朱嬌++馬蕾++劉芳++楊元軍++張冀華++泮海軍++董道峰

摘要：以蝴蝶蘭莖尖為外植體進行組織培養(yǎng)，研究培養(yǎng)基中無機鹽濃度、糖濃度、激素比例及外植體大小對其莖尖生長點成活率及脫毒效果的影響。結(jié)果表明，蝴蝶蘭莖尖組培脫毒外植體大小為0.2～0.4 mm，并附帶1個葉原基，可脫除ORSV病毒。適當(dāng)降低培養(yǎng)基中無機鹽與6-BA濃度有利于提高莖尖生長點的成活率。培養(yǎng)基中添加15 g/L的綿白糖有利于莖尖的成活及生長。1/3MS + 1.0 mg/L 6-BA + 0.2 mg/L NAA為最適宜的蝴蝶蘭莖尖培養(yǎng)基。

關(guān)鍵詞：蝴蝶蘭；脫毒；莖尖；再生

中圖分類號：S682.310.4+3文獻標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2017）06-0060-04

AbstractThe shoot tip of Phalaenopsis amabilis was cultured as explant to study the effects of inorganic salt concentration， sugar concentration， hormone proportion and explant size on survival rate and virus-free effect of shoot tip growing point. The results showed that when the explant had the size of 0.2 to 0.4 mm and attached 1 leaf primordium， the ORSV could be eradicated. When the inorganic salt and sugar concentration decreased properly， the survival rate of shoot tip growing point could improve. When 15 g/L soft sugar was added into culture medium， it was beneficial to survival and growth of shoot tip. The medium containing 1/3 MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.2 mg·L-1 NAA was suitable for shoot tip culture of Phalaenopsis amabilis.

KeywordsPhalaenopsis amabilis； Virus free； Tip shoot； Regeneration

蝴蝶蘭（Phalaenopsis amabilis）屬熱帶或亞熱帶的氣生蘭，因其株型美觀，花形奇特，色彩艷麗，花期長久，素有“蘭花皇后”之美稱，在國際花卉市場上具有很高的經(jīng)濟價值[1]。隨著蝴蝶蘭種苗組培快繁技術(shù)的發(fā)展以及國際貿(mào)易的日趨頻繁，蘭花病毒病成為阻礙蝴蝶蘭產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸[2]。由于病毒可通過蚜蟲、飛虱、機械性傷口等進行傳播，而蝴蝶蘭商品苗主要采用組織培養(yǎng)方式快繁，若感染病毒，很容易快速蔓延造成嚴(yán)重?fù)p失。目前蘭花病毒病害沒有有效的防治方法，為了從根源上避免病毒的擴散和危害，研究蝴蝶蘭的脫毒技術(shù)對培育無病毒種苗具有十分重要的現(xiàn)實意義。

莖尖培養(yǎng)不僅是組織培養(yǎng)的一種重要手段，也是脫毒的關(guān)鍵步驟之一。前人研究表明，病毒在植物體內(nèi)分布不均，一般頂端分生組織細(xì)胞的分裂速度較快，超過病毒的繁殖速度，因此病毒含量很低，甚至不含病毒[3]。莖尖的成活率和脫毒率是決定莖尖脫毒技術(shù)成功的兩個關(guān)鍵因子。褐化是導(dǎo)致莖尖培養(yǎng)成活率降低的主要原因。褐化程度受植物基因型、取材時間、莖尖長度、培養(yǎng)基類型、激素配比、培養(yǎng)基添加物及培養(yǎng)方式等因素的影響。莖尖越小，褐化越嚴(yán)重，越容易死亡，尤其對于蘭花類植物，褐化尤為嚴(yán)重，是影響莖尖成活率的關(guān)鍵問題之一[4，5]。目前已在馬鈴薯、草莓、甘蔗、百合、葡萄等植物中利用莖尖脫毒技術(shù)成功獲得了脫毒種苗[6-10]。有關(guān)蝴蝶蘭脫毒種苗的研究已有報道[11，12]，但研究重點在于比較各種脫毒方法，對于莖尖再生培養(yǎng)體系的建立未進行深入研究。景維杰等[13]對培養(yǎng)基的無機鹽濃度、鉀濃度比例、氮素形態(tài)、植物生長調(diào)節(jié)劑進行了試驗優(yōu)化，研究表明1/5大量元素的無機鹽濃度適合蝴蝶蘭莖尖生長點的培養(yǎng)，一定濃度范圍內(nèi)，提高氮源中硝態(tài)氮的比例，或提高培養(yǎng)基中鉀的濃度比例，均有助于蝴蝶蘭莖尖生長點的存活，但該研究并未對影響莖尖成活率的基本培養(yǎng)基及糖濃度等重要因素進行深入研究[13]。

本試驗系統(tǒng)研究了莖尖大小、基本培養(yǎng)基、激素配比、糖濃度等對蝴蝶蘭莖尖組織培養(yǎng)再生的影響，旨在建立高效的蝴蝶蘭莖尖脫毒再生體系，為蝴蝶蘭脫毒種苗的研究及生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

1材料與方法

1.1材料

以建蘭花葉病毒（Cymbidium mosaic virus，CymMV）和齒舌蘭環(huán)斑病毒（Odontoglossum ringspot virus，ORSV） 復(fù)合感染的蝴蝶蘭1031組培苗為試驗材料。CymMV和ORSV病毒檢測試劑盒購自安德珍生物技術(shù)有限公司（ADGEN Biotechnology Co.， Ltd.）。

1.2方法

蝴蝶蘭組培苗的無菌操作在超凈工作臺上進行。在 40倍冷光源解剖鏡下用解剖針和手術(shù)刀剝?nèi)ドL點外圍的幼葉，露出微凸、穹形、發(fā)亮的生長點。切下生長點快速放在培養(yǎng)基上表面?；九囵B(yǎng)基試驗、激素配比試驗及糖濃度試驗所用外植體均為0.2～0.4 mm帶1個葉原基的莖尖生長點。每瓶接種3個莖尖，每個處理8瓶，重復(fù)2次。接種后暗處理2周，然后進行光照培養(yǎng)，光照條件800 lx，光照時間為10 h/d，溫度22～28℃。培養(yǎng)40 d后，統(tǒng)計莖尖的成活率、褐化率及死亡率。試驗設(shè)計如下。

1.2.1基本培養(yǎng)基試驗基本培養(yǎng)基共設(shè)5個處理：M1，MS；M2，1/2MS；M3，1/3MS；M4，1/4MS；M5，1/5MS。其中，1/2MS、1/3MS、1/4MS、1/5MS是指將MS中的大量元素變?yōu)樵瓉淼?/2、1/3、1/4、1/5。每個處理培養(yǎng)基均添加3.0 mg/L 6-BA +0.5 mg/L NAA + 25 g/L綿白糖+ 1.0 g/L AC（活性炭）+15%CW（椰乳）。

1.2.2激素配比試驗激素配比共設(shè)5個處理：A1，8.0 mg/L 6-BA +1.0 mg/L NAA；A2，5.0 mg/L 6-BA +1.0 mg/L NAA；A3，3.0 mg/L 6-BA +0.5 mg/L NAA；A4，2.0 mg/L 6-BA +0.5 mg/L NAA；A5，1.0 mg/L 6-BA +0.2 mg/L NAA。每個處理培養(yǎng)基均添加1/2MS +25 g/L綿白糖+1.0 g/L AC +15%CW。

1.2.3糖濃度試驗綿白糖濃度共設(shè)5個處理：T1，10 g/L；T2，15 g/L；T3，20 g/L；T4，25 g/L；T5，30 g/L。其中每種培養(yǎng)基均添加1/2MS+ 3.0 mg/L 6-BA +0.5 mg/L NAA+1.0 g/L AC +15%CW。

1.2.4莖尖大小試驗莖尖大小共設(shè)3個處理：S1，≤0.2 mm，莖尖生長點不帶葉原基；S2，0.2～0.4 mm，莖尖生長點帶1個葉原基；S3，≥0.5 mm，莖尖生長點帶2個葉原基。培養(yǎng)基為1/2MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+25 g/L綿白糖+1.0 g/L AC+15% CW。

1.3數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)均采用Microsoft Excel 2007及SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行分析，以鄧肯氏新復(fù)極差法測驗，比較0.05水平上的差異顯著性。

2結(jié)果與分析

2.1無機鹽濃度對蝴蝶蘭莖尖組織培養(yǎng)的影響

由表1可見，無機鹽濃度對蝴蝶蘭莖尖褐化率、成活率及外植體生長有顯著影響。在一定濃度范圍內(nèi)，隨著無機鹽濃度的降低，莖尖成活率顯著增加。無機鹽濃度太高或是太低均導(dǎo)致莖尖生長點發(fā)黃褐化、玻璃化明顯。其中M3處理的莖尖葉色翠綠，長勢健康，為莖尖生長點培養(yǎng)的最適宜濃度。

2.2激素配比對蝴蝶蘭莖尖組織培養(yǎng)的影響

由表2可見，不同激素配比的培養(yǎng)基中蝴蝶蘭莖尖外植體褐化率、成活率及長勢特征差異明顯。A3處理莖尖成活率最高，但莖尖芽小，長勢弱；而A5處理成活率雖較A3處理略低，但莖尖生長勢健壯，為最適激素配比。另外，高濃度的6-BA易導(dǎo)致莖尖生長點發(fā)黃褐化、玻璃化嚴(yán)重，且有變異現(xiàn)象。

2.3糖濃度對蝴蝶蘭莖尖組織培養(yǎng)的影響

由表3可見，糖濃度對蝴蝶蘭莖尖褐化率、成活率有顯著的影響，且不同糖濃度處理外植體長勢特征差異明顯。隨著糖濃度的升高，莖尖成活率顯著降低，糖濃度太高或是太低均導(dǎo)致莖尖生長點發(fā)黃褐化、玻璃化明顯。其中T2處理莖尖長勢健康，葉色翠綠，為莖尖生長點組織培養(yǎng)最適宜的糖濃度。

2.4莖尖大小對其組培成活率和脫毒效果的影響

隨著外植體增大，莖尖培養(yǎng)成活率相應(yīng)提高，主要是因為材料越小創(chuàng)傷面積相對越大，成活率低。其中，S1處理莖尖全部死亡；S2處理莖尖成活率為8.3%，有2株未檢測到ORSV病毒，病毒脫除率為40%，表明莖尖大小介于0.2～0.4 mm之間，帶1個葉原基，有利于脫除ORSV病毒；S3 處理莖尖成活率為21.6%，但均未脫除CymMV和ORSV病毒，表明莖尖大小大于0.5 mm，帶2個葉原基，外植體成活率雖高，但不能達到脫毒效果（表4）。

3討論與結(jié)論

莖尖大小是影響脫毒率的主要因素。通常切取的莖尖越小，脫除效果越好，但成活率低。不同的植物種類因基因型和個體的差異，脫毒莖尖長度也不相同。席夢利等[14]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)宜興百合莖尖接種長度為0.8～2.0 mm時，成活率可達90%～100%，但起不到脫除病毒的作用；只有0.8 mm以下的莖尖才有可能獲得無病毒植株。而本研究結(jié)果表明蝴蝶蘭莖尖大小介于0.2～0.4 mm且?guī)?個葉原基時，有利于脫除ORSV病毒，但莖尖生長緩慢，易褐化死亡，成苗率較低。這可能是由于植物材料不同所致。

MS培養(yǎng)基中無機鹽的濃度對莖尖成活率影響顯著，本研究中隨著培養(yǎng)基中無機鹽濃度的降低，莖尖成活率明顯增加。景維杰等[13]研究表明，培養(yǎng)基的無機鹽濃度對蝴蝶蘭莖尖組織培養(yǎng)的外植體存活率有重要影響，無機鹽濃度過高造成的培養(yǎng)基高滲透壓逆境降低了蝴蝶蘭莖尖組織培養(yǎng)的存活率，這與本研究的結(jié)果一致。

激素配比對植物組織培養(yǎng)有重要的影響。本研究發(fā)現(xiàn)過高或過低的激素配比均不利于莖尖的成活，激素配比過高容易導(dǎo)致莖尖發(fā)生變異死亡，過低又不利于誘導(dǎo)生長點啟動，這與賀嘉[15]的研究結(jié)果一致。糖濃度是影響培養(yǎng)基滲透壓的重要因素，而滲透壓又直接影響了莖尖生長點的成活率，本研究結(jié)果表明糖濃度與莖尖成活率呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

綜上可得，1/3MS+ 1.0 mg/L 6-BA +0.2 mg/L NAA +15 g/L綿白糖為最適宜的蝴蝶蘭莖尖生長點培養(yǎng)基。本試驗中蝴蝶蘭莖尖存活率雖有所提高，但脫毒比率仍然較低。分析原因可能是：第一，本研究采用CymMV和ORSV兩種病毒復(fù)合感染蝴蝶蘭，加大了脫除病毒的難度；第二，莖尖剝離技術(shù)不精準(zhǔn)，還有待進一步改進。因此建議在以后的研究中對于復(fù)合感染的材料，可以先使用病毒抑制試劑（如病毒唑等）進行預(yù)培養(yǎng)，降低外植體所帶病毒的濃度，再配合莖尖培養(yǎng)脫毒；其次，在莖尖基本培養(yǎng)基中添加抗褐化試劑如活性炭或抗壞血酸，以減弱外植體的褐化程度，以提高莖尖成活率。

參考文獻：

[1]朱根發(fā). 蝴蝶蘭種質(zhì)資源及雜交育種進展[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015， 42（5）： 31-38.

[2]李正民，王安石，王健，等. 病毒抑制劑對蝴蝶蘭病毒植株的脫毒效果[J]. 熱帶生物學(xué)報，2013，4（1）：56-60，73.

[3]Zilkah S， Faingersh E， Rotbaum A， et al. In vitro micropropagation of indicator plants for indexing Prunus necrotic ring spot virus[J]. Acta Horticulturae，1993，35（336）： 121-126.

[4]艾鵬飛，羅正榮. 柿休眠芽莖尖玻璃化法超低溫保存及植株再生[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2003， 36（5）： 553-556.

[5]劉華清. 果樹無病毒化栽培及脫毒技術(shù)應(yīng)用[J]. 福建果樹，1997（3）： 30-31.

[6]唐紅琴，方鋒學(xué)，韋金菊，等. 甘蔗莖尖脫毒組織培養(yǎng)技術(shù)研究進展[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，2011，42（8）：860-865.

[7]高慧卿，樊蘭瑛，王秀紅，等. 莖尖培養(yǎng)及熱處理技術(shù)在百合脫毒中的應(yīng)用研究[J]. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2010，30（6）：528-532.

[8]蔣瑜，張麗芳，朱維賢，等. 馬鈴薯莖尖脫毒培養(yǎng)基的篩選及影響因素分析[J]. 長江蔬菜，2010（4）： 11-13.

[9]何家濤，趙勁松，董珍文，等. 高妻葡萄莖尖脫毒技術(shù)與高效再生體系研究[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007（4）： 39-42.

[10]何歡樂，陽靜，蔡潤，等. 草莓莖尖培養(yǎng)脫毒效果研究[J]. 北方園藝，2005（5）： 79-81.

[11]李正民. 蝴蝶蘭無毒苗組培快繁技術(shù)研究[D]. ?？冢汉Ｄ洗髮W(xué)， 2013.

[12]靖晶. 蝴蝶蘭組織培養(yǎng)與脫除病毒技術(shù)研究[D]. 北京：北京林業(yè)大學(xué)， 2011.

[13]景維杰，黃容清，蔣明殿，等. 蝴蝶蘭莖尖培養(yǎng)脫病毒技術(shù)初步研究[J]. 中國園藝文摘，2013（4）： 13-16.

[14]席夢利，王節(jié)萍，章靜娟，等. 宜興百合脫毒技術(shù)[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2001， 17（1）： 49-51.

[15]賀嘉. 蝴蝶蘭（Phalaenopsis）脫毒快繁關(guān)鍵技術(shù)及其生理基礎(chǔ)的研究[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2010.