梁 喬，趙鳳菊，顧貴波，楊本勇，李井春，魏園園

(遼寧省動物疫病預(yù)防控制中心，遼寧 沈陽 110164)

遼寧地區(qū)豬源大腸埃希菌氨基糖苷類抗生素耐藥基因的檢測與分析

梁 喬，趙鳳菊*，顧貴波，楊本勇，李井春，魏園園

(遼寧省動物疫病預(yù)防控制中心，遼寧 沈陽 110164)

為了解遼寧地區(qū)豬源大腸埃希菌對氨基糖苷類抗生素的耐藥情況，采用K-B紙片法對65株豬源大腸埃希菌菌株進行6種氨基糖苷類抗生素的藥敏試驗，同時采用PCR方法對耐藥菌株rpsl基因和4種氨基糖苷類鈍化酶基因aac(3)-Ⅳ、aadA、aac(6′)-Ⅰb-cr、aacC4進行檢測及序列分析，并將陽性樣品與GenBank中登錄的序列進行同源性比較。結(jié)果顯示，遼寧地區(qū)豬源大腸埃希菌對鏈霉素、妥布霉素、新霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素、慶大霉素的耐藥率分別為26.2%、15.4%、18.5%、29.2%、4.6%、21.5%；23株耐藥菌株rpsl基因檢出率為100%；4種氨基糖苷類鈍化酶基因aac(3)-Ⅳ、aadA、aac(6′)-Ⅰb-cr、aacC4檢出率分別為13.0%、8.7%、69.6%、4.3%。以上結(jié)果表明，在氨基糖苷類抗生素中耐藥性最低的是丁胺卡那霉素，rpsl基因及氨基糖苷類鈍化酶基因普遍存在于遼寧地區(qū)豬源大腸埃希菌中。

豬； 大腸埃希菌； 氨基糖苷類抗生素； 耐藥基因；PCR

氨基糖苷類抗生素如慶大霉素、妥布霉素、鏈霉素等因具有高效、廣譜、藥物動力強等優(yōu)點，在臨床中被廣泛應(yīng)用于人和動物細菌感染的治療，這些藥物主要通過破壞細菌細胞膜的完整性、多環(huán)節(jié)抑制細菌蛋白質(zhì)的合成[1-2]。隨著氨基糖苷類抗生素的不當使用，細菌耐藥問題也日益突出，主要是由于細菌對氨基糖苷類藥物吸收量的減少、產(chǎn)生氨基糖苷類鈍化酶(aminoglycosides-modifyingenzymes,AMEs)以及核糖體結(jié)合位點的減少，其中產(chǎn)生氨基糖苷類鈍化酶是細菌對氨基糖苷類抗生素耐藥最重要的原因[3-4]。目前，革蘭氏陰性菌對氨基糖苷類抗生素的耐藥比率、耐藥表型、耐藥機制的研究成為熱點，并且發(fā)現(xiàn)其耐藥模式能夠在不同種類的細菌間傳播[5]。明確氨基糖苷類作用機制與細菌對氨基糖苷類耐藥機制、掌握細菌的耐藥基因流行情況顯得尤為重要。鑒于此，研究遼寧地區(qū)65株豬源大腸埃希菌株對鏈霉素、妥布霉素、新霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素和慶大霉素6種氨基糖苷類抗生素的耐藥性，并運用建立的PCR檢測方法對rpsl基因和4種氨基糖苷類鈍化酶基因進行檢測與序列分析，旨在掌握遼寧地區(qū)流行的主要氨基糖苷類耐藥基因，進一步了解耐藥的分子機制，從分子水平對大腸埃希菌菌株耐藥及潛在耐藥問題進行分析和推測，進而科學指導臨床用藥。

1 材料和方法

1.1 菌株

65株從遼寧各地區(qū)分離、鑒定的豬源大腸埃希菌，由遼寧省動物疫病預(yù)防控制中心保存。

1.2 主要試劑

鏈霉素、妥布霉素、新霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素和慶大霉素藥敏紙片均購自杭州天和微生物試劑有限公司。DNAzol試劑購自Invitrogen公司；ExTaqDNA聚合酶(5U/μL)、dNTP(2.5mmol/L)、溴化乙錠、DL2000DNAMarker、三羥甲基氨基甲烷核乙酸電泳緩沖液購自寶生物工程(大連)有限公司。其他試劑均為實驗室常規(guī)試劑。

1.3 藥敏試驗

藥敏試驗采用K-B紙片擴散法，病原菌純培養(yǎng)18～24h后，挑取純培養(yǎng)菌落置于無菌生理鹽水中，制成相當于0.5麥氏單位的菌懸液，用滅菌棉簽蘸取適量均勻涂抹到MH瓊脂培養(yǎng)基表面，反復幾次，最后沿平皿周邊繞2圈，貼好紙片后在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～18h，測量藥敏試紙在平板中產(chǎn)生的抑菌環(huán)直徑，判定結(jié)果依據(jù)NCCLS標準進行。

1.4 耐藥基因的PCR檢測

1.4.1 引物設(shè)計及合成 根據(jù)GenBank上登錄的氨基核苷類基因相應(yīng)的核苷酸序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計并合成了5對特異性引物，序列見表1。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物序列及相關(guān)信息

1.4.2 細菌DNA模板的制備 將大腸埃希菌劃線接種于麥康凱培養(yǎng)基，于37 ℃培養(yǎng)18～24 h后，挑選典型菌落，用滅菌生理鹽水制備成0.5麥氏單位的菌懸液，按DNAzol試劑說明書提取基因組DNA-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 PCR反應(yīng)體系及條件 采用25 μL反應(yīng)體系:滅菌去離子水16.375 μL，10×PCR緩沖液2.5 μL，dNTP Mixture(各2.5 mmol/L) 2 μL，ExTaqDNA聚合酶0.125 μL，上、下游特異性PCR引物各1 μL，DNA 2 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。取6 μL擴增產(chǎn)物與1 μL上樣緩沖液混合后，在1.2%瓊脂糖凝膠中進行電泳，紫外凝膠成像儀下觀察結(jié)果。

1.4.4 耐藥基因PCR產(chǎn)物序列測定及分析 選取rpsl基因和4種氨基糖苷類鈍化酶基因aac(3)-Ⅳ、aadA、aac(6′)-Ⅰb-cr、aacC4陽性樣品進行擴增，將擴增產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進行序列測定，并與GenBank基因庫的相應(yīng)基因序列進行同源性比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 藥敏試驗檢測結(jié)果

采用K-B紙片擴散法，對65株豬源大腸埃希菌進行氨基糖苷類藥物藥敏試驗，結(jié)果顯示，共23株對氨基糖苷類藥物耐藥，耐藥率為35.4%(23/65)。其中，對卡那霉素的耐藥率最高，為29.2%(19/65)；其次是鏈霉素26.2%(17/65)、慶大霉素21.5%(14/65)、新霉素18.5%(12/65)、妥布霉素15.4%(10/65)；對丁胺卡那霉素耐藥率最低，為4.6%(3/65) (表2)。

表2 65株豬源大腸埃希菌藥敏試驗結(jié)果

2.2 耐藥基因的PCR檢測結(jié)果

2.2.1rpsl基因的PCR檢測結(jié)果 對23株大腸埃希菌氨基糖苷類耐藥菌株rpsl基因進行擴增，得到長度為374 bp的片段。

2.2.2 4種氨基糖苷類鈍化酶基因的PCR檢測結(jié)果 采用PCR方法對23株氨基糖苷類耐藥菌株進行aac(3)-Ⅳ、aadA、aac(6′)-Ⅰb-cr、aacC4四種鈍化酶基因檢測。由表3可知，23株氨基糖苷類耐藥菌株aac(3)-Ⅳ、aadA、aac(6′)-Ⅰb-cr、aacC4耐藥基因總的檢出率為73.9%(17/23)；aac(3)-Ⅳ的檢出率為13.0%(3/23)，aadA的檢出率為8.7%(2/23),aac(6′)-Ⅰb-cr的檢出率為69.6%(16/23)，aacC4的檢出率為4.3%(1/23)。其中，15株攜帶1種氨基糖苷類鈍化酶基因，占所有菌株的65.2%(15/23)， 2株攜帶2種氨基糖苷類鈍化酶基因,占所有菌株的13.0%(2/23)，僅有1株攜帶3種氨基糖苷類鈍化酶基因，占所有菌株的 4.3%(1/23)，未發(fā)現(xiàn)同時攜帶4種氨基糖苷類鈍化酶基因的菌株。

表3 23株大腸埃希菌中氨基糖苷類藥物主要耐藥基因攜帶情況

2.3 耐藥基因的序列分析

將4種鈍化酶基因aac(3)-Ⅳ、aadA、aac(6′)-Ⅰb-cr、aacC4陽性樣品的測序結(jié)果與GenBank基因庫的相應(yīng)基因序列進行同源性分析發(fā)現(xiàn)，4種基因陽性樣品的同源性分別為100%、99%、100%、99%，23株耐藥菌株經(jīng)rpsl基因測序后未發(fā)現(xiàn)突變。

3 結(jié)論與討論

同時用表型與基因型方法分析遼寧地區(qū)大腸埃希菌對氨基糖苷類藥物的耐藥性，結(jié)果表明，遼寧地區(qū)分離的大腸埃希菌對氨基糖苷類抗生素存在普遍耐藥性。通過表型研究發(fā)現(xiàn)，大腸埃希菌對鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、妥布霉素、新霉素等常用的氨基糖苷類抗生素耐藥性較高，對丁胺卡那霉素的耐藥性較低，這與前人的研究結(jié)果基本一致[4,6,7-8]。通過基因型研究發(fā)現(xiàn)，遼寧地區(qū)大腸埃希菌攜帶的主要氨基糖苷類鈍化酶基因是aac(6′)-Ⅰb-cr，其次是aac(3)-Ⅳ、aadA、aacC4； rpsl基因在23株耐藥菌株中均有攜帶，且未發(fā)現(xiàn)突變。

rpsl基因的作用是編碼核糖體蛋白S12，核糖體蛋白S12也是鏈霉素等抗生素的作用位點。正常情況下，鏈霉素與S12蛋白結(jié)合后能夠抑制細胞生長，rpsl基因突變則能使鏈霉素結(jié)合到核糖體上的能力降低，從而產(chǎn)生耐藥性。rpsl基因主要突變位點在43位(AAG→AGG)和88位(AAG→AGG)，常見的突變類型為43位突變[7]。據(jù)報道，rpsl基因突變率較高，吳雪瓊等[10]對57株結(jié)核分枝桿菌耐藥基因型進行檢測發(fā)現(xiàn)，rpsl基因突變率達82.3%；Tsai等[9]對127株耐藥菌株通過測序的方法來鑒定rpsl基因突變，發(fā)現(xiàn)rpsl基因突變率可高達100%。本試驗中23株菌株均檢測出rpsl基因，且均未發(fā)生突變，證明遼寧地區(qū)豬源大腸埃希菌對鏈霉素的耐藥不是由于rpsl基因突變導致的，鏈霉素耐藥可能存在其他的耐藥機制。

aac(3)-Ⅳ、aadA、aac(6′)-Ⅰb-cr、aacC4四種基因?qū)儆诎被擒疹愨g化酶基因，因產(chǎn)生鈍化酶而產(chǎn)生耐藥性。不同地區(qū)檢出的氨基糖苷類鈍化酶的種類和檢出率也有所不同。湯景元等[11]對我國19個省規(guī)模化豬場的大腸埃希菌進行耐藥基因調(diào)查，檢出主要鈍化酶基因是aadA1和aaC2；于學輝等[12]對我國西南地區(qū)鴨源大腸埃希菌進行耐藥基因調(diào)查，檢出的主要鈍化酶基因是ant(6″)-Ⅰa和ant(6″)-Ⅱa；孫慧等[6]對山東地區(qū)禽源大腸埃希菌進行耐藥基因調(diào)查，檢出主要鈍化酶基因是ant(3″)-Ⅰa、aac(6′)-Ⅰb、aph(3′)-Ⅱa。本試驗中檢出遼寧地區(qū)大腸埃希菌攜帶的主要氨基糖苷類鈍化酶基因是aac(6′)-Ⅰb-cr。aac(6′)-Ⅰb-cr屬于變異基因，首次在假單胞菌屬中被發(fā)現(xiàn)[13]，隨后在國內(nèi)外相關(guān)報道較多[14-17]。本研究結(jié)果表明，aac(6′)-Ⅰb-cr基因在氨基糖苷類耐藥菌株中檢出率較高，這與前人研究結(jié)果一致。aac(3)-Ⅳ基因是至今為止唯一被確定的能夠引起慶大霉素、安普霉素交叉耐藥的基因，相關(guān)研究結(jié)果顯示，大約26%的慶大霉素耐藥大腸埃希菌分離株攜帶該基因[18-19]；aadA基因主要對鏈霉素進行鈍化修飾，能夠通過耐藥質(zhì)粒在細菌間進行耐藥基因的擴散與傳播[20]；aacC4基因在大腸埃希菌中編碼AAC(3)-Ⅳ氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶，AAC(3)-Ⅳ氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶對安普霉素、卡那霉素、慶大霉素、潮霉素及其他幾種氨基糖苷類抗生素均有抑制作用[21]。

抗生素的持續(xù)使用引起了細菌的選擇性進化壓力，產(chǎn)生抗生素耐藥菌，反過來又導致細菌病治療失敗和發(fā)病率的提高[22-24]。因此，對耐藥基因的研究能夠從分子水平上對其耐藥機制進行推測，且能夠及時發(fā)現(xiàn)耐藥基因的變異等問題[25]，對遼寧地區(qū)豬源大腸埃希菌感染的控制與治療具有重要意義。

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DetectionandAnalysisofResistanceGenestoAminoglycosideAntibioticsamongSwineEscherichia coliStrainsinLiaoningArea

LIANGQiao,ZHAOFengju*,GUGuibo,YANGBenyong,LIJingchun,WEIYuanyuan

(PreventionandControlCenterofLiaoningProvinceAnimalEpidemicDisease,Shenyang110164,China)

In order to investigate the aminoglycoside resistance ofEscherichiacoliisolated from swine in Liaoning,the drug sensitivity to six kinds of aminoglycosides antibiotics in 65 strains ofE.coliwere analyzed by K-B method.Meanwhile,PCR was used to detect and analyze the sequences of therpslgene as well as four aminoglycoside modifying enzyme genes includingaac(3)-Ⅳ,aadA,aac(6′)-Ⅰb-crandaacC4.Thehomologouscomparisonwereprocessedamongthedetectedgenesfromtheaminoglycoside-resistantstrainswiththesequencespublishedinGenBank.Theresultsindicatedthattheresistanceratestostreptomycin,tobramycin,neomycin,kanamycin,amikacinandgentamicinwere26.2%,15.4%,18.5%,29.2%,4.6%and21.5%,respectively.Inalltwenty-threeaminoglycoside-resistantstrains,thedetectionrateofrpslwas100%,andthedetectionratesofaac(3)-Ⅳ,aadA,aac(6′)-Ⅰb-crandaacC4were13.0%,8.7%,69.6%and4.3%,respectively.TheseresultssuggestedthattheseE.colistrainspresentedlowestaminoglycosideresistancetoamikacin,andalsorpslgeneandaminoglycosidemodifyingenzymegeneswerecommonlyfoundinE.coliisolatedfromswineinLiaoning.

swine; Escherichia coli;aminoglycosideantibiotics;drugresistancegene;PCR

2017-01-12

遼寧省自然科學基金項目(201402573)

梁 喬(1991-)，女，遼寧莊河人，助理獸醫(yī)師，本科，主要從事畜病檢驗工作。E-mail:15242494959@163.com

*通訊作者：趙鳳菊(1978-)，女，河北廊坊人，高級獸醫(yī)師，碩士，主要從事動物人畜共患病的防控與研究。 E-mail:fengjuzho2003@163.com

S

A

1004-3268(2017)06-0134-04