號(hào)] R259 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 2095-0616（2017）07-09-04

Parallel control analysis of Biological pump glycoprotein expression of SD rat liver cell membrane with cholesterol metabolism disorder

YU Jingxi

Department of General Surgery，the Third People's Hospital of Huizhou，Huizhou 516002，China

[Abstract] Objective To analyze the difference of Biological pump glycoprotein （Pgp） of SD rat liver cell membrane with cholesterol metabolism disorder and its related biochemical indexes and the normal rats. Methods 30 SD rats were selected and randomly divided into observation group and control group，15 rats in each group.The rats in observation group fed with high fat diet were prepared for the disorder of cholesterol metabolism in model，and rats of control group fed healthy.Immunohistochemical method was used to analyze the expression of Pgp in two groups of rats. And they were compared.The related biochemical indexes of rat liver homogenate of the two groups were also compared. Results The average Pgp value of rat liver of control group was （1.01±0.13），the liver index was （1.69±0.68）.The average Pgp value of rat liver of observation group was （5.36±1.21），the liver index was （3.35±0.37）.The average Pgp value of rat liver and liver index in observation group group were significantly higher than those of control group （P<0.01）.The hepatic steatosis +++ incidence rate of observation group was 53.33%，the control group had no pathological changes of liver fat level +++.The observation group overall hepatic steatosis degree was more serious than the control group， （P<0.01）.There were no statistical differences on rats initial body weight and liver homogenate TBA between the observation group and the control group （P>0.05）.There was some statistical difference on rats serum Tch between observation group and control group（P<0.05）.The other indexes showed statistically significant differences，（P<0.01）.There was a significant positive correlation between the degree of hepatic steatosis and Pgp value of liver，0.8

[Key words] Cholesterol metabolism disorder；P-glycoprotein；Liver；Endocrine

肝臟是人體代謝膽固醇的主要臟器，也是唯一具有大規(guī)模清除膽固醇的臟器[1-3]。多數(shù)高脂血癥的患者通常合并有肝內(nèi)的脂肪沉淀積聚，可對(duì)患者的肝功能造成損傷，從而進(jìn)一步加劇膽固醇代謝的紊亂程度。Pgp為ATP結(jié)合盒超系列成員，于肝細(xì)胞膜上可見(jiàn)高表達(dá)，并參與至膽汁酸的形成與轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程當(dāng)中[4-6]。本研究旨在通過(guò)動(dòng)物模式觀察膽固醇代謝紊亂大鼠的Pgp蛋白的表達(dá)變化以及肝細(xì)胞脂肪的病變情況，以為膽固醇代謝紊亂的防治提供新的依據(jù)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2015年3月自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物中心購(gòu)買SD雄性大鼠30只，隨機(jī)分為對(duì)照組與觀察組，每組各15只。兩組大鼠月齡均為8～12個(gè)月，兩組大鼠的年齡結(jié)構(gòu)等無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。具有可比性。適應(yīng)性喂養(yǎng)時(shí)全部大鼠均食水自由，自然光照，室溫控制在18～25℃，相對(duì)濕度保持在40%～50%，每日上午加水、喂食并更換墊料。對(duì)照組大鼠給予嚙齒類動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)飼料，確保大鼠健康，在足夠范圍內(nèi)自由活動(dòng)。觀察組大鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)，高脂飼料由嚙齒類動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)飼料86.3%、豬油5%、蛋黃粉8%、膽酸鈉0.2%、膽固醇0.5%組成，縮小大鼠活動(dòng)范圍盡量減少大鼠運(yùn)動(dòng)。兩組均喂養(yǎng)4周。

1.2 觀察方法

采集兩組大鼠眼底靜脈血樣3mL；立即處死，剖取肝臟，放入冷生理鹽水當(dāng)中充分漂洗，以濾紙完全吸干，以肉眼觀察大鼠的外觀并稱取質(zhì)量，依肝質(zhì)量（g）/體質(zhì)量（g）×100%公式計(jì)算肝指數(shù)。將肝臟分為兩部分，其中一部分肝臟以甲醇-氯仿以1∶1比例制備為100g/L的肝臟組織勻漿，使用離心機(jī)以2000r/min速度離心后取得上層上清液待檢；另一部分肝臟組織以100g/L甲醛溶液完全固定，使用石蠟包埋制作切片。所制作的石蠟切片以HE染色后于光鏡下觀測(cè)肝臟脂肪的變程度，以肝小葉中的含脂滴細(xì)胞數(shù)量/總細(xì)胞數(shù)量計(jì)算的結(jié)果作為判斷肝細(xì)胞脂肪病變的程度，以0為-、以<1/3為+、以1/3～2/3為++、以>2/3為+++。

檢測(cè)并比較對(duì)照組與觀察組大鼠肝組織當(dāng)中Pgp的表達(dá)水平，使用免疫組化測(cè)定，一抗使用羊抗鼠Pgp單克隆抗體（Invitrogen公司出品），免疫組化樣品為DAB染色，以蘇木素對(duì)全部樣本的細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染。使用Imagepro plus-6.0分析軟件分析Pgp顯色的強(qiáng)度，獲取單個(gè)組織區(qū)域面積的平均光度值。

將對(duì)照組與觀察組大鼠血樣進(jìn)行生化分析并比較，將血樣以離心機(jī)離心取得上層血清，使用全自動(dòng)型生化分析儀檢測(cè)血清中各項(xiàng)肝功能相關(guān)指標(biāo)包括：谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、膽紅素（BIL）、總膽汁酸（TBA），脂質(zhì)相關(guān)指標(biāo)包括總?cè)８视停═G）、總膽固醇（Tch），肝組織勻漿中的Tch、TG及TBA水平。分析肝細(xì)胞脂肪病變的程度與Pgp表達(dá)水平的相關(guān)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

研究相關(guān)數(shù)據(jù)均以手工輸入方式錄入至SPSS20.0軟件，一人錄入、一人復(fù)核。全部數(shù)據(jù)中的計(jì)量資料均采取獨(dú)立樣本均數(shù)t檢驗(yàn)，相關(guān)性采取Spearman等級(jí)相關(guān)分析，等級(jí)資料采取Mann-Whitney U秩和檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組肝臟Pgp光度值與肝指數(shù)比較

對(duì)照組大鼠肝臟Pgp平均光度值為（1.01±0.13），肝指數(shù)為（1.69±0.68）%；觀察組大鼠肝臟Pgp平均光度值為（5.36±1.21），肝指數(shù)（3.35±0.37）%；觀察組肝臟Pgp平均光度值與肝指數(shù)均顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見(jiàn)表1。

2.2 肝臟脂肪病變

觀察組肝臟脂肪病變+++的發(fā)生率為53.33%，對(duì)照組無(wú)+++級(jí)別肝臟脂肪病變發(fā)生，觀察組整體肝臟脂肪病變程度較對(duì)照組嚴(yán)重，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見(jiàn)表2。

2.3 血清與肝勻漿生化指標(biāo)及體質(zhì)量

觀察組與對(duì)照組大鼠初始體質(zhì)量、肝勻漿比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；觀察組與對(duì)照組大鼠血清Tch、肝勻漿TBA比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；兩組其他各項(xiàng)指標(biāo)均可見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見(jiàn)表3。

2.4 相關(guān)性分析

經(jīng)Spearman等級(jí)相關(guān)分析，肝臟脂肪病變程度與肝臟Pgp光度值呈顯著高度正相關(guān)性，r=0.996，0.8

3 討論

肝臟是人體脂肪代謝的一個(gè)主要器官[7-9]。肝細(xì)胞所合成的膽固醇于酯化作用后在27羥化酶與7α羥化酶的共同催化作用下生成膽汁酸，通過(guò)主動(dòng)排泌到達(dá)膽管腔內(nèi)，從而參與到膽汁形成的過(guò)程當(dāng)中，這一過(guò)程是人體膽固醇清除的一項(xiàng)主要渠道。多數(shù)高脂血癥的患者可合并有明顯的肝內(nèi)脂肪異常聚積[10-12]，對(duì)于肝臟功能可形成持續(xù)性損傷，并可進(jìn)一步加重膽固醇代謝的紊亂[13-15]。Pgp糖蛋白以主動(dòng)形式將肝細(xì)胞所合成的膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)入毛細(xì)膽管腔當(dāng)中，促使其參與至肝細(xì)胞對(duì)于膽固醇的代謝過(guò)程。Pgp非選擇性的抑制類藥物能夠有效的控制膽固醇的酯化與合成，分析其主要機(jī)理為抑制劑將膽固醇由細(xì)胞膜至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的這一轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程完全或部分阻滯而形成的。細(xì)胞水平的相關(guān)研究表明Pgp的表達(dá)可致使細(xì)胞內(nèi)的膽固醇總量升高。提示了Pgp的異常表達(dá)對(duì)于膽固醇的代謝紊亂形成與發(fā)展以及肝內(nèi)脂肪發(fā)生沉積的過(guò)程發(fā)揮了促進(jìn)作用。

本研究通過(guò)高脂飼料喂養(yǎng)的方法建立了膽固醇代謝紊亂的大鼠模型，建模后觀察組肝臟脂肪病變+++的發(fā)生率為53.33%，對(duì)照組無(wú)+++級(jí)別肝臟脂肪病變發(fā)生，觀察組整體肝臟脂肪病變程度較對(duì)照組嚴(yán)重，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），能夠滿足本次試驗(yàn)的要求。對(duì)照組大鼠肝臟Pgp平均光度值為（1.01±0.13），肝指數(shù)為（1.69±0.68）%；觀察組大鼠肝臟Pgp平均光度值為（5.36±1.21），肝指數(shù)（3.35±0.37）%；通過(guò)對(duì)比得知觀察組顯著高于對(duì)照組。可見(jiàn)膽固醇代謝紊亂的大鼠當(dāng)中Pgp蛋白出現(xiàn)過(guò)高表達(dá)，其肝臟脂肪的病變程度與肝臟Pgp呈顯著高度正相關(guān)，說(shuō)明肝臟內(nèi)脂肪積聚越嚴(yán)重肝臟Pgp蛋白的表達(dá)水平越高，揭示出Pgp蛋白在膽固醇于肝內(nèi)積聚并逐漸形成代謝紊亂這一全過(guò)程中均發(fā)揮著重要的促進(jìn)作用。同時(shí)通過(guò)對(duì)兩組大鼠的血清相關(guān)生化指標(biāo)觀察發(fā)現(xiàn)，肝功能相關(guān)指標(biāo)、脂質(zhì)相關(guān)指標(biāo)、肝組織勻漿中的Tch、TG及TBA水平均可見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；同時(shí)通過(guò)4周高脂喂養(yǎng)及限制運(yùn)動(dòng)后，觀察組大鼠的體質(zhì)量顯著高于對(duì)照組，肝指數(shù)也顯著高于對(duì)照組大鼠。通過(guò)比較兩組大鼠的肝臟脂肪病變程度我們能夠發(fā)現(xiàn)，觀察組大鼠的病變程度較對(duì)照組更為嚴(yán)重，提示在肝臟脂肪病變程度較高的大鼠中Pgp值、肝指數(shù)、Tch、TG及TBA水平均可見(jiàn)明顯異常改變。

綜上所述，膽固醇代謝紊亂SD大鼠的肝細(xì)胞膜生物泵糖蛋白較正常健康SD大鼠顯著升高，提示Pgp蛋白在膽固醇代謝紊亂的形成與演進(jìn)過(guò)程中均發(fā)揮著重要的促進(jìn)作用，這一研究結(jié)果希望能夠?yàn)榕R床防治及相關(guān)藥物研究提供新的參考與思路。

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（收稿日期：2017-01-27）