楊 利，石 昂，李新果，李雙雙，時慶賀，鄭關(guān)民，王玉國，陳 陸，王川慶

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州450002)

PRV感染PK-15細(xì)胞對prv-miR-LLT11a表達(dá)時相的影響

楊 利，石 昂，李新果，李雙雙，時慶賀，鄭關(guān)民，王玉國，陳 陸*，王川慶

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州450002)

為研究偽狂犬病病毒(PRV)的致病機制，將PRV QBA株按0.5個感染復(fù)數(shù)(MOI)的劑量接種PK-15細(xì)胞，分別在感染后0、1、2、4、6、8、12、24 h收取細(xì)胞并提取microRNA(miRNA)，采用莖環(huán)引物實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測prv-miR-LLT11a的表達(dá)時相。RT-qPCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，熔解曲線峰值單一，擴(kuò)增曲線拐點清晰。RT-qPCR檢測結(jié)果表明，PRV QBA株感染PK-15細(xì)胞1 h后，prv-miR-LLT11a表達(dá)量極顯著升高，隨后表達(dá)量下調(diào)，在感染6 h后表達(dá)量降至最低，感染8 h后表達(dá)量持續(xù)急劇升高。

偽狂犬病病毒； prv-miR-LLT11a； 莖環(huán)RT-qPCR； 表達(dá)時相

偽狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)是α-皰疹病毒亞科的重要成員，具有嗜神經(jīng)性和潛伏感染性[1-4]。PRV能引起新生仔豬的神經(jīng)癥狀和成年種豬的繁殖障礙以及呼吸系統(tǒng)疾病，在世界范圍內(nèi)給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[5-8]。由于PRV具有典型的潛伏感染特性，在生產(chǎn)上增加了該病的防控難度[9-11]。因此，深入研究PRV的潛伏機制對于防控該病至關(guān)重要。

microRNA(miRNA)是一類廣泛表達(dá)于動植物細(xì)胞中的內(nèi)源性非編碼單鏈小RNA分子，長度約為22個核苷酸，能夠在轉(zhuǎn)錄后通過互補配對的方式結(jié)合到mRNA的3′非編碼區(qū)(3′UTR)發(fā)揮調(diào)控基因表達(dá)的功能[12]。miRNA具有重要的生物學(xué)功能，參與機體的生長發(fā)育、代謝凋亡、免疫反應(yīng)和腫瘤形成等[13-14]。近年來，在人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)、卡波氏肉瘤病毒(Kaposi’s sarcoma-associated herpes virus，KSHV)、Epstein-Barr病毒(EBV)等皰疹病毒上的研究表明，病毒編碼的miRNA在病毒逃避免疫清除方面起到重要作用[15]。前人研究發(fā)現(xiàn)，PRV Ea株感染PK-15細(xì)胞后，PRV長潛伏相關(guān)轉(zhuǎn)錄本(large latency transcript，LLT)基因能夠轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生包括prv-miR-LLT11a在內(nèi)的11個成熟miRNA[16]。目前，對于這11種miRNA的表達(dá)時相及其生物學(xué)功能還未進(jìn)行深入的研究。鑒于病毒編碼miRNA在病毒與宿主互作過程中起到的重要作用，對miRNA的表達(dá)時相及基因調(diào)控機制進(jìn)行深入研究顯得尤為重要。為此，以prv-miR-LLT11a為研究對象，以從河南某豬場分離到的PRV野生毒株QBA為感染毒株，采用莖環(huán)引物實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)檢測其感染PK-15細(xì)胞后prv-miR-LLT11a的表達(dá)時相變化，旨在為研究PRV的致病機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 病毒與細(xì)胞

PRV QBA株為從河南某豬場分離并保存的野生毒株；PK-15細(xì)胞系購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)。

1.2 試劑與儀器

DMEM培養(yǎng)基購自GIBCO公司；胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；第一鏈cDNA合成試劑盒(SK2445)、SG Fast qPCR Master Mix(High Rox)(BBI)熒光定量試劑盒 (B639273)以及microRNA抽提試劑盒(B518811)均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

PCR反應(yīng)擴(kuò)增儀購自BIO公司；StepOne型熒光定量PCR儀購自ABI公司。

1.3 PRV感染PK-15細(xì)胞樣品的制備

按6.0×105個細(xì)胞/孔的量將PK-15細(xì)胞鋪入六孔板，37 ℃條件下于5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞長滿單層時按0.5個感染復(fù)數(shù)(MOI)的量接種PRV QBA毒株，吸附1 h后換含有2%胎牛血清的維持液，此時記為0 h。分別在感染后0、1、2、4、6、8、12、24 h收取細(xì)胞，凍存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 miRNA提取與反轉(zhuǎn)錄

參照柱式miRNA抽提試劑盒(B518811_ZH_P)操作手冊，進(jìn)行miRNA的提取，甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，分光光度計分別測定miRNA提取物的OD260/280和OD260/230值。使用特異性莖環(huán)引物，參照第一鏈cDNA合成試劑盒(SK2445)操作說明書，取1 μg總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 RT-qPCR引物設(shè)計

根據(jù)miRBase提交的prv-miR-LLT11a(登錄號：MI0022083)成熟序列設(shè)計特異性莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄引物prv-miR-LLT11a RT。應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件分別設(shè)計目的基因prv-miR-LLT11a和內(nèi)參基因U6(GenBank:EU520423.1)RT-qPCR引物prv-miR-LTT11a-F/prv-miR-LTT11a-R和U6-F/U6-R，內(nèi)參基因U6下游引物U6-R同時作為其反轉(zhuǎn)錄引物。通過Blast檢測引物的特異性，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列見表1。

表1 目的基因和內(nèi)參基因引物序列

1.6 RT-qPCR檢測prv-miR-LLT11a的相對表達(dá)量

RT-qPCR總體系20 μL：2× SYBR Green qPCR Master Mix(High Rox)10 μL，上、下游引物各0.4 μL，模板cDNA 2 μL，加7.2 μL的ddH2O補至20 μL。每個樣本設(shè)置3個重復(fù)。RT-qPCR循環(huán)參數(shù)：95 ℃ 3 min預(yù)變性；95 ℃ 7 s，57 ℃ 10 s，72 ℃ 15 s，共45個循環(huán)。以U6基因為內(nèi)參，采用2-△△Ct計算prv-miR-LLT11a的相對表達(dá)量，所得數(shù)據(jù)用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 miRNA樣品的質(zhì)量檢測

從圖1可以看出，miRNA樣品在瓊脂糖凝膠電泳中條帶單一，無彌散，表明miRNA完整性較好。使用分光光度計測定的miRNA樣本OD260/280值介于1.9～2.0，表明所提miRNA樣品中含蛋白質(zhì)、DNA等雜質(zhì)較少，純度較高且質(zhì)量良好，可以用于后續(xù)反轉(zhuǎn)錄試驗(表2)。

M為DNA Marker；1—8分別為感染0、1、2、4、6、8、12、24 h的樣品

2.2 RT-qPCR引物特異性檢測

從圖2和圖3可以看出，RT-qPCR擴(kuò)增曲線

表2 miRNA樣品的質(zhì)量檢測

拐點清晰，熔解曲線峰值單一，表明prv-miR-LLT11a及內(nèi)參基因U6引物特異性好，擴(kuò)增過程中沒有產(chǎn)生引物二聚體或非特異性擴(kuò)增，定量結(jié)果準(zhǔn)確可靠，數(shù)據(jù)可以用于下一步分析。

圖2 prv-miR-LLT11a 擴(kuò)增曲線(A)和熔解曲線(B)

圖3 內(nèi)參基因U6擴(kuò)增曲線(A)和熔解曲線(B)

2.3 莖環(huán)引物RT-qPCR檢測prv-miR-LLT11a的表達(dá)時相

RT-qPCR結(jié)果顯示，PRV QBA株感染PK-15細(xì)胞1 h后，prv-miR-LLT11a的表達(dá)量極顯著升高；感染后2 h的表達(dá)量較1 h時開始顯著下降，感染后6 h表達(dá)量降至最低，從感染后8 h開始表達(dá)量持續(xù)急劇升高(圖4)。prv-miR-LLT11a在PRV QBA株感染PK-15細(xì)胞后呈現(xiàn)極顯著的差異性表達(dá)，提示其在PRV感染宿主過程中可能起到基因調(diào)控作用。

圖4 PRV感染PK-15細(xì)胞期間prv-miR-LLT11a不同時間點的相對表達(dá)量

3 結(jié)論與討論

miRNA是近年生命科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點之一，幾乎所有的高等動物、植物和多種DNA病毒都可以編碼產(chǎn)生miRNA，miRNA廣泛參與細(xì)胞的增殖分化、凋亡代謝、免疫應(yīng)答等過程[17-19]。新生成的雙鏈miRNA的一條鏈可進(jìn)入RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體中(RNA-induced silencing complex，RISC)中發(fā)揮成熟miRNA的功能，指導(dǎo)RISC作用于靶mRNA[20]，其互補鏈則會被降解。前人研究發(fā)現(xiàn)，PRV Ea株感染PK-15細(xì)胞后其LLT基因能夠轉(zhuǎn)錄出11個成熟的miRNA，除LLT之外的基因組還能夠轉(zhuǎn)錄出25個新的miRNA[21]。目前，關(guān)于這些miRNA在病毒感染期間的表達(dá)時相及其功能尚不清楚。莖環(huán)RT-qPCR是檢測miRNA比較常用的方法，需要針對每一條miRNA進(jìn)行莖環(huán)引物設(shè)計，特異性強、靈敏度高。本研究采用莖環(huán)引物RT-qPCR檢測PRV QBA株感染PK-15細(xì)胞后prv-miR-LLT11a的表達(dá)時相變化，結(jié)果表明，病毒感染1 h后，prv-miR-LLT11a的表達(dá)量顯著升高；隨后逐漸下降，至6 h達(dá)到最低；8 h后開始持續(xù)急劇升高。1型皰疹病毒(HSV-1)編碼的miR-H2和miR-H4-3p可以分別作用于早期基因ICP0和晚期基因ICP34.5，有利于HSV-1調(diào)控病毒生命周期和建立潛伏感染狀態(tài)[22-23]。prv-miR-LLT11a是否起到與miR-H2和miR-H4-3p相類似的功能還需要進(jìn)一步研究。

PRV具有潛伏感染的特性，病毒在體內(nèi)建立潛伏感染的前提是逃避宿主免疫清除，但是PRV逃避免疫清除以及潛伏的機制還不清楚。目前，研究miRNA功能較成熟的皰疹病毒如HCMV、KSHV、 EBV等，在促進(jìn)病毒逃避免疫清除方面都有比較深入的發(fā)現(xiàn)，對研究PRV編碼的miRNA的功能有一定的借鑒意義。研究發(fā)現(xiàn)，HCMV、KSHV、EBV 三種皰疹病毒分別編碼的miR-UL112-1、miR-K12 cluster、pri-miR-BART2都能靶向作用于主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ類分子相關(guān)鏈B(major histocompatibility complex class Ⅰ-related chain B，MICB)基因，并抑制其表達(dá)，而MICB作為NK細(xì)胞激活受體NKG2D的配體，在促進(jìn)NK細(xì)胞殺傷受感染的靶細(xì)胞過程中起關(guān)鍵作用，進(jìn)而幫助病毒逃逸免疫清除[15,20,24]。對KSHV進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，其編碼的miR-K12-1,3,4-3p能夠同時靶向并上調(diào)作為細(xì)胞凋亡重要調(diào)控因子的半胱天冬酶3的表達(dá)，間接促進(jìn)細(xì)胞凋亡，有利于病毒逃逸[25]。同為皰疹病毒的PRV在感染PK-15細(xì)胞后不同時間，其編碼的prv-miR-LLT11a呈極顯著差異性表達(dá)，提示其可能參與了病毒與宿主的互作過程。

目前，對miRNA的研究主要集中在基因調(diào)控方面，對其在病毒感染期間的表達(dá)時相研究還比較少。而對于miRNA表達(dá)時相的研究有助于發(fā)掘差異性表達(dá)顯著的miRNA，此類miRNA極有可能參與基因調(diào)控影響病毒與宿主的相互作用，研究miRNA的表達(dá)時相可以進(jìn)一步篩選出病毒感染期間表達(dá)差異性顯著的miRNA，對后續(xù)研究其基因調(diào)控功能以及揭示調(diào)控機制都是必要的。本研究采用莖環(huán)引物RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，prv-miR-LLT11a在PRV QBA株感染PK-15細(xì)胞后呈極顯著的差異性表達(dá)，這可能與病毒的免疫逃逸與潛伏有關(guān)，為下一步研究prv-miR-LLT11a的基因調(diào)控功能奠定了基礎(chǔ)。

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Effects on Temporal Expression of prv-miR-LLT11a in PK-15 Cells Infected by Pseudorabies Virus

YANG Li,SHI Ang,LI Xinguo,LI Shuangshuang,SHI Qinghe,ZHENG Guanmin,WANG Yuguo,CHEN Lu*,WANG Chuanqing

(College of Animal Husbandry and Veterinary,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China)

In order to study the pathogenic mechanism of pseudorabies virus(PRV),PK-15 cells were infected with PRV QBA strain at 0.5 MOI,and cells were harvested and microRNA(miRNA) were extracted at 0,1,2,4,6,8,12,24 hours post infection(hpi).Then the temporal expression of prv-miR-LLT11a was detected by stem-loop real-time quantitative PCR(RT-qPCR).The amplification results of RT-qPCR showed that the melting curve had a single peak and a clear inflection point.RT-qPCR data showed that the expression of prv-miR-LLT11a remarkably significant increased in PK-15 cells after 1 hour infection with PRV QBA strain,then decreased.Its expression level decreased to the lowest level at 6 hpi,and increased significantly after 8 hpi.

PRV; prv-miR-LLT11a; stem-loop RT-qPCR; temporal expression

2016-12-22

國家自然科學(xué)基金項目(31272567)；河南省高?？萍紕?chuàng)新人才支持計劃項目(14HASTIT022)；河南省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊支持計劃項目(14IRTSTHN015)

楊 利(1989-)，男，河南汝南人，在讀碩士研究生，研究方向：病毒分子生物學(xué)。E-mail:yangli8189@163.com

*通訊作者：陳 陸(1971-)，男，河南羅山人，教授，博士，主要從事動物傳染病發(fā)病機理與防控研究。 E-mail:chenluhau@126.com

S855.3

A

1004-3268(2017)06-0120-05