郭泓利++周小紅++張巖++施漢昌

摘 要：近年來，具有高親和性和特異性的免疫反應在生物化學分析、食品安全和環(huán)境監(jiān)測領域得到越來越廣泛的應用，抗體-抗原親和反應分析方法的研究顯得尤為重要。本文基于平面波導生物傳感器，研究芯片界面抗體-抗原間的相互作用。通過共價結合將包被抗原結合在芯片表面，制備了可重復使用20次的免疫芯片，研究芯片表面的免疫反應動力學，建立芯片表面的熒光免疫動力學方程，獲得了相應的免疫親和參數(shù)。

關鍵詞：平面波導；熒光免疫；動力學分析；抗體-抗原反應

0 引言

近年來，具有高親和性和特異性的免疫反應在醫(yī)學診斷、生物化學分析、食品安全和環(huán)境監(jiān)測領域得到越來越廣泛的應用[1，2]，抗體-抗原親和反應的定性或定量分析方法的研究顯得尤為重要。傳統(tǒng)的分析方法有熱量測定法、電泳分析法、超速離心分析法，但這些方法僅適用于低通量分析，且結果分辨率較差。為了克服傳統(tǒng)方法的缺點，光學生物傳感器開始應用于免疫反應動力學研究，如SPR[3]、BLI[4，5]、光波導生物傳感器[6]，這些技術可以實現(xiàn)實時的動力學反應數(shù)據(jù)分析，并且更加快速和靈敏[7-11]。

本文基于平面波導生物傳感器建立了一種分析芯片界面抗體-抗原免疫反應動力學的方法。該方法研究了芯片表面包被抗原與溶液中單克隆抗體的免疫反應，并得到了芯片界面免疫反應的結合速率、解離速率和親和常數(shù)。本文主要選取了三聚氰胺、黃曲霉素M1、磺胺二甲嘧啶和雙酚A這四種物質的單克隆抗體-抗原反應作為研究對象，研究了在芯片界面的免疫反應動力學，為基于免疫反應的檢測研究提供了數(shù)據(jù)支持和理論依據(jù)。

1 試驗材料和方法

1.1 試驗材料

試驗中使用的材料主要包括如下：BSA（Sigma），三聚氰胺（Mel）、磺胺二甲嘧啶（SM2）、雙酚A（BPA）和黃曲霉四M1（AFM1）單克隆抗體，BSA-Mel，BSA-AFM1，BSA-BPA，BSA-SM2，GMBS（Sigma），Cy5.5-NHS（GE），MTS（Sigma），10mM PBS，100mM PBS，H2SO4，30%H2O2，SDS，HCl，NaOH。

1.2 免疫芯片的制備

本試驗利用MTS和GMBS在芯片表面固定包被抗原。反應流程如圖1所示。主要步驟如下：a.芯片表面羥基化[12]：將干凈的芯片浸泡在piranha溶液中（濃H2SO4/ 30%H2O2體積比為3：1），在110℃下反應60min；b.芯片表面硅烷化：用無水甲苯配置2%的MTS溶液，將芯片置于其中反應2個小時；c.引入偶聯(lián)基團：首先將芯片置于無水乙醇配置的2mM的GMBS溶液中，反應1個小時；d.包被抗原的固定：將15μl0.5mg/ml被抗原滴在芯片的全反射位點上。在溫度為4℃的條件下反應12小時后，用超純水清洗殘留包被抗原，隨后用2mg/ml的BSA溶液封閉芯片表面未反應的活性基團。未測驗時，免疫芯片保存于4℃冰箱，保持芯片表面清潔。

1.3 平面波導生物傳感器

本研究組自主研發(fā)了平面波導生物傳感器，該傳感器主要基于倏逝波和全內反射熒光原理（TIRF）[13，14]，利用全內反射產(chǎn)生的倏逝波激發(fā)芯片表面數(shù)百納米薄層內的熒光基團，從而產(chǎn)生熒光信號，傳感器采用光纖收集熒光信號，再通過光電轉換器將熒光信號轉換為電信號，從而實現(xiàn)定量分析。利用平面波導生物傳感器定量分析目標物質，就必須設計巧妙的方法將目標物質的濃度與熒光信號的強弱建立正相關或者負相關的關系。

該生物傳感器主要由傳感元件、自動進樣系統(tǒng)、光學分析系統(tǒng)和信號處理系統(tǒng)4個部分組成，如圖2所示。

1.4 實驗方法

將固定了BSA-Mel、BSA-BPA、BSA-SM2和BSA-AFM1的生物芯片置于平面波導生物傳感器的反應池。所有反應都在10mM PBS緩沖體系中進行。為了獲得動力學結合數(shù)據(jù)，通入不同濃度的抗體混合液（含有Ab-Mel-Cy5.5、Ab-AFM1-Cy5.5、Ab-SM2-Cy5.5和Ab-BPA-Cy5.5四種標記熒光的抗體）與芯片反應，獲得不同時間條件下的信號強度。每次反應結束后，用0.5% SDS（pH為1.9）的緩沖溶液打斷抗體和芯片表面抗原之間的化學鍵，同時保持芯片表面抗原的活性，實現(xiàn)芯片的重復使用，節(jié)省成本的同時，還能保證結果的一致性。

1.5 反應動力學和親和性分析

抗體和抗原的特異性主要由抗原決定簇的空間位置決定?？贵w在任何一個系統(tǒng)中都有一個有限的親和性，可用解離常數(shù)KD（單位為M）來表示，KD是解離速率（kd，s-1）與結合速率（ka，M-1s-1）的比值[15，16]：

KD=kd/ka （1）

抗體與抗原的反應關系可用以下的關系式來表示：

（2）

其中，AgAb*表示抗體-抗原復合物，Ab* 表示熒光標記的抗體，Ag表示抗原。由于芯片表面質量平衡，芯片界面免疫復合物的濃度變化速率可以表示為：

（3）

其中，[Ag]指抗原的濃度（M），[Ab*]指熒光標記的抗體濃度（M）， 代表抗體-抗原復合物濃度的變化速率（M-1s-1）。

基于平面波導生物傳感器的檢測原理，抗體-抗原復合物的濃度與熒光信號強弱成正相關，因此我們可以得到熒光信號變化速率與抗體濃度、結合速率、解離速率等有關的關系式：

（4）

積分后可得以下關系式：

（5）

其中， 是Cy5.5-抗體的初始濃度，Rt是任意t時刻的響應信號，Rmax是最大的響應信號值。

將實驗數(shù)據(jù)進行積分擬合，獲得相應的動力學關系式和相應參數(shù)，每個響應值R都被重復測量3次，取其平均值用于計算模擬。

2 實驗結果與討論

2.1 芯片界面的熒光免疫反應

將芯免疫片置于平面波導生物傳感器的反應池中，通入不同濃度的抗體混合液，記錄不同時間下的響應信號。圖3為不同濃度的四種抗體與芯片表面抗原的隨時間變化的結合曲線。當抗體濃度過大或者過小時，信號不會隨時間的變化發(fā)生明顯的變化。高濃度時，結合反應容易更快地達到平衡，低濃度時，則需要更長的時間來達到平衡。因此實際反應時，濃度的選擇不可以太低，但是濃度也不宜太高，太高會大大提高檢測的成本。

2.2 動力學和親和力分析結果

為了計算抗體-抗原免疫反應動力學參數(shù)，首先要剔除檢測結果中的一些異常值。為了獲得芯片表面免疫反應的動力學參數(shù)ka和kd，同樣需要確定Rmax值。通過改變抗體濃度，測定平衡時間（t為600s）的信號強度，然后通過Logistic擬合可獲得理論Rmax值，如圖4所示。當芯片表面BSA-Ags為0.5mg/ml時，黃曲霉素M1、雙酚A、三聚氰胺和磺胺二甲嘧啶抗體與芯片反應可以得到的最大理論響應值Rmax分別為23228m.v、45445m.v、15424m.v和15770 m.v。

獲得Rmax后，將圖3的結合結果除以相應的Rmax值，可以得到不同濃度條件下芯片界面免疫反應的結合率（Binding%）隨時間的變化，如圖5所示。結合率為每點的熒光強度與理論擬合得到的反應平衡時最大熒光強度Rmax的比值，由圖中結果可知，反應時間相同，分析物濃度越大，反應達到平衡所需時間越短。

用SPR分析研究免疫動力學時發(fā)現(xiàn)，當平衡時的結合率為100%時，此時使用的初始抗體濃度通常為100KD；當平衡時的結合率為50%時，此時使用的初始抗體濃度通常為KD；當平衡時的結合率接近于0時，此時使用的初始抗體濃度通常為0.1KD。根據(jù)此經(jīng)驗，并且結合圖5，可以迅速選擇合適的抗體濃度用于檢測。

隨后對結果進行積分擬合，得到類似于公式5的關系式：

（6）

（7）

（8）

表1總結了各個免疫反應的參數(shù)A、B和動力學參數(shù)ka，kd，KD。Ab-AFM1、Ab-BPA、Ab-Mel和Ab-SM2四種抗體在芯片界面的免疫反應結合速率ka分別為0.37×106 M-1s-1，3.36×106M-1s-1，1.09×106M-1s-1和5.19×106 M-1s-1。四種抗體的芯片界面免疫反應解離速率kd分別為0.30×10-3s-1，4.74×10-3s-1和3.60×10-3s-1和1.01×10-3s-1。而其免疫解離常數(shù)KD則分別為0.81nM，1.10nM，3.40nM和1.01nM。可見，Ab-AFM1的親和力最好，Ab-Mel的親和力最差。

表2比較了用平面波導生物傳感器與ELISA測量的動力學參數(shù)KD，平面波導測定的KD值都高于ELISA測定值。分析可能原因主要是本次試驗測定的抗體都為熒光標記后的抗體，熒光標記過程會對抗體的親和性產(chǎn)生影響，而ELISA測定的抗體無需標記熒光染料。

2.3 芯片界面免疫反應的重復性能分析

免疫芯片的穩(wěn)定性和重復性是影響檢測的重要指標。由于目標物質通常為小分子，很難直接被固定到芯片上，因此通常將包被抗原作為識別分子共價結合到芯片表面，包被抗原相對于小分子生物特性、化學結構更加穩(wěn)定。為了實現(xiàn)芯片的重復使用，在每一次檢測結束后，采用0.5%的SDS（pH為1.9）溶液清洗芯片表面，使抗體-抗原復合物解離，卻不會破壞芯片表面包被抗原的活性。

從圖6結果可以發(fā)現(xiàn)，Ab-Mel結合信號為7363m.v，20次反應測量結果的相對標準偏差（R.S.D.）為2.79%；Ab-BPA結合信號為20496m.v，20次反應測量結果的相對標準偏差（R.S.D.）為3.44%；Ab-AFM1結合信號為14386m.v，20次反應測量結果的相對標準偏差（R.S.D.）為3.25%；Ab-SM2結合信號為7631m.v，20次反應測量結果的相對標準偏差（R.S.D.）為4.33%。測試結果表明免疫芯片至少可以測試20次以上，并且保證沒有明顯的信號變化（變化在5%以內）。

3 結論

本文基于平面波導生物傳感器研究了芯片界面的抗體-抗原這類具有高親和力的生物反應間的相互作用。通過共價結合將包被抗原結合在芯片表面，制備了可重復使用20次的免疫芯片，通過熒光信號將物質濃度轉化為電信號，成功地測得了濃度數(shù)據(jù)?；诶碚搫恿W方程，提出了適用于平面波導生物傳感器的動力學反應方程及其數(shù)據(jù)分析方法，成功地獲得了黃曲霉素M1、三聚氰胺、雙酚A和磺胺二甲嘧啶四種乳品中常見污染物的抗體-抗原免疫反應動力學參數(shù)，其KD分別為0.81nM，3.40nM，1.10nM和1.01nM；ka分別為0.37×106M-1s-1，1.09×106M-1s-1，3.36×106M-1s-1和5.19×106M-1s-1；kd分別為0.30×10-3s-1，3.60×10-3s-1，4.74×10-3s-1和5.25×10-3 s-1。研究結果將有助于更好地了解芯片界面免疫反應的動態(tài)過程，為實際檢測提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

[基金項目] 科技部重大科學儀器開發(fā)專項2012YQ030111