陳永春，王天軼

骨髓移植術(shù)后巨細胞病毒肺炎患者體內(nèi)CD11b的表達及臨床意義

陳永春a，王天軼b

目的 探討骨髓移植術(shù)后巨細胞病毒(Human cytomegalovirus,CMV)肺炎患者體內(nèi)中性粒細胞表面黏附分子CD11b的表達及診斷價值。方法 收集我院2000年11月至2016年10月收治的骨髓移植術(shù)后患者60例，依據(jù)CMV-pp65抗原檢測結(jié)果分組，同時選擇我院門診體檢健康者33例為對照組。采用流式細胞儀分別檢測上述各組的CD11b表達情況，并計算CD11b在診斷骨髓移植術(shù)后CMV肺炎過程中的受試者工作曲線(ROC曲線)。結(jié)果 本研究高活動性CMV感染組17例(28.33%)，CMV活動性感染組29例(48.33%)，陰性對照組(未感染CMV)14例(23.34%)。高活動性CMV感染組CD11b表達率為39.11%±4.98%，與CMV活動性感染組、陰性對照組和健康對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。CD11b在診斷骨髓移植術(shù)后高活動性CMV感染的最佳臨界值表達率為43.47%，敏感度為100%，特異度為59.47%，ROC曲線下面積為0.631；CD11b診斷骨髓移植術(shù)后CMV肺炎活動性感染者的最佳臨界值表達率為69.34%，敏感度為86.92%，特異度為98.81%，ROC曲線下面積為0.987。結(jié)論 骨髓移植術(shù)后CMV肺炎患者體內(nèi)CD11b表達下調(diào)，可作為鑒別診斷骨髓移植術(shù)后CMV肺炎活動性感染的實驗室依據(jù)。

CMV；CD11b；流式細胞術(shù)；骨髓移植

0 引言

巨細胞病毒(Cytomegalovirus，CMV)系在人群中具有普遍易感性的皰疹病毒科雙螺旋DNA病毒，60%～90%的健康人曾感染過CMV[1-3]。CMV雖然是一種弱致病因子，但是一旦感染，終身攜帶。由于健康人免疫系統(tǒng)的監(jiān)視作用，能夠有效防止CMV活動性感染的發(fā)生[1]。潛伏的病毒在機體免疫功能低下時再次被激活，發(fā)生CMV活動性感染。CMV感染可累及泌尿生殖系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肝臟、肺、血液、循環(huán)系統(tǒng)等，其中以巨細胞病毒性肺炎最為常見[4-5]。我國屬CMV病毒感染的高發(fā)區(qū)域，有研究對健康人群檢測CMV IgG抗體，顯示CMV的陽性感染率高達70%～100%[6-7]。骨髓移植術(shù)后的患者由于長期服用免疫抑制劑，可以導致體內(nèi)的CMV發(fā)生活動性感染并引起CMV肺炎，盡早明確診斷一直是臨床關(guān)注的問題。

目前，骨髓移植術(shù)后患者CMV肺炎的診斷主要依靠實驗室檢測，以pp65抗原檢測為主，特異性較好，如檢出陽性細胞即可確認CMV活動性感染，由于pp65抗原在出現(xiàn)臨床癥狀后才能檢出，因此，尋找有效的早期的CMV感染標志物成為臨床上亟待解決的問題。CD11b是整合素家族中的一員，在單核巨噬細胞和NK細胞表面均表達，而在成熟的中性粒細胞表面，CD11b僅有低水平表達，當機體發(fā)生細菌和病毒感染時，中性粒細胞表面CD11b表達會隨著感染的時間不同而發(fā)生相應的改變。本研究旨在探討骨髓移植術(shù)后CMV肺炎患者體內(nèi)中性粒細胞表面黏附分子CD11b的表達情況，為臨床早期診斷提供實驗室檢查依據(jù)，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇我院2000年11月至2016年10月收治的骨髓移植術(shù)后患者60例，其中男44例，女16例；年齡32～61(43.3±4.2)歲。本研究納入的60例均為白血病術(shù)后患者，發(fā)病原因不明。同時選取我院門診體檢健康同齡人33例為健康對照組，其中男21例，女12例；平均年齡(48.1±6.3)歲。本研究經(jīng)我院倫理學委員會批準，納入研究病例及人群均簽署知情同意書。

1.2 診斷標準

1.2.1 CMV肺炎的診斷 參照1998年由中華醫(yī)學會感染學分會制定的《CMV感染診斷方案》[8]：①發(fā)熱且體溫在38 ℃以上，持續(xù)超過3 d；②出現(xiàn)咳嗽、咳少量痰、呼吸困難等呼吸系統(tǒng)感染癥狀，嚴重時可出現(xiàn)低氧血癥并進行性加重；③X線胸片或CT掃描有磨玻璃影、結(jié)節(jié)影、斑片狀實變影等改變；④CMV實驗室檢查結(jié)果出現(xiàn)以下表現(xiàn)：酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血清中CMV-IgM陽性和(或)熒光定量聚合酶鏈反應法(FQPCR)檢測血中CMV-DNA含量≥1×104copy/mL和(或)CMV-pp65抗原陽性；⑤發(fā)熱早期細菌、真菌、支原體、衣原體、卡氏肺囊蟲及結(jié)核菌等檢查均為陰性。

1.2.2 CMV活動性感染診斷標準 患者外周血中CMV-pp65抗原陽性細胞數(shù)>100個/5×104白細胞診斷為高活動性CMV感染，CMV-pp65抗原檢驗陽性細胞數(shù)<100個/5×104白細胞診斷為CMV活動性感染。

1.3 試劑及檢測方法

1.3.1 CMV-pp65抗原檢測 采用ELISA法定性檢測，采用CMV BriteTMTurbo Kit試劑盒(荷蘭IQ公司)。晨起空腹采集靜脈血5 mL，將采集的血液用肝素抗凝并采用密度梯度離心法分離白細胞，調(diào)整白細胞的密度為2×106/mL，將調(diào)整好的白細胞液滴入載玻片內(nèi)并使用試劑盒中的固定液和打孔劑分別處理白細胞，將CMV-pp65的一抗在濕盒中孵育6 h，取出后在480 nm熒光激發(fā)條件下觀察，發(fā)出熒光的細胞為陽性細胞。

1.3.2 CD11b流式細胞術(shù)檢測 CD11b購于美國BD公司，使用破膜固定液將白細胞分離，使用CD11b流式抗體5 μL，加入5×106/mL體積白細胞，用PBS液稀釋至200 μL，避光保存20 min后，采用流式細胞儀檢測。

1.4 統(tǒng)計學分析 數(shù)據(jù)分析使用Graphpad Prism 5軟件進行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布方差齊的計量資料組間比較采用卡方檢驗，用率(%)表示，以α=0.05為檢驗水準。

2 結(jié)果

2.1 CMV-pp65抗原檢測結(jié)果 根據(jù)CMV-pp65抗原檢測結(jié)果，本研究CMV肺炎中高活動性CMV感染組17例(28.33%)，CMV活動性感染組29例(48.33%)，陰性對照組14例(23.34%)。

2.2 CMV肺炎感染組間CD11b表達 CMV肺炎高活動性感染組、CMV活動性感染組、陰性對照組和健康對照組骨髓移植術(shù)后中性粒細胞CD11b表達率分別為39.11%±4.98%、49.12%±3.34%、59.11%±4.23%、61.22%±5.32%，CMV肺炎高活動性感染組與其他三組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖1)。CD11b在CMV高活動性感染組中的最佳臨界值表達率為43.47%，敏感度為100%，特異度為59.47%，受試者工作曲線(ROC曲線)下面積為0.631；CD11b診斷CMV活動性感染組的最佳臨界值表達率為69.34%，敏感度為86.92%，特異度為98.81%，ROC曲線下面積為0.987(圖2)。

3 討論

圖1 骨髓移植術(shù)后巨細胞病毒肺炎各組中性粒細胞CD11b的表達

注：與健康對照組比較，**P<0.01；與非CMV感染陰性對照組比較，##P<0.01

圖2 骨髓移植術(shù)后CMV高活動性感染和CMV活動性感染的ROC曲線

研究表明，可以導致CMV活動性感染的主要因素包括生理因素和病理因素：生理因素導致CMV活動性感染者多見于嬰幼兒，由于嬰幼兒的免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善，容易導致條件致病菌及病毒發(fā)生活動性感染；病理因素則多見于長期服用免疫抑制劑的人群，如腎移植、骨髓移植術(shù)后、長期大量服用糖皮質(zhì)激素和免疫功能缺陷的患者(如獲得性免疫缺陷綜合征)等[9-12]。如不能及時診斷CMV肺炎，病情發(fā)展迅速，病情兇險，嚴重者可能危及患者的生命。有研究表明，骨髓移植術(shù)后患者因發(fā)生CMV肺炎而導致死亡的比例高達85%[13]，因此，臨床早期發(fā)現(xiàn)并明確診斷CMV感染尤為重要。

骨髓移植術(shù)后患者免疫力低下，且長期使用免疫抑制劑，易誘發(fā)丙型肝炎病毒、柯薩奇B病毒、風疹病毒、流行性腮腺炎病毒、輪狀病毒和CMV等病毒感染[12]。而CMV肺炎是骨髓移植術(shù)后最常見的并發(fā)癥之一，且CMV具有潛伏-活化的生物學特征。由于CMV病毒在正常人體內(nèi)IgG抗體的陽性檢出率高達90%，因此，多數(shù)骨髓移植術(shù)受者均是CMV的隱性感染者，當機體的免疫功能受到長期服用免疫抑制劑的影響，CMV極易發(fā)生活動性感染并累及肺部，并發(fā)CMV肺炎[9]。CMV肺炎的病理改變主要集中在細支氣管，可以出現(xiàn)細支氣管周圍炎，臨床表現(xiàn)與間質(zhì)性肺炎相似，主要表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽并伴有肺哮鳴音，嚴重者可以出現(xiàn)呼吸困難。

CMV感染早期缺乏特異性的檢測指標且發(fā)病隱匿，極易導致誤診，甚至造成病情延誤[14-15]。另外，CMV具有泛嗜性，尤其是免疫功能低下的患者，CMV感染可以引起多個器官的病變，且臨床表現(xiàn)往往不典型，臨床鑒別診斷CMV感染十分困難。如果長時間不能得到有效的救治，可以導致骨髓移植失敗甚至死亡。因此，臨床應對骨髓移植術(shù)后CMV肺炎高度重視，及時完善相關(guān)檢查，做好鑒別診斷并采用適當治療方案，實現(xiàn)搶先治療，以改善骨髓移植受者的病情，提高生存質(zhì)量。

白細胞黏附分子是介導細胞間相互接觸和結(jié)合分子的統(tǒng)稱，是存在于細胞表面及細胞基質(zhì)中的糖蛋白，通過受體與配體的結(jié)合介導細胞間的信號傳導，當受體與配體結(jié)合后，細胞間、細胞與周圍的基質(zhì)間和細胞-基質(zhì)-細胞間相互黏附，參與細胞信號的轉(zhuǎn)導與活化過程。中性粒細胞表面有多種細胞黏附分子，包括整合素家族、選擇素家族、黏蛋白樣家族、免疫球蛋白超家族和鈣黏素家族[16]。整合素是由α(120～185 kD)和β(90～110 kD)兩個亞單位形成的異二聚體[17]，是一種能夠介導細胞與周圍環(huán)境間連接的跨膜受體，在細胞間的信號傳導過程中，整合素可以將細胞外基質(zhì)的信號等有關(guān)信息傳入細胞，同時也可以由細胞內(nèi)向細胞外傳遞信號。CD11b是整合素家族中β2亞族的一員，分子量約為160 kD，基因位點位于16號染色體短臂p11～p13.1，單核巨噬細胞和NK細胞表面均有表達，成熟的中性粒細胞表面CD11b處于非活化狀態(tài)，在體內(nèi)其他細胞中CD11b僅有低水平表達。CD11b的活化與多種因素有關(guān)，包括補體片段、一些趨化因子和細菌代謝的內(nèi)毒素和脂多糖等，當白細胞與上述小分子接觸后在數(shù)分鐘內(nèi)就可以高表達CD11b，因此，CD11b的上調(diào)是中性粒細胞被激活的標志。有研究顯示，在新生兒重癥肺炎的早期就有CD11b的高表達，且隨著病情好轉(zhuǎn)，CD11b表達逐漸降低[18]。提示CD11b在重癥肺炎早期就可發(fā)生變化。骨髓移植患者罹患CMV肺炎時，病毒的代謝產(chǎn)物可以引起機體內(nèi)腫瘤壞死因子α等炎癥趨化因子的高表達，在疾病早期上述因子則可誘發(fā)CD11b的變化[19]。但CD11b上調(diào)的過程在體內(nèi)存在時間較短，如感染未得到有效控制，CD11b上調(diào)的現(xiàn)象會隨著病情進展而下調(diào)，這可能與中性粒細胞轉(zhuǎn)變?yōu)槟摷毎ド飳W活性有關(guān)。

本研究顯示，CMV高活動性感染中性粒細胞表面CD11b表達高于CMV活動性感染者，明顯高于陰性對照和健康對照者，而ROC曲線下面積僅為0.631，診斷價值略差于CMV活動性感染，但敏感度高達100%，對于鑒別診斷CMV活動性感染具有重要價值。肖漓等[20]研究表明，在巨細胞病毒活動性感染的腎移植患者體內(nèi)，同樣出現(xiàn)CD11b、CD15和CD62L的相應變化，其中CD11b對于診斷腎移植術(shù)后巨細胞病毒活動性感染具有較好的特異性，并將CD11b表達比例下調(diào)作為診斷早期巨細胞病毒活動性感染的標志之一。結(jié)合本研究結(jié)果證實，CD11b在巨細胞病毒感染的早期就可以發(fā)生明顯變化，當CD11b陽性比例在43.47%時對于臨床早期診斷巨細胞病毒活動性感染具有較高價值。

綜上所述，骨髓移植術(shù)后并發(fā)活動性CMV肺炎患者外周血中性粒細胞表面CD11b表達下調(diào)這一現(xiàn)象，可以有效提高CMV感染的檢出率，對CMV活動感染的診斷有重要意義，在早期能夠得到有效的診治，實現(xiàn)“搶先治療”。

[1] Blanco-Lobo P,Cordero E,Martín-Gandul C,et al.Use of antibodies neutralizing epithelial cell infection to diagnose patients at risk for CMV Disease after transplantation[J].J Infect,2016,72(5):597-607.

[2] Clari MA,Aguilar G,Benet I,et al.Evaluation of cytomegalovirus (CMV)-specific T-cell immunity for the assessment of the risk of active CMV infection in non-immunosuppressed surgical and trauma intensive care unit patients[J].J Med Virol,2013,85(10):1802-1810.

[3] 董妞妞,徐錦.巨細胞病毒包膜糖蛋白B、H、N及其基因型的研究進展[J].檢驗醫(yī)學,2016,31(3):159-162.

[4] 汪生,劉丹波,鄭曉麗,等.不同方式的造血干細胞移植術(shù)后巨細胞病毒感染的臨床分析[J].中國實驗血液學雜志,2015,23(5):1438-1444.

[5] 張麗萍,白劍.器官移植后巨細胞病毒的院內(nèi)感染:檢測與監(jiān)測[J].中國組織工程研究,2015,19(20):3258-3263.

[6] 張書紅.人巨細胞病毒感染檢測方法的研究進展[J].醫(yī)學綜述,2009,15(22):3495-3497.

[7] 陳筱凡,張偉珍.巨細胞病毒感染檢測在骨髓和外周血干細胞移植中的意義[J].浙江醫(yī)學,2011,33(12):1819-1820.

[8] 貝政平.內(nèi)科疾病診斷標準[M].北京:科學出版社,2001:25-26.

[9] 李維薇,楊燕,賀麗麗,等.嬰兒巨細胞病毒肝炎的中醫(yī)藥研究進展[J].遼寧中醫(yī)雜志,2015,42(12):2458-2461.

[10]沈一燚,劉志峰.巨細胞病毒感染與脂質(zhì)代謝相關(guān)性研究進展[J].臨床兒科雜志,2015,33(5):494-497.

[11]汪生,劉丹波,鄭曉麗,等.不同方式的造血干細胞移植術(shù)后巨細胞病毒感染的臨床分析[J].中國實驗血液學雜志,2015,23(5):1438-1444.

[12]Azevedo LS,Pierrotti LC,Abdala E,et al.Cytomegalovirus infection in transplant recipients[J].Clinics (Sao Paulo),2015,70(7):515-523.

[13]朱培瑜,段連寧,閆洪敏,等.單倍體骨髓移植后巨細胞病毒感染的防治[J].臨床血液學雜志,2007,20(2):73-74,77.

[14]Waters A,Jennings K,Fitzpatrick E,et al.Incidence of congenital cytomegalovirus infection in Ireland:implications for screening and diagnosis[J].J Clin Virol,2014,59(3):156-160.

[15]Alam MM,Bayoumy M,Ali A,et al.Cytomegalovirus infection in children after bone marrow transplantation:Risk factors,clinical aspects and outcomes[J].Pediatric Infectious Disease,2016,8(1):1-7.

[16]Liu J,Kong J,Chang YJ,et al.Patients with refractory cytomegalovirus (CMV) infection following allogeneic haematopoietic stem cell transplantation are at high risk for CMV disease and non-relapse mortality[J].Clin Microbiol Infect,2015,21(12):1121.e9-e15.

[17]魏軍,王煒,唐歡,等.重度子癇前期患者外周血中性粒細胞表面黏附分子LFA-1水平變化的研究[J].中國醫(yī)科大學學報,2015,44(3):263-266.

[18]朱鵬.整合素與血管內(nèi)皮細胞結(jié)構(gòu)及功能的研究進展[J].福建醫(yī)藥雜志,2015,37(1):121-123.

[19]周喜友,劉文娟.輪狀病毒感染性膿毒癥患兒中性粒細胞CD11b、白細胞介素-6、hs-CRP水平變化及其臨床意義[J].中國實用醫(yī)藥,2012,7(29):128-129.

[20]肖漓,白劍,何秀云,等.巨細胞病毒感染的腎移植受者中性粒細胞表面黏附分子的表達及意義[J].中華醫(yī)學雜志,2016,96(20):1562-1565.

Expression and clinical significance of neutrophil surface adhesion molecules CD11b in patients with cytomegalovirus pneumonia after bone marrow transplantation

CHEN Yong-chuna,WANG Tian-yib

(a.Health Management Center,b.Department of Respiratory,Bethune International Peace Hospital,Shijiazhuang 050082,China)

Objective To investigate the expression and diagnostic value of neutrophil surface adhesion molecules CD11b in patients with cytomegalovirus (CMV) pneumonia after bone marrow transplantation.Methods Blood samples of 60 bone marrow transplantation patients in our hospital from November 2000 to October 2016 were collected and grouped according to the results of CMV-pp65 antigen detection.Meanwhile,33 healthy cases from the physical examination were taken as control group.Flow cytometry was used to detect the expression of CD11b,and the ROC curves of CD11b in all the subjects during CMV pneumonia after bone marrow transplantation were formulated.Results There were 17 cases (28.33%) in high-active CMV infection group,29 cases (48.33%) in CMV infection group and 14 cases (23.34%) in negative control group (non-infection of CMV).The expression ratio of CD11b in high-active CMV infection group was 39.11%±4.98%,which was lower than that of CMV infection group,negative control group and control group (P<0.05).The optimal cut-off value in high-active CMV infection group was 43.47%,the sensitivity was 100%,the specificity was 59.47%,and the area under the receiver-operating curve (ROC) was 0.631.The optimal cut-off value of CD11b in CMV infection group was 69.34%,the sensitivity was 86.92%,the specificity was 98.81%,and the area under of ROC of CD11b was 0.987.Conclusion The expression of CD11b in the patients with CMV pneumonia after bone marrow transplantation is down-regulated,which can be used as a laboratory basis for differential diagnosis of CMV pneumonia after bone marrow transplantation.

Cytomegalovirus；CD11b；Flow cytometry；Bone marrow transplantation

2016-12-12

白求恩國際和平醫(yī)院a.健康管理中心，b.呼吸科，石家莊 050082

河北省科技計劃項目(12277722)

10.14053/j.cnki.ppcr.201706008