朱德偉，蔡國(guó)林，陸健

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一種豬溶菌酶來(lái)源的抗菌六肽的分離鑒定及其性質(zhì)

朱德偉1,2,3，蔡國(guó)林1,2,3，陸健1,2,3

1江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫 214122 2江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫 214122 3江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無(wú)錫 214122

朱德偉, 蔡國(guó)林, 陸健. 一種豬溶菌酶來(lái)源的抗菌六肽的分離鑒定及其性質(zhì). 生物工程學(xué)報(bào), 2017, 33(6): 1046–1056.Zhu DW, Cai GL, Lu J. Purification, identification and characterization of an anti-microbial hexapeptide from Sus scrofa lysozyme. Chin J Biotech, 2017, 33(6): 1046–1056.

為提高豬溶菌酶 (lysozyme，SSL) 的抗革蘭氏陰性菌活性，將其進(jìn)行了不同蛋白酶的水解，選擇抗革蘭氏陰性菌效果最好的水解產(chǎn)物，利用凝膠過(guò)濾色譜和反相制備色譜進(jìn)行分離，對(duì)其功能成分進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用鑒定。對(duì)分離得到的物質(zhì)進(jìn)行抗菌活性驗(yàn)證和生物信息學(xué)的分析，并在此基礎(chǔ)上對(duì)抗菌物質(zhì)的殺菌機(jī)理進(jìn)行了探討。結(jié)果表明，胰蛋白酶的水解產(chǎn)物具有較高的殺滅革蘭氏陰性菌的活性，進(jìn)一步分離純化得到了具有抗革蘭氏陰性菌活性的六肽A-W-V-A-W-K。經(jīng)化學(xué)合成驗(yàn)證，該六肽既保留了SSL的部分抗菌活性，也具備殺滅多種革蘭氏陰性菌的能力。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)其位于SSL分子C端的一個(gè)螺旋-回環(huán)-螺旋的結(jié)構(gòu)中，并由此推測(cè)其殺菌機(jī)理是通過(guò)改變細(xì)胞膜的滲透性，進(jìn)而使細(xì)胞內(nèi)溶物流出而造成細(xì)胞死亡，而抗菌實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了這一推測(cè)。該抗菌肽的發(fā)現(xiàn)為后續(xù)提高SSL的抗菌活性提供了理論依據(jù)。

豬溶菌酶，大腸桿菌，抗菌肽，抗生素，膜滲透性

由于近年來(lái)食品安全事件的頻發(fā)以及飼用抗生素濫用問(wèn)題的日益凸顯，尋求安全高效的飼用抗生素替代品已經(jīng)刻不容緩。溶菌酶是一種天然的鹽基堿性蛋白質(zhì)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、生物工程以及飼料等領(lǐng)域[1]。而作為C型溶菌酶的一種，豬溶菌酶 (lysozyme，SSL) 是豬體內(nèi)抵抗外源性疾病的一道重要屏障[2-3]。鑒于豬在畜牧行業(yè)中的重要地位，它的發(fā)酵生產(chǎn)為解決飼用抗生素的濫用問(wèn)題提供了選擇[4]。然而，SSL對(duì)革蘭氏陰性菌的殺菌效果并不明顯，這也限制了其應(yīng)用的范圍。因此，提高SSL的抗菌活性，尤其是對(duì)革蘭氏陰性菌的殺滅作用，對(duì)其進(jìn)一步的生產(chǎn)應(yīng)用有著重要意義。

目前，提高溶菌酶抗革蘭氏陰性菌活性的方法主要包括：熱變性[5-6]、化學(xué)修飾[7-8]、抗菌肽的分離[9-10]以及融合表達(dá)[11-12]。其中，熱變性的方法可以提高溶菌酶抗革蘭氏陰性菌的活性，但是會(huì)失去其原有的抗革蘭氏陽(yáng)性菌能力；化學(xué)修飾的方法獲得的產(chǎn)品其穩(wěn)定性不能保證，而且生產(chǎn)過(guò)程較為繁瑣；目前融合表達(dá)的方法雖然可獲得多功能的產(chǎn)物，但是與SSL分子進(jìn)行融合的都是外源蛋白，可能會(huì)成為動(dòng)物體內(nèi)免疫系統(tǒng)或消化酶的作用對(duì)象進(jìn)而影響其在動(dòng)物體內(nèi)的作用；抗菌肽的分離雖然暫時(shí)將溶菌酶的分子破壞，但是它對(duì)進(jìn)一步提高SSL的抗菌活性具有重要指導(dǎo)價(jià)值。比如從SSL分子中分離出對(duì)革蘭氏陰性菌有抗菌功能的肽段，利用其他分子生物學(xué)手段 (如融合表達(dá)) 強(qiáng)化SSL中該抗菌肽的殺菌能力，既可以保持SSL原有的抗菌能力，又能得到性能穩(wěn)定的發(fā)酵產(chǎn)品，是提高SSL抗菌性能的理想途徑。

本研究采用多種蛋白酶對(duì)SSL進(jìn)行酶解。在分析其水解產(chǎn)物的抗革蘭氏陰性菌活性的基礎(chǔ)上，利用凝膠過(guò)濾色譜、反相制備色譜的分離手段，從水解產(chǎn)物中分離得到SSL中對(duì)革蘭氏陰性菌具有殺菌作用的肽段。對(duì)此肽段進(jìn)行生物信息學(xué)的分析以及抗菌特性的研究，為進(jìn)一步強(qiáng)化該肽段在SSL中的作用、增強(qiáng)其抗菌能力提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質(zhì)粒

SSL的原核表達(dá)菌株BL21(DE3)-pET28a(+)- SSL，由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。SSL抗菌活性測(cè)試菌種大腸桿菌ATCC 25922、金黃色葡萄球菌ATCC 25923、克雷伯氏肺炎菌CMCC(B)46117、銅綠短桿菌ATCC 15442以及沙門(mén)氏桿菌CMCC(B) 50335，購(gòu)自無(wú)錫賽維貿(mào)易有限公司；溶壁微球菌ATCC 4698，購(gòu)自南京建成生物科技有限公司；枯草芽孢桿菌(Wild Strain，WS)和解淀粉芽孢桿菌(WS) 由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 試劑與培養(yǎng)基

胃蛋白酶 (Pepsin)、胰蛋白酶 (Trypsin)、梭菌蛋白酶 (Clostripain)、色譜純甲醇、乙腈，購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；凝膠色譜柱Superdex peptide 10/300GL購(gòu)自美國(guó)GE公司；反相制備色譜柱XBridge Prep C18購(gòu)自美國(guó)Waters公司。酵母提取物與胰蛋白胨，購(gòu)自O(shè)xiod公司；其他試劑均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)有限公司。LB培養(yǎng)基 (g/L)：酵母提取物5，胰蛋白胨10，NaCl 10，瓊脂20 (固體培養(yǎng)基)，自然pH，121 ℃滅菌20 min。TSB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨15，大豆蛋白胨5，NaCl 5，pH為7.2±0.2，121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 儀器與設(shè)備

Dimension?IconTM原子力顯微鏡，美國(guó)Bruker公司；Spectra Max Plus 384光吸收酶標(biāo)儀，美國(guó)Molecular Devices公司；AKTATMavant 25蛋白純化系統(tǒng)，美國(guó)GE公司；IKARV10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國(guó)IKA公司；Partec PAS IIIi流式細(xì)胞儀，法國(guó)PARTEC公司；Scientz-10N冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 SSL的發(fā)酵及其復(fù)性

SSL的發(fā)酵及其復(fù)性參照文獻(xiàn)[4]進(jìn)行。SSL表達(dá)宿主在IPTG濃度為0.1 mmol/L、25 ℃、200 r/min條件下誘導(dǎo)表達(dá)8 h后，離心棄上清。超聲波破碎細(xì)胞后，采用氧化還原體系的方法進(jìn)行復(fù)性。復(fù)性后經(jīng)過(guò)一步的超濾純化可得到純度為90%以上的SSL產(chǎn)品。純化后的產(chǎn)品經(jīng)冷凍干燥后于–20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 SSL的蛋白酶水解

分別稱(chēng)取4份1.2.1中得到的SSL產(chǎn)品70 mg，用1 mL 0.03 mol/L NaCl溶液 (pH 7.0) 溶解，前3組分別加入4 mL的蛋白酶溶液 (50 mg/mL胃蛋白酶，pH 2.0；50 mg/mL胰蛋白酶，pH 10.0；或10 U/mL梭菌蛋白酶，pH 7.5)，于37 ℃條件下過(guò)夜酶解。第4組試驗(yàn)中，先加入4 mL的胃蛋白酶溶液，37 ℃反應(yīng)過(guò)夜之后，調(diào)節(jié)溶液pH至10.0，加入200 mg的胰蛋白酶繼續(xù)反應(yīng)12 h。80 ℃保溫30 min將酶滅活之后，10 000 ×離心5 min，取上清液過(guò)0.22 μm濾膜之后進(jìn)行抗菌活性測(cè)定，選擇抗菌活性最高的水解液進(jìn)行下一步的分離純化。其中，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組中的空白為不加SSL的蛋白酶溶液。

1.2.3 抗菌活性測(cè)試以及抗菌肽的最低抑菌濃度 (Minimal inhibitory concentration，MIC)

水解液的抗菌活性測(cè)試參照文獻(xiàn)[9]的方法進(jìn)行。在前期的分離過(guò)程中，以大腸桿菌ATCC 25922為測(cè)試菌進(jìn)行抗菌活性分析。合成抗菌肽的抗菌譜測(cè)定時(shí)，對(duì)1.1.1中涉及的所有測(cè)試菌都進(jìn)行分析。測(cè)定時(shí)設(shè)3組平行，結(jié)果以±的形式表示。對(duì)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的結(jié)果進(jìn)行檢驗(yàn)，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異顯著性。

抗菌肽的MIC測(cè)定參照文獻(xiàn)[13]進(jìn)行。測(cè)試抗菌肽的濃度梯度從1到100 μmol/L (250 μL TSB培養(yǎng)基溶解)。其中不加抗菌肽的測(cè)試菌為陽(yáng)性對(duì)照，不加測(cè)試菌的抗菌肽溶液為陰性對(duì)照，MIC定義為相對(duì)于陽(yáng)性對(duì)照組600無(wú)明顯變化的測(cè)試組所對(duì)應(yīng)的抗菌肽濃度。測(cè)定時(shí)設(shè)3組平行，結(jié)果以±的形式表示。

1.2.4 凝膠過(guò)濾色譜分離

抗菌活性分析后選擇的水解液，經(jīng)過(guò)0.22 μm的濾膜過(guò)濾，然后上樣至凝膠過(guò)濾色譜Superdex peptide 10/300GL。流速為0.5 mL/min，流動(dòng)相為20 mmol/L的PBS緩沖液 (pH 7.0)，每1 mL的洗脫液收集到一個(gè)采樣管。用酶標(biāo)儀對(duì)收集的樣品進(jìn)行蛋白濃度225測(cè)定，同時(shí)進(jìn)行抗菌活性分析 (用大腸桿菌進(jìn)行)。

1.2.5 反相制備色譜分離

選擇凝膠過(guò)濾分離后的樣品，用反相制備色譜Agilent 1100 series結(jié)合色譜柱Phenomenex luna C18 column (7.8 mm×150 mm，5 μm)。流動(dòng)相為含0.1% TFA的無(wú)菌Milli-Q水 (A) 和含0.1% TFA的乙腈 (B)，系統(tǒng)流速為10 mL/min。梯度洗脫程序?yàn)??5 min，5% B；5?30 min，5%?50% B；30?35 min，50%?80% B。紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為225 nm。收集HPLC洗脫峰對(duì)應(yīng)的采樣管，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)之后用0.03 mol/L NaCl溶液 (pH 7.0) 補(bǔ)充至采樣管中的原體積，并測(cè)定其抗菌活性 (用進(jìn)行)。

1.2.6 液質(zhì)聯(lián)用 (liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS) 鑒定

對(duì)反相制備色譜得到的具有抗菌活性的洗脫峰進(jìn)行LC-MS的分析[14]。LC條件為色譜柱Phonomenex luna C18 (4.6 mm×250 mm)，乙腈(3)∶水(97)∶甲酸(0.1) 作為流動(dòng)相A；乙腈(70)∶水(30)∶甲酸(0.1) 作為流動(dòng)相B。洗脫程序?yàn)椋?–10 min，100% A，0% B；20 min，70% A，30% B；30 min，0% A，100% B；35 min 100% A，0% B；流速，1 mL/min；柱溫，30 ℃。質(zhì)譜分析條件為：毛細(xì)管電壓，3.88 kV；圓錐體電壓，20 V；離子源溫度，120 ℃；去溶溫度，300 ℃；流速，1 mL/min；分流比，50∶1。用MassLynx軟件(version 4.1) 對(duì)質(zhì)譜結(jié)果進(jìn)行分析。將軟件分析得到的氨基酸序列按照可能性從高到低排序；同時(shí)根據(jù)胰蛋白酶的作用位點(diǎn)[15]列出其水解SSL后可能產(chǎn)生的肽段序列。兩組序列一一比對(duì)，最終確定抗菌肽的氨基酸序列。

1.2.7 生物信息學(xué)分析與Swiss-modelling建模

經(jīng)LC-MS鑒定后的抗菌肽，提交至抗菌肽數(shù)據(jù)庫(kù) (http://aps.unmc.edu/AP/main.html) 進(jìn)行比對(duì)分析，根據(jù)同源或類(lèi)似序列的分析推測(cè)該抗菌肽的生物學(xué)特性?？咕牡娜S結(jié)構(gòu)模擬是借助Swiss-Model (http://swissmodel.expasy.org)在線模擬分析軟件進(jìn)行，選擇蛋清溶菌酶作為模板。由于抗菌肽的序列較短，因此選擇了包含抗菌肽序列及其上下游共30個(gè)氨基酸殘基進(jìn)行模擬。

1.2.8 抗菌肽作用后細(xì)胞形態(tài)的掃描

將LC-MS鑒定得到的抗菌肽進(jìn)行化學(xué)合成，并作用于靶細(xì)胞。將抗菌肽處理(0.2 mg/107細(xì)胞，37 ℃處理20 min，0.1 mol/L、pH 7.2的PBS緩沖液作對(duì)照) 過(guò)后的微生物 (ATCC 25922進(jìn)行，下同) 離心 (5 000×，5 min) 收集并洗滌，按參考文獻(xiàn)[16]的方法用玻璃板固定，然后用原子力顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.2.9 抗菌肽作用后細(xì)胞熒光強(qiáng)度的檢測(cè)

將抗菌肽 (終濃度1 mg/L) 與靶細(xì)胞大腸桿菌(約108CFU/mL) 混合后，于37 ℃條件下培養(yǎng)30 min，10 000 ×離心10 min，用0.22 μm濾膜過(guò)濾后的0.1 mol/L PBS緩沖液 (pH 7.2) 重懸至原體積，用超聲儀對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分散。參照Budde[17]的方法進(jìn)行染色，每毫升的細(xì)胞懸浮液中加入10 mL的染色液 (10 mmol/L cFDA染料溶于丙酮中)，37 ℃溫浴30 min，置于避光的冰上保存至流式細(xì)胞儀分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSL的蛋白酶水解物的抗菌活性

圖1中顯示了不同的蛋白酶作用于SSL后的水解液的抗菌活性，其中胃蛋白酶的水解液對(duì)革蘭氏陰性菌大腸桿菌ATCC 25922基本沒(méi)有殺菌效果，主要是因?yàn)镾SL對(duì)胃蛋白酶的降解作用具有抗性[18](SDS-PAGE結(jié)果未顯示)，而自然狀態(tài)下的SSL對(duì)大腸桿菌并沒(méi)有明顯的殺菌作用。梭菌蛋白酶的水解產(chǎn)物具有一定的抗革蘭氏陰性菌能力，但是效果有限 (抗菌系數(shù)為0.25，即殺菌率約為56%)；而胰蛋白酶對(duì)SSL的水解物具有最強(qiáng)的抗革蘭氏陰性菌活性，其抗菌系數(shù)可達(dá)2.81 (可殺死99%以上的靶細(xì)胞)；胃蛋白酶結(jié)合胰蛋白酶對(duì)SSL的水解產(chǎn)物殺菌效果 (抗菌系數(shù)為1.02，殺菌率90%)要弱于單獨(dú)使用胰蛋白酶的水解液。一方面胃蛋白酶的存在可能會(huì)作為底物競(jìng)爭(zhēng)性影響胰蛋白酶對(duì)SSL的降解活性；另一方面，胃蛋白酶會(huì)使SSL水解產(chǎn)物中抗菌活性成分的純度有所降低，進(jìn)而可能影響其殺菌效果。在后續(xù)的試驗(yàn)中，采用胰蛋白酶單獨(dú)對(duì)SSL進(jìn)行水解。然后對(duì)其水解產(chǎn)物中的具體抗菌物質(zhì)進(jìn)行分離純化和鑒定。

圖1 不同蛋白酶對(duì)SSL水解產(chǎn)物的抗菌活性

2.2 SSL水解物中抗菌肽的分離純化

2.2.1 凝膠過(guò)濾色譜分離

用凝膠過(guò)濾色譜Superdex peptide 10/300GL對(duì)SSL的胰蛋白酶水解液進(jìn)行分離純化，洗脫峰如圖2所示。水解液經(jīng)過(guò)凝膠過(guò)濾分離，得到了6個(gè)明顯的洗脫峰 (編號(hào)Ⅰ–Ⅵ)。分別對(duì)其進(jìn)行抗菌活性分析，其結(jié)果如圖中的虛線部分所示。結(jié)果表明，對(duì)測(cè)試菌大腸桿菌具有抗菌活性的水解片段集中在分子量較小的區(qū)間，其中洗脫峰Ⅴ和Ⅵ的抗菌活性較高；而洗脫峰Ⅴ的抗菌系數(shù)可達(dá)0.85，約是洗脫峰Ⅵ抗菌活性的2倍。因此，在后續(xù)的試驗(yàn)中，選擇洗脫峰Ⅴ的收集管作為研究對(duì)象，進(jìn)行下一步的反相制備色譜的分離純化。

2.2.2 反相制備色譜的分離純化

用反相制備色譜HPLC對(duì)上一步凝膠過(guò)濾色譜中的洗脫峰Ⅴ進(jìn)行分離純化，結(jié)果如圖3所示。結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)反相制備色譜的分離，可得到7個(gè)明顯的洗脫峰 (編號(hào)Ⅰ–Ⅶ)，對(duì)其洗脫峰收集液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后冷凍干燥。用同體積的PBS溶液(0.02 mol/L，pH 7.0) 溶解，并進(jìn)行抗菌活性分析，其結(jié)果如圖中的虛線部分所示。結(jié)果表明，洗脫峰Ⅱ和Ⅲ的抗菌活性較高，其抗菌系數(shù)分別為0.48和1.25。在后續(xù)的試驗(yàn)中，選擇抗菌效果較高的洗脫峰Ⅲ的收集管作為研究對(duì)象，進(jìn)行LC-MS鑒定。

圖2 胰蛋白酶對(duì)SSL水解產(chǎn)物的凝膠過(guò)濾分離

圖3 抗菌物質(zhì)的反相制備色譜分離

2.3 抗菌物質(zhì)的鑒定及其生物信息學(xué)分析

2.3.1 抗菌物質(zhì)的LC-MS鑒定

對(duì)2.2.2中反相制備色譜得到的洗脫峰Ⅲ的收集液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和冷凍干燥，用無(wú)菌水溶解后進(jìn)行LC-MS分析。其LC圖譜如圖4A所示，而其質(zhì)譜鑒定的結(jié)果如圖4B所示，這與文獻(xiàn)[14]的部分結(jié)果一致。經(jīng)軟件MassLynx (version 4.1) 分析，結(jié)合SSL的一級(jí)結(jié)構(gòu)以及胰蛋白酶的酶切位點(diǎn)，得到了該抗菌肽的氨基酸序列A-W-V-A-W-K，命名為SP。此抗菌肽的氨基酸序列分別對(duì)應(yīng)于SSL一級(jí)結(jié)構(gòu)中的第108–113位的氨基酸殘基，其分子量為(759.91±0.5) Da。

2.3.2 抗菌肽的生物信息學(xué)分析

將抗菌肽SP的氨基酸序列導(dǎo)入抗菌肽數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)其分子的疏水性比率為83% (疏水性對(duì)抗菌肽的抗菌活性有著重要作用)，同時(shí)其Boman系數(shù) (此性質(zhì)表征抗菌肽與蛋白結(jié)合的能力) 為–1.12 kcal/mol。此外，該抗菌肽屬于堿性肽，其等電點(diǎn)pI為9.70。序列比對(duì)結(jié)果顯示，抗菌肽SP與來(lái)源于的抗菌肽PGLa-H (AP01814)[19]有著40%的相似性，后者既能夠殺滅革蘭氏陽(yáng)性菌，也能夠抗革蘭氏陰性菌。為了驗(yàn)證SP的抗菌功能與活性，化學(xué)合成了此抗菌肽進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖4 抗菌肽的LC-MS鑒定

2.4 抗菌肽SP的抗菌活性驗(yàn)證

表1中列出了純化得到的抗菌肽SP以及合成的SP對(duì)多種革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性測(cè)試菌的抗菌活性及其MIC。本實(shí)驗(yàn)中純化得到的抗菌肽與化學(xué)合成的SP抗菌活性類(lèi)似，基本可以確認(rèn)為同一物質(zhì)。SSL的抗菌能力主要是針對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌；而抗菌肽SP不僅具有抗革蘭氏陰性菌的能力，同時(shí)也部分保留了SSL的抗革蘭氏陽(yáng)性菌的效果。SP的抗菌效果與其同源性最高的PGLa-H (AP01814)[19]的抗菌效果較一致，推測(cè)此類(lèi)抗菌肽的框架 (++A+VA+K++) 可能是一種對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌都有殺菌效果的功能結(jié)構(gòu)域。SSL與抗菌肽SP的抗菌效果的差異主要是由它們的作用機(jī)理決定的。SSL的殺菌機(jī)理是由其分子中E35的參與下與細(xì)胞壁中肽聚糖的糖苷鍵形成碳正離子中間體，然后在D53的參與下對(duì)該中間體進(jìn)行分離，進(jìn)而完成對(duì)肽聚糖的水解[20]?？咕腟P屬于陽(yáng)離子肽，而陽(yáng)離子肽按其二級(jí)結(jié)構(gòu)可分為α螺旋、拓展結(jié)構(gòu)、Loop結(jié)構(gòu)以及β折疊4大類(lèi)[21]。為進(jìn)一步了解SP的性質(zhì)，有必要對(duì)其作用方式進(jìn)行研究。

表1 抗菌肽SP的抗菌譜檢測(cè)

aThe peptide or SSL concentrations were 2.5×10–7mol per assay. The assays were performed in triplicate, and-tests were used to compare the differences of peptide to natural SSL;bGram-positive bacteria (+) and gram-negative bacteria (–); *<0.05; **<0.01.

2.5 抗菌肽SP的作用機(jī)理

2.5.1 抗菌肽SP在SSL中的結(jié)構(gòu)模擬

SP及其在SSL中兩端部分序列 (共30個(gè)氨基酸殘基，對(duì)應(yīng)于SSL一級(jí)結(jié)構(gòu)的86?115位的氨基酸殘基的肽段的3D結(jié)構(gòu)模擬如圖5所示。從模擬圖可以看出，該抗菌肽處在一超二級(jí)結(jié)構(gòu)模體Helix-Loop-Helix (HLH) 中的一段螺旋之中 (SP的位置在Helix 2中)。而結(jié)構(gòu)HLH存在于多種抗菌肽中[22-23]，被證明是與抗菌肽對(duì)靶細(xì)胞膜的滲透性破壞有關(guān)，其作用方式可以是形成孔洞或者地毯式模型[24]等。因此，我們推測(cè)，此種抗菌肽的作用機(jī)理也是通過(guò)破壞靶細(xì)胞膜的滲透性，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

圖5 抗菌肽在SSL中的結(jié)構(gòu)模擬

2.5.2 抗菌肽SP對(duì)靶細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)的影響

為了進(jìn)一步驗(yàn)證抗菌肽SP的作用方式，采用原子力顯微鏡掃描的手段對(duì)其作用后的細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，其結(jié)果如圖6所示。從圖中可以明顯看出，經(jīng)過(guò)抗菌肽SP作用后的靶細(xì)胞的細(xì)胞完整性遭到了破壞，細(xì)胞大小沒(méi)有明顯變化，但是部分細(xì)胞膜已經(jīng)破落，細(xì)胞內(nèi)溶物也有流出。經(jīng)初步判斷，靶細(xì)胞遭到抗菌肽SP作用后，其細(xì)胞膜的完整性被破壞，細(xì)胞膜的滲透性也有所改變，其作用方式與具備HLH結(jié)構(gòu)的抗菌肽類(lèi)似。SP可通過(guò)破壞靶細(xì)胞的細(xì)胞膜滲透性 (或結(jié)構(gòu)完整性) 進(jìn)而殺死革蘭氏陰性菌，但是在天然的SSL中它們并沒(méi)有發(fā)揮出這種功能。這可能是因?yàn)樗鼈兌急籗SL的表面結(jié)構(gòu)所包裹，并沒(méi)有足夠的機(jī)會(huì)去接觸靶細(xì)胞的細(xì)胞膜。因此，除了通過(guò)改變SSL的表面結(jié)構(gòu)，使其疏水性提高，SSL的作用位點(diǎn)更能夠接觸其作用底物-肽聚糖層之外；我們提出，利用相應(yīng)的技術(shù)手段，將抗菌肽SP暴露在其結(jié)構(gòu)表面，從而直接利用抗菌肽的殺菌作用進(jìn)行殺菌，是SSL增效研究的另一新的途徑。

圖6 抗菌肽SP作用后的大腸桿菌原子力顯微鏡掃描圖

2.5.3 抗菌肽SP對(duì)靶細(xì)胞細(xì)胞膜滲透性的影響

圖7表示了抗菌肽SP處理過(guò)后的靶細(xì)胞細(xì)胞表面的熒光強(qiáng)度 (FI) 的變化，F(xiàn)I降低主要是由于細(xì)胞外膜的破裂而導(dǎo)致熒光染料外流所致，可用于表征膜電勢(shì)的變化情況[25]。結(jié)果顯示，抗菌肽SP作用后的細(xì)胞膜表面的平均熒光強(qiáng)度由253減少到了125，降低幅度達(dá)50.6%。說(shuō)明被SP處理過(guò)后的細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)受到了破壞，導(dǎo)致其通透性得到提高，細(xì)胞內(nèi)溶物流出而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。Budde等[17]在利用細(xì)菌素Bacteriocin作用于NCFB 2714細(xì)胞時(shí)，得到了類(lèi)似的結(jié)果，其平均熒光強(qiáng)度由1.55降至0.40，降低幅度可達(dá)74%。

圖7 抗菌肽處理對(duì)大腸桿菌細(xì)胞膜熒光強(qiáng)度的影響

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)SSL進(jìn)行蛋白酶水解以及抗菌活性分析，發(fā)現(xiàn)SSL對(duì)胃蛋白酶的水解具有抗性，同時(shí)胰蛋白酶的水解物具有最強(qiáng)的抗革蘭氏陰性菌活性，本實(shí)驗(yàn)條件下的抗菌系數(shù)為2.81，可殺滅99%以上的測(cè)試菌。通過(guò)凝膠過(guò)濾色譜和反相分離色譜的分離純化，結(jié)合LC-MS的分離與鑒定，得到了一種對(duì)革蘭氏陰性菌具有抗菌活性的小肽，其氨基酸序列為A-W-V-A-W-K (SP)。

經(jīng)化學(xué)合成以后進(jìn)行抗菌譜的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)SP既可以殺滅革蘭氏陰性菌，也部分保留了SSL的抗革蘭氏陽(yáng)性菌的能力。通過(guò)Swiss-modeling結(jié)構(gòu)模擬、原子力顯微鏡檢測(cè)以及細(xì)胞膜滲透性實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)SP具有α螺旋結(jié)構(gòu)，在SSL中位于N端的一段HLH的超二級(jí)結(jié)構(gòu)模體中。

抗菌肽SP的發(fā)現(xiàn)，表明SSL中存在對(duì)革蘭氏陰性菌有殺菌作用的片段或結(jié)構(gòu)，但是由于其分子表面的空間位阻等作用，導(dǎo)致這些結(jié)構(gòu)的功能沒(méi)有在自然狀態(tài)下得以展現(xiàn)。后續(xù)研究中，可以通過(guò)改善SP等結(jié)構(gòu)周?chē)沫h(huán)境或者通過(guò)基因融合的手段提高SP在SSL中的比重等方法強(qiáng)化SP的殺菌作用，對(duì)提高SSL的抗菌譜具有理論指導(dǎo)價(jià)值。

[1] Zhu D, Cai G, Wu D, et al. Comparison of two codon optimization strategies enhancing recombinantlysozyme production in. Cell Mol Biol, 2015, 61(2): 43–49.

[2] Yu M, Irwin DM. Evolution of stomach lysozyme: the pig lysozyme gene. Mol Phylogenet Evol, 1996, 5(2): 298–308.

[3] Palmieri C, Brunetti M, Salda LD. Immunohistochemical characterization of Kisselev nodules (ectopic lymphoid follicles) in wild boar (L.). Res Vet Sci, 2007, 83(1): 109–115.

[4] Zhu DW, Cai GL, Lu J. The expression oflysozyme in.and its refolding. Food Ferment Ind, 2016, 42(10): 23–28 (in Chinese). 朱德偉, 蔡國(guó)林, 陸健. 豬溶菌酶在大腸桿菌中的表達(dá)及其復(fù)性. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2016, 42(10): 23–28.

[5] Derde M, Guérin-Dubiard C, Lechevalier V, et al. Dry-heating of lysozyme increases its activity againstmembranes. J Agric Food Chem, 2014, 62(7): 1692–1700.

[6] Cong L, Yang X, Wang X, et al. Characterization of an i-type lysozyme gene from the sea cucumber, and enzymatic and nonenzymatic antimicrobial activities of its recombinant protein. J Biosci Bioeng, 2009, 107(6): 583–588.

[7] Liu ST, Sugimoto T, Azakami H, et al. Lipophilization of lysozyme by short and middle chain fatty acids. J Agric Food Chem, 2000, 48(2): 265–269.

[8] Ibrahim HR, Taniyama N, Aoki T. Distinct dimerization between α-lactalbumin and lysozyme exhibiting novel antimicrobial activity against gram-positive and gram-negative bacteria. Lett Drug Des Discov, 2004, 1(2): 101–109.

[9] Pellegrini A, Thomas U, Bramaz N, et al. Identification and isolation of a bactericidal domain in chicken egg white lysozyme. J Appl Microbiol, 1997, 82(3): 372–378.

[10] Mine Y, Ma FP, Lauriau S. Antimicrobial peptides released by enzymatic hydrolysis of hen egg white lysozyme. J Agric Food Chem, 2004, 52(5): 1088–1094.

[11] Lu XM, Jin XB, Zhu JY, et al. Expression of the antimicrobial peptide cecropin fused with human lysozyme in. Appl Microbiol Biotechnol, 2010, 87(6): 2169–2176.

[12] Zhao H, Tang J, Cao L, et al. Characterization of bioactive recombinant antimicrobial peptide parasin I fused with human lysozyme expressed in the yeastsystem. Enzyme Microb Technol, 2015, 77(3): 61-67.

[13] Wang AP, Su YP, Wang S, et al. Antibacterial activity and mechanism of recombinant human α-defensin 5 against clinical antibiotic-resistant strains. Afr J Microbiol Res, 2010, 4(8): 626–633.

[14] Zhu D, Cai G, Li X, et al. Enhancing the antimicrobial activity oflysozyme by N-terminal fusion of a sextuple unique homologous peptide. J Biotechnol, 2017, 243: 61–68.

[15] Rawling ND, Barrett AJ. Families of serine peptidases. Methods Enzymol, 1994, 244: 19–61.

[16] Soon RL, Nation RL, Harper M, et al. Effect of colistin exposure and growth phase on the surface properties of livecells examined by atomic force microscopy. Int J Antimicrob Agents, 2011, 38(6): 493–501.

[17] Budde BB, Rasch M. A comparative study on the use of flow cytometry and colony forming units for assessment of the antibacterial effect of bacteriocins. Int J Food Microbiol, 2000, 63(1/2): 65–72.

[18] Nonaka Y, Akieda D, Aizawa T, et al. X-ray crystallography and structural stability of digestive lysozyme from cow stomach. FEBS J, 2009, 276(8): 2192–2200.

[19] Hou F, Li J, Pan P, et al. Isolation and characterisation of a new antimicrobial peptide from the skin of. Int J Antimicrob Agents, 2011, 38(6): 510–515.

[20] Vocadlo DJ, Davies GJ, Laine R, et al. Catalysis by hen egg-white lysozyme proceeds via a covalent intermediate. Nature, 2001, 412(6849): 835–838.

[21] Wu M, Maier E, Benz R, et al. Mechanism of interaction of different classes of cationic antimicrobial peptides with planar bilayers and with the cytoplasmic membrane of. Biochemistry, 1999, 38(22): 7235–7242.

[22] Engelman DM, Steitz TA. The spontaneous insertion of proteins into and across membranes: the helical hairpin hypothesis. Cell, 1981, 23(2): 411–422.

[23] Ibrahim HR, Thomas U, Pellegrini A. A helix-loop-helix peptide at the upper lip of the active site cleft of lysozyme confers potent antimicrobial activity with membrane permeabilization action. J Biol Chem, 2001, 276(47): 43767–43774.

[24] Str?mstedt AA, Ringstad L, Schmidtchen A, et al. Interaction between amphiphilic peptides and phospholipid membranes. Curr Opin Colloid Interface Sci, 2010, 15(6): 467–478.

[25] Chikindas ML, Garcia-Garcerá MJ, Driessen AJ, et al. Pediocin PA-1, a bacteriocin fromPAC1.0, forms hydrophilic pores in the cytoplasmic membrane of target cells. Appl Environ Microbiol, 1993, 59(11): 3577–3584.

(本文責(zé)編 陳宏宇)

Purification, identification and characterization of an anti-microbial hexapeptide fromlysozyme

Dewei Zhu1,2,3, Guolin Cai1,2,3, and Jian Lu1,2,3

1 The Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China 2 National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China 3 School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China

lysozyme (SSL) was digested by different proteases to find peptides with enhanced antibacterial activity against gram-negative bacteria. Hydrolysate with the highest anti-bacterial activity was loaded onto a gel filtration chromatography column followed by a reversed-phase one. The obtained substance was identified by liquid chromatography-mass spectrometry, synthesized to test its antibacterial spectrum and analyzed for bioinformatics. The hydrolysate of trypsin showed the highest antibacterial activity. By purification and identification, the functional peptide with sequence of A-W-V-A-W-K was obtained. The peptide was synthesized and proved to retain partial function of SSL and had activity against gram-negative bacteria. By bioinformatics analysis, the peptide was found to locate in a helix-loop-helix structure, suggesting that the peptide may kill cells by penetrating cell membrane and cause the outflow of cell contents. The discovery of the peptide could lay the foundation for improving the antibacterial activity of SSL.

lysozyme,, antibacterial peptide, antibiotics, membrane penetrating

10.13345/j.cjb.160475

December 12, 2016; Accepted:February 21, 2017

Jian Lu. Tel/Fax: +86-510-85918191; E-mail: jlu@jiangnan.edu.cn

Supported by:National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2013CB733602), Fundamental Research Funds for the Central Universities (No. JUSRP51302A), the Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions.

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃 (973計(jì)劃) (No. 2013CB733602)，中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)資金資助 (No. JUSRP51302A)，江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程項(xiàng)目資助。

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2017-03-31

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20170331.1001.001.html