劉梅訊++孫天敏

[摘要] 目的 探討絞股藍(lán)皂苷（GPs）對癡呆小鼠認(rèn)知能力的作用及其機(jī)制。 方法 聯(lián)合使用三氯化鋁、D-半乳糖和亞硝酸鈉復(fù)制阿爾茨海默?。ˋD）小鼠模型；按照隨機(jī)數(shù)字表法分為：AD模型組、GPs 50 mg/kg組、GPs 150 mg/kg組、GPs 250 mg/kg組、安理申組及正常組；3個GPs組給予不同劑量的GPs，連續(xù)給藥3個月，觀察各組抗氧化指標(biāo)和形態(tài)學(xué)染色的差異。 結(jié)果 GPs 250 mg/kg組與AD模型組、GPs 150 mg/kg組比較，潛伏期、第一次穿越原平臺位置時間明顯縮短（P < 0.05或P < 0.01），而在原平臺象限的活動時間明顯變長（P < 0.05或P < 0.01），且接近正常組（P > 0.05）。與AD模型組比較，GPs 150 mg/kg組、GPs 250 mg/kg組超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化酶（GSH-Px）活性依次升高（P < 0.05），而丙二醛（MDA）含量依次降低（P < 0.05）；且GPs 250 mg/kg組上述三個指標(biāo)接近正常組（P > 0.05）。HE染色：AD模型組海馬CA2區(qū)錐體細(xì)胞數(shù)量少、排列不整齊，結(jié)構(gòu)模糊，而GPs 250 mg/kg組神經(jīng)元數(shù)量多，排列較均勻、整齊，結(jié)構(gòu)較清晰。 結(jié)論 GPs通過抗氧化等作用保護(hù)海馬神經(jīng)元，從而改善癡呆小鼠的認(rèn)知能力。

[關(guān)鍵詞] 阿爾茨海默??；絞股藍(lán)皂苷；抗氧化；學(xué)習(xí)記憶

[中圖分類號] R749.16；R-332 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）05（a）-0017-04

Function and its mechanism of gypenoside on improving cognitive competence of dementia mice

LIU Meixun1 SUN Tianmin2

1.Medical Imaging Center， Taihe Hospital Affiliated to Hubei University of Medicine， Hubei Province， Shiyan 442000， China； 2.Library， Hubei University of Medicine， Hubei Province， Shiyan 442000， China

[Abstract] Objective To discuss function and its mechanism of Gypenosides （GPs） on improving cognitive competence of dementia mice. Methods Alzheimer's disease （AD） mice model was copied by combining alchlor， D-galactose and sodium nitrite. According to the random number table method， these mice were divided into AD model group， GPs 50 mg/kg group， GPs 150 mg/kg group， GPs 250 mg/kg group， Aricept group and normal group randomly. Three GPs groups were injected with different doses of GPs for three consecutive months to observe the differences in anti-oxidative index and morphological staining pattern of the three groups. Results The incubation period and the time when the original platform position was passed through for the first time were shortened significantly （P < 0.05 or P < 0.01）， GPs 250 mg/kg group comparied with AD model group and GPs150 mg/kg group， the activity time in the original platform quadrant extended obviously （P < 0.05 or P < 0.01）， and it closes to the normal group （P > 0.05）. Comparied with AD model group， the SOD， GSH-Px activities of GPs 150 mg/kg group， GPs 250 mg/kg group rose respectively （P < 0.05）， and MDA concentration decreased （P < 0.05）， but the above four indexes of GPs 250 mg/kg group were approximate to the normal group （P > 0.05）. HE staining： the quantity of pyramidal cells in hippocampal CA2 sector decreased and arranged irregularly with an obscure structure. But there was a large amount of neuron in GPs 250 mg/kg group， which arranged evenly and orderly with a clear structure. Conclusion GPs protects hippocampal neuron by its anti-oxidability， further improving the cognitive competence of dementia mice.

[Key words] Alzheimer's disease； Gypenosides； Anti-oxidability； Learning and memory

阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD），又稱老年性癡呆，由德國醫(yī)生Alois Alzheimer于1906年最先描述，是與年齡高度相關(guān)的、以進(jìn)行性認(rèn)知障礙為主要表現(xiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病[1]。關(guān)于其發(fā)病機(jī)制，目前公認(rèn)的是神經(jīng)元外由β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）組成的老年斑（senile plaques，SP）和神經(jīng)元內(nèi)由異常磷酸化tau蛋白（p-tau）組成的神經(jīng)原纖維絲纏結(jié)（neurofibrillary tangles，NFTs）共同演繹著AD發(fā)生、發(fā)展的全過程[2]。但仍缺乏根治藥物。絞股藍(lán)皂苷（gypenosides，GPs）具有多種生理活性。前期同行研究發(fā)現(xiàn)，GPs能改善AD小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，同時減少腦Aβ和p-tau表達(dá)[2-3]。本課題組在前期研究的基礎(chǔ)上，運用生化檢測、形態(tài)學(xué)染色等方法進(jìn)一步觀察GPs對AD腦的影響，以闡明GPs對抗AD的主要機(jī)制，為其可能被開發(fā)成抗AD新藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑

健康雄性昆明小鼠100只，SPF級，10月齡，體質(zhì)重（40±5）g。由湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院實驗動物中心[許可證號：SCXK（鄂）2016-0008、SYXK（鄂）2016-0031]提供。用藥前將小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周，自由飲食，室溫在20～22℃，相對濕度40%～70%，每日光照12 h，SPF；且采用跳臺試驗剔除逃避反應(yīng)明顯遲緩者。MT-200水迷宮行為學(xué)跟蹤系統(tǒng)購于成都泰盟科技有限公司。GPs（陜西浩洋生物，純度>98%），D-半乳糖（D-galactose；純度>98%）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）試劑盒、谷胱甘肽過氧化酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒（武漢博士德）。

1.2 復(fù)制AD小鼠模型

聯(lián)合使用三氯化鋁、D-半乳糖和亞硝酸鈉復(fù)制AD模型。①三氯化鋁（40 mg/kg），按每只小鼠平均飲水5 mL/天配制液體，讓小鼠自由飲用；②D-半乳糖（500 mg/kg）、亞硝酸鈉（45 mg/kg），配成水溶液、頸背部皮內(nèi)注射。均持續(xù)用藥3個月。隨后行Morris水迷宮測試，若定向航行實驗第5天潛伏期>40 s，并隨機(jī)抽取其中10%小鼠做病理學(xué)檢查，出現(xiàn)海馬神經(jīng)元減少、Aβ斑或SP斑或神經(jīng)原纖維變性甚至NFTs，則該批小鼠確定為AD動物模型，即成功復(fù)制小鼠AD模型。

1.3 分組與給藥

AD模型制作成功后，取AD小鼠50只，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為5個組：AD模型組，GPs 50 mg、150、250 mg/kg組，安理申組，每組各10只；另取健康小鼠10只為正常組，共6組。3個GPs組給予相應(yīng)劑量的GPs；安理申組按3 mg/kg給藥；AD模型組和正常組給予同體積/體重的生理鹽水。每天7：00～9：00灌胃，各組均連續(xù)給藥3個月。

1.4 小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的測試

①定位航行實驗：連續(xù)進(jìn)行5 d。每天每只小鼠接受3次訓(xùn)練，分別從不同象限的中點，頭朝池壁入水、去尋找平臺，記錄每只小鼠找到并爬上平臺的時間即潛伏期。訓(xùn)練開始時先讓小鼠在目標(biāo)平臺上適應(yīng)15 s。若小鼠在60 s內(nèi)未找到平臺，則計其潛伏期為60 s。小鼠無論找到平臺與否，均安排其在平臺上休息15 s，且間隔30 min后、進(jìn)行下一輪訓(xùn)練。②空間探索實驗：在定位航行實驗結(jié)束后的第1天進(jìn)行。除去平臺，讓小鼠自由尋找平臺，時間30 s。記錄每只小鼠在原平臺象限活動的時間以及第一次穿越原平臺位置的時間。

1.5 取材與染色

行為學(xué)測試完畢、即斷頭取腦：①靠近枕骨、將小鼠頭剪斷，放在已準(zhǔn)備好的冰盤上，并用剪刀剪掉頭后部的軟組織；②沿中線由后向前剪開小鼠頭皮，并將皮膚、皮下組織向兩側(cè)分離，暴露顱骨；③沿中線剪開枕骨、頂骨直至頂、額兩骨分界處，用鑷子將顱骨向兩側(cè)快速掀開；④輕輕將腦組織與顱骨分開，剪斷與顱骨相連的腦神經(jīng)、腦膜等軟組織，取出全腦，從前囟后2.3 mm至前囟后6.3 mm處、切取大腦皮質(zhì)和海馬，用生理鹽水清洗干凈，放入液氮中保存。常規(guī)進(jìn)行HE染色。

1.6 生化檢測

從液氮中取出小鼠大腦皮質(zhì)和海馬，稱量、剪碎，按質(zhì)量與體積比（W/V）1∶9加入4℃生理鹽水，采用電動勻漿機(jī)（離心半徑22.5 cm，3000 r/min）制成10%大腦皮質(zhì)、海馬組織勻漿液，離心15 min，取上清液、分裝在EP管中備用。按照SOD試劑盒、GSH-Px試劑盒、MDA試劑盒說明書嚴(yán)格操作，分別測定SOD、GSH-Px活性和MDA含量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 22.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗或確切概率檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的測試結(jié)果

2.1.1 學(xué)習(xí)能力檢測 潛伏期越短，學(xué)習(xí)能力越強(qiáng)。隨著訓(xùn)練的天數(shù)、次數(shù)增加，各組潛伏期均在縮短，其中正常組、GPs 250 mg/kg組縮短的幅度較大。到訓(xùn)練的第5天，正常組的潛伏期明顯短于AD模型組（P < 0.01），GPs 150 mg/kg組、GPs 250 mg/kg組也明顯短于AD模型組（P < 0.05或P < 0.01），尤其是GPs 250 mg/kg組（P < 0.01）。見圖1。

2.1.2 記憶能力檢測 穿越原平臺位置的潛伏期越短或者在原平臺象限活動時間長，表示記憶能力較強(qiáng)。第一次穿越原平臺位置的時間，正常組明顯短于AD模型組（P < 0.01），GPs 150 mg/kg組、GPs 250 mg/kg組也明顯短于AD模型組（P < 0.05或P < 0.01），尤其是GPs 250 mg/kg組（P < 0.01）。見圖2A。正常組在原平臺象限的活動時間明顯長于AD模型組（P < 0.01），GPs 150 mg/kg組、GPs 250 mg/kg組及安理申組在原平臺象限的活動時間也明顯長于AD模型組（P < 0.05或P < 0.01），尤其是GPs 250 mg/kg組（P < 0.01）。見圖2B。

2.2 各組小鼠SOD、GSH-Px活性及MDA含量檢測結(jié)果

與AD模型組比較，GPs 50 mg/kg組、GPs 150 mg/kg組、GPs 250 mg/kg組SOD、GSH-Px活性依次升高，而MDA含量依次降低；其中與后兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。但GPs 250 mg/kg組與正常組，GPs 50 mg/kg組與AD模型組，GPs 150 mg組與安理申組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見表1。

2.3 HE染色，觀察神經(jīng)元形態(tài)和數(shù)量的改變

正常組海馬CA2區(qū)錐體細(xì)胞體積大、層次多、排列整齊，結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞核較大（圖3A）。AD模型組海馬CA2區(qū)神經(jīng)元數(shù)量少、排列不整齊，結(jié)構(gòu)模糊，細(xì)胞體積小，細(xì)胞漿深染，細(xì)胞核固縮（圖3B）。安理申組海馬CA2區(qū)神經(jīng)元形態(tài)較AD模型組有明顯的改善，但結(jié)構(gòu)仍不十分清晰（圖3C）。GPs 50 mg/kg組海馬CA2區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)有改善、但不明顯（圖3D）；GPs 150 mg/kg組海馬CA2區(qū)結(jié)構(gòu)明顯改善，與安理申組相似（圖3E）；而GPs 250 mg/kg組海馬CA2區(qū)組織結(jié)構(gòu)進(jìn)一步改善，錐體細(xì)胞數(shù)量多，排列較均勻、整齊，結(jié)構(gòu)較清晰（圖3F）。

3 討論

本實驗聯(lián)合使用三氯化鋁、D-半乳糖和亞硝酸鈉成功建立小鼠AD模型，其認(rèn)知功能明顯障礙，并產(chǎn)生AD部分病理特征，說明模型制作成功[4]。實驗結(jié)果顯示，對AD模型小鼠采用GPs低、中、高劑量連續(xù)灌胃3個月后，進(jìn)行行為學(xué)測試。在定位航行實驗中，隨著訓(xùn)練次數(shù)的增加，各給藥組小鼠包括GPs 50 mg/kg、150 mg/kg、250 mg/kg組，安理申組的潛伏期均逐漸縮短，其中GPs 250 mg/kg組潛伏期變得最短；而在空間探索實驗中，第一次穿越原平臺位置時間、在原平臺象限的活動時間，在GPs 250 mg/kg組分別是最短與最長，這說明給予250 mg/kg GPs更有利改善AD小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力和空間記憶保持能力[5]。

實驗結(jié)果進(jìn)一步顯示，AD模型組小鼠大腦皮質(zhì)和海馬組織中SOD、GSH-Px活性明顯下降和MDA表達(dá)明顯上升。這表明小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了脂質(zhì)過氧化（lipid peroxidation，LPO），且氧自由基（ROS）已損傷腦組織。我們知道，SOD、GSH-Px均是體內(nèi)十分重要的抗氧化酶，它們保護(hù)著皮質(zhì)、海馬等腦組織免受自由基等氧化因子的攻擊；而MDA是脂質(zhì)過氧化后的代謝產(chǎn)物，其濃度標(biāo)志脂質(zhì)過氧化的程度[6]。在正常情況時，ROS的產(chǎn)生與抗氧化酶的清除處于動態(tài)平衡狀態(tài)。在AD模型制作過程中，三氯化鋁毒性可導(dǎo)致小鼠細(xì)胞膜完整性的喪失，可通過損害膜結(jié)構(gòu)及膜酶、介導(dǎo)脂質(zhì)過氧化[7]；長時間注射D-半乳糖，其代謝產(chǎn)物半乳糖醇不能進(jìn)一步代謝而堆積在細(xì)胞內(nèi)，影響滲透壓，引起細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致一系列氧化損傷[8]；亞硝酸鈉的氧化性能將血紅蛋白中的二價鐵氧化成三價鐵，失去攜帶、輸送氧氣功能，使機(jī)體組織產(chǎn)生缺氧性中毒[9]。尤其三者聯(lián)合、持續(xù)作用，造成小鼠腦組織嚴(yán)重脂質(zhì)過氧化，ROS大量增加，而抗氧化酶如SOD、GSH-Px濃度、活性持續(xù)降低，同時脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物如MDA濃度不斷增高，從而打破了上述的這種平衡[10]。GPs是從絞股藍(lán)中分離出來、與人參皂苷有類似骨架的達(dá)瑪烷型絞股藍(lán)皂苷，具有抗氧化、抗衰老、抗?jié)?、抗癌、?zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、降血脂等作用。本實驗數(shù)據(jù)提示，GPs可提高癡呆鼠腦組織中SOD、GSH-Px活性，促進(jìn)自由基清除，減輕自由基介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化，同時降低MDA含量[11]。這樣，就重新恢復(fù)了脂質(zhì)過氧化與抗氧化損傷的平衡。

實驗結(jié)果還顯示，AD小鼠海馬CA2區(qū)神經(jīng)元數(shù)量少、排列零亂、結(jié)構(gòu)模糊。這一病理改變，是三氯化鋁、D-半乳糖和亞硝酸鈉聯(lián)合、持續(xù)作用的結(jié)果[12]。一是脂質(zhì)過氧化作用：產(chǎn)生ROS連鎖反應(yīng)，損傷生物膜，神經(jīng)細(xì)胞變性、壞死[13]；二是可能出現(xiàn)的Aβ斑或SP斑：由β淀粉樣前體蛋白水解產(chǎn)生Aβ，并分泌、沉積在細(xì)胞外基質(zhì)中形成，有神經(jīng)毒性，它能使血管壁淀粉樣變、硬化，甚至破裂或形成血栓，還能誘導(dǎo)神經(jīng)元過早凋亡[14]；三是有可能產(chǎn)生的神經(jīng)原纖維變性或NFTs：即過度磷酸化Tau蛋白形成，使神經(jīng)原纖維退化、萎縮，大腦早老化，NFTs與臨床癡呆程度密切相關(guān)[15]。這3個發(fā)生、發(fā)展過程單個或聯(lián)合作用，均能導(dǎo)致神經(jīng)元及其之間的突觸丟失[16-19]。然而，GPs 250 mg組神經(jīng)元數(shù)量多，排列較均勻、整齊，結(jié)構(gòu)較清晰。這是GPs對抗脂質(zhì)過氧化、從而減輕Aβ、過度磷酸化Tau蛋白表達(dá)的結(jié)果。由此，保護(hù)小鼠AD腦皮質(zhì)和海馬神經(jīng)元，提高AD小鼠的認(rèn)知能力[1-3，20]。

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（收稿日期：2016-12-03 本文編輯：蘇 暢）