黃 振，陳 炙，李佳蔓，郭洪英

(四川省林業(yè)科學(xué)研究院，四川 成都 610081)

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四川引種鄧恩桉生殖生長特性觀測及種子萌發(fā)研究

黃 振，陳 炙，李佳蔓，郭洪英*

(四川省林業(yè)科學(xué)研究院，四川 成都 610081)

通過研究引種鄧恩桉的花期發(fā)育和種子萌發(fā)能力，掌握鄧恩桉生殖生長規(guī)律，為鄧恩桉種子園的建設(shè)提供理論依據(jù)。本研究以位于綿陽梓潼縣的鄧恩桉引種試驗(yàn)林中開花的單株為研究對象，結(jié)果表明，引種鄧恩桉花期2月中旬至10月中下旬；依據(jù)形態(tài)變化，花期可分為：花芽分化期、花序形成期、蒴蓋變色期、蒴果膨大與脫落環(huán)形成期、盛花期和種子發(fā)育期。同一花序上的花蕾發(fā)育進(jìn)程基本一致，同一花枝上靠近基部的花蕾發(fā)育速度比頂部花蕾的要快，不同位置花枝的發(fā)育表現(xiàn)出隨機(jī)態(tài)勢。蒴果內(nèi)有3～4個子房腔，癟粒數(shù)量多，有效種子數(shù)量少，平均每個蒴果內(nèi)含有5粒能正常發(fā)育成苗的種子。

鄧恩桉;生殖生長;花芽分化;花粉;種子萌發(fā)

桉樹(Eucalyptus)是四川重要的用材林和工業(yè)原料林樹種之一。早在20世紀(jì)80年代，四川省林科院就開始進(jìn)行了桉樹的區(qū)域性引種試驗(yàn)，經(jīng)過多年的篩選，選擇出很多適宜于四川栽種的桉樹類型，如巨桉(E.grandis)、鄧恩桉(E.dunnii)、直干藍(lán)桉(E.maidenii)、赤桉(E.camaldulensis)等，其中鄧恩桉(E.dunnii)兼有優(yōu)良的紙漿材樹種和大徑材樹種[1]，同時具有較強(qiáng)的耐寒能力，能種植在川中丘陵區(qū)及位置靠北的盆周山地，是擴(kuò)大桉樹種植區(qū)域的理想樹種[2]。

鄧恩桉是桉樹屬的雙蒴蓋亞屬(E.subgenussymphyomyrtus)藍(lán)桉組(SectionMaidenaria)多枝桉系(seriesviminales)高大喬木[3]。與尾巨桉、柳桉等已實(shí)現(xiàn)工廠化生產(chǎn)的桉樹相比，鄧恩桉無論是組織培養(yǎng)[4,5]還是扦插繁殖[6]，均存在生根困難的問題[7]，技術(shù)瓶頸導(dǎo)致鄧恩桉的工廠化生產(chǎn)尚需時日。目前鄧恩桉的苗木培育以實(shí)生苗為主，但由于種子主要來源于澳大利亞新南威爾士州的天然林，且鄧恩桉需要10a以上才會開花結(jié)實(shí)，種子產(chǎn)量小且價格昂貴。已有報道的鄧恩桉種子園包括：貴州惠水縣鄧恩桉實(shí)生苗種子園[8]、廣西環(huán)江縣鄧恩桉無性系種子園[9]，但鄧恩桉開花結(jié)實(shí)困難的問題依然嚴(yán)重，嚴(yán)重制約了種子園的發(fā)展。因此，研究鄧恩桉的生殖生長規(guī)律，破解鄧恩桉種子產(chǎn)量低的難題是當(dāng)前鄧恩桉育種的研究重點(diǎn)。

本研究以2015年底發(fā)現(xiàn)的開花結(jié)實(shí)鄧恩桉為對象，以其生殖生長特征為研究目標(biāo)，通過觀察花芽分化和花序發(fā)育特點(diǎn)、花粉形態(tài)、蒴果和種子形態(tài)，種子萌發(fā)能力檢測，旨在揭示引種在川北地區(qū)的鄧恩桉生殖生長特性，為建立鄧恩桉種子園奠定理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 引種試驗(yàn)林簡介

鄧恩桉種子于2010年春季播種育苗，2011年上山造林，造林密度為2 m×3 m。2015年秋，觀察到3株鄧恩桉出現(xiàn)了花芽分化現(xiàn)象。2015年以這3株鄧恩桉中樹高和枝下高較矮，相對容易取樣和觀測的1株為研究材料。

1.2 試驗(yàn)地概況

鄧恩桉引種試驗(yàn)林位于綿陽市梓潼縣雙板鄉(xiāng)涼泉村，土壤紫黃泥土，屬白堊系下統(tǒng)母巖發(fā)育而成，土壤膠粘重，色調(diào)淺黃，土體構(gòu)造與紫泥土相似，小塊結(jié)構(gòu)，土壤稍緊，pH值7.6，呈微堿性。

1.3 試驗(yàn)方法

花期觀測 從2月中旬開始至10月中下旬，每30 d上山觀測花蕾變化情況，當(dāng)發(fā)現(xiàn)花蕾形態(tài)和顏色發(fā)生重大改變時，觀測周期縮短為15 d。分別記錄枝條內(nèi)和枝條間花蕾的發(fā)育速率。

減數(shù)分裂判斷 樣品固定：每次觀測完花期后，用裝配有11號刀片的3號解剖刀沿著花蕾上的脫落環(huán)把花蕾切成兩半，把帶有花藥的蒴蓋投入含有卡諾固定液的離心管中固定并帶回帶回實(shí)驗(yàn)室。小孢子發(fā)育觀測：用小鑷子從離心管中取出蒴蓋，把花藥從蒴蓋內(nèi)挑出放在載玻片上，切去花絲，把10個～20個花藥集中放置，滴1滴醋酸洋紅染色液，用鑷子將花藥反復(fù)夾碎，使花藥內(nèi)的小孢子盡量釋放，輕輕蓋上蓋玻片，再用打火機(jī)火焰從載玻片下方烘烤1 s～2 s，使染色體充分進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。隨后將載玻片放入光學(xué)顯微鏡(BX51)上觀察。

蒴果結(jié)構(gòu)觀測 2017年1月上旬，采集鄧恩桉蒴果帶回實(shí)驗(yàn)室，蒴果放置在30℃烘箱中干燥，直至蒴果開裂。分別采集蒴果橫切和縱切照片、種子形態(tài)圖。

種子萌發(fā) 把一個蒴果內(nèi)的種子和雜質(zhì)全部撒在一個含有0.5 cm厚脫脂棉花的90 mm×90 mm方形塑料培養(yǎng)皿中，濕潤棉花后，把培養(yǎng)皿放入25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔1 d加1次蒸餾水，以保持水分。種子發(fā)芽后，取出幼苗拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 花期觀測與發(fā)育節(jié)點(diǎn)判斷

觀察發(fā)現(xiàn)，鄧恩桉花芽在分化后，即可在形態(tài)上與葉芽進(jìn)行區(qū)分，花芽的發(fā)育在形態(tài)學(xué)上可以分為以下6個階段。

(1)花芽分化期(圖1-A)：從2月中下旬開始，花芽開始萌動，從形態(tài)上即可分辨出花芽和葉芽，花芽中部飽滿，顯著大于梭型葉芽，在整個分化期，花芽逐漸長大，未分化出花蕾，該階段持續(xù)到6月中下旬，消耗的時間最長。

(2)花序形成期(圖1-B，C)：花蕾表層的鱗片開始干裂脫落，各個幼嫩的花蕾從芽中長出并向各個方向伸展，形成傘房花序，該階段持續(xù)20 d～30 d，持續(xù)的壓片觀察發(fā)現(xiàn)直到該階段末期，小孢子母細(xì)胞才出現(xiàn)在花藥囊。

(3)蒴蓋變色期(圖1-D)：7月中旬，花蕾直徑長至2 mm，蒴蓋顏色開始變黃，能清晰分辨出蒴蓋與蒴果。用解剖刀縱切花蕾，發(fā)現(xiàn)花藥和花絲充滿了花蕾，花絲卷曲在一起(圖2-A)，鏡檢發(fā)現(xiàn)此時小孢子母細(xì)胞開始減數(shù)分裂，主要集中在前期Ⅰ的細(xì)線期(圖2-B)，染色體呈單條細(xì)線狀，看不到成雙的染色體，染色體的排列呈無序的絲狀排列。細(xì)胞核的體積很大，細(xì)胞質(zhì)濃稠，核仁非常明顯，部分染色體一端與核仁相連，整體形態(tài)似花束狀。這說明蒴蓋顏色的變化是減數(shù)分裂即將開始的形態(tài)學(xué)判別標(biāo)志。

圖1 鄧恩桉花芽發(fā)育過程中形態(tài)學(xué)觀測Fig.1 Morphology of E.dunnii developing flower budsA：花芽分化起始期；B-D：傘房花序形成期；E：蒴蓋變色期；F：蒴果膨大與脫落環(huán)形成期，箭頭示脫落環(huán)；G：盛花期；H：授粉后的蒴果形態(tài)。

(4)蒴果膨大與脫落環(huán)形成期(圖1-E、F)：8月份中上旬，花蕾直徑長至3mm，蒴蓋顏色持續(xù)加深，部分花蕾可見脫落環(huán)初步形成。用沿著蒴蓋下方1 mm處輕輕環(huán)割花蕾，可將蒴蓋完全去掉，露出花絲和柱頭，花絲排列規(guī)則緊密，花藥菱形呈透明狀，花柱呈淡綠色，柱頭呈深綠色(圖2-C)，此時小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂主要集中在中期Ⅰ，鏡檢可見：染色體運(yùn)動到赤道板，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)紡錘絲并形成紡錘體(圖2-D)。

(5)盛花期(圖1-G)：9月中旬，脫落環(huán)裂開一個口，在花絲張力的作用下，蒴蓋從開口處被抬起并掉落，花絲從花蕾中全部伸展(圖2-E)，花藥呈黃色或淡黃色，柱頭呈淡綠色，上有粘液，可俘獲風(fēng)吹或昆蟲攜帶的花粉。鏡檢可見成熟花粉粒，花粉粒為正四面體結(jié)構(gòu)，未見明顯萌發(fā)孔(圖2-F)。

(6)種子發(fā)育期(圖1-H)：授粉結(jié)束后，花絲和柱頭逐漸凋零，蒴果上表面逐漸由綠色變成黑灰色，質(zhì)地由軟變?yōu)閳杂?。受精卵在子房?nèi)開始發(fā)育，次年1月發(fā)育成熟。

圖2 花蕾內(nèi)部形態(tài)與小孢子發(fā)育進(jìn)程Fig.2 The internal morphology of E.dunnii flower bud and the development of microsporeA:蒴蓋變色期花蕾縱切，箭頭示花藥位置；B：處于細(xì)線期的小孢子；C：蒴果膨大與脫落環(huán)形成期的花絲與柱頭形態(tài)，箭頭示花藥位置，右下角為透明狀菱形花藥放大圖；D：處于中期Ⅰ的小孢子，細(xì)胞中央為整齊排列的染色體，箭頭示牽引染色體的紡錘絲；E：盛花期的花蕾，花絲完全伸展，花藥黃色或淡黃色，柱頭綠色；F：盛花期時，花藥內(nèi)完全成熟的花粉粒。

2.2 花枝內(nèi)與花枝間花蕾發(fā)育進(jìn)程比較

鄧恩桉花序由5個～7個花蕾組成，同一個花序的花蕾直徑相互之間差異不大，鏡檢顯示花蕾內(nèi)小孢子的發(fā)育進(jìn)程基本一致。但不同位置上的花蕾平均直徑不同，表現(xiàn)為：隨著花序著生位置從基部向頂部，花蕾的平均直徑逐漸變小。直徑最大差值>2 mm。這說明基部花蕾的發(fā)育速度比頂部花蕾的發(fā)育速度要快?；炕ɡ龠M(jìn)入盛花期的時間要早也證明了此判斷。

同一母株不同位置的花枝上花蕾的平均直徑卻表現(xiàn)出隨機(jī)的態(tài)勢，即花序的整體發(fā)育與小花枝所處的位置無關(guān)。向陽處花枝的花蕾平均直徑顯著大于陰處花枝的花蕾平均直徑。這表明向陽處花枝花蕾的發(fā)育速度比較快，陽光對花蕾的發(fā)育有良性刺激。

2.3 蒴果形態(tài)與結(jié)構(gòu)觀測

研究發(fā)現(xiàn)，一個花序上一般只能存留2～4個蒴果，與盛花時花序盛開5～6個花蕾相比，這說明授粉后，有一半左右的花蕾或蒴果會凋落，其原因可能是率先完成授粉的蒴果會分泌激素致使花蕾凋落，也可能是母樹營養(yǎng)不足，為了保證部分種子的正常發(fā)育，母樹在其它花蕾基部形成離層促使其脫落。

鄧恩桉蒴果形態(tài)見圖3-A，B，從圖中可以看出，蒴果內(nèi)有3～4個子房腔，分別對應(yīng)頂部開裂成“三菱形”和“十字形”。大部分鄧恩桉蒴果以十字形為主。

兩類蒴果的縱切結(jié)構(gòu)完全一致，種子在室內(nèi)呈上下排列成弧形(圖3-D)，上面的種子長度較長，能達(dá)到1 mm(圖3-E)，而中部的種子發(fā)育畸形，長度僅為0.5 mm左右，這些為未受精的癟粒，不能發(fā)育成苗，室的底部僅留下一個黃色的萌發(fā)痕跡(圖3-F)，由于種子和癟粒形態(tài)過小、顏色接近，難以統(tǒng)計蒴果內(nèi)種子的數(shù)量。

圖6 蒴果與種子形態(tài)及種子萌發(fā)Fig.3 Capsule and seed morphological characteristics and seed germination of E.dunniiA:四室蒴果俯視；B：三室蒴果俯視；C：四室蒴果橫切；D：蒴果縱切；E：鄧恩桉種子形態(tài)；F：萌發(fā)的鄧恩桉幼苗。

2.4 種子萌發(fā)

由于種子顏色和大小與癟粒很接近，因此，種子發(fā)芽試驗(yàn)采用了蒴果內(nèi)含物一并播種的方法，試驗(yàn)共播種了6個培養(yǎng)皿，共獲得了30株幼苗，平均5株·蒴果-1。

3 結(jié)論與討論

本研究的鄧恩桉引種試驗(yàn)林位于綿陽市梓潼縣，該區(qū)域是鄧恩桉分布的最高緯度，高于浙江臺州市臺州灣[10,11]，遠(yuǎn)高于鄧恩桉在湖南的北緣分布區(qū)[12]。盡管鄧恩桉在我國南方普遍引種，但對其開花結(jié)實(shí)等生殖方面的報道甚少，據(jù)稱在四川黑龍灘水庫以及云南種植的鄧恩桉有長勢差的個別植株能開花，貴州林科院的個別植株也有開花結(jié)實(shí)，但不育[12]，桂林引種的鄧恩桉10a后開花，但無結(jié)實(shí)報道[13]，廣西鄧恩桉無性系種子園盡管進(jìn)行了母株生理生化特性[11]和赤霉素處理[14]的研究，但鄧恩桉開花結(jié)實(shí)困難的問題依然嚴(yán)重。

通過對鄧恩桉引種試驗(yàn)林的生殖生長特性進(jìn)行觀測并獲得了自由授粉的子代苗，獲得了引種鄧恩桉在川北丘陵地帶開花習(xí)性、花蕾和蒴果發(fā)育的時間和形態(tài)學(xué)特征等鄧恩桉生殖生長特征。具體包括：

(1)鄧恩桉在2月中下旬開始進(jìn)入生殖生長，花期持續(xù)8個月，依據(jù)形態(tài)學(xué)分類，花芽的發(fā)育可分為6個階段。雄花的減數(shù)分裂開始時期與蒴蓋顏色的變化相關(guān)性較高，顏色的變化能作為減數(shù)分裂開始的形態(tài)學(xué)判別標(biāo)志。這一現(xiàn)象與鄧恩桉同一亞屬——雙蒴蓋亞屬——的尾葉桉(E.urophylla)、尾細(xì)桉(E.urophylla×E.tereticornis)和尾巨桉(E.urophylla×E.grandis)的研究結(jié)果是一致的[15,16]。

(2)花序的整體發(fā)育與花枝位置無關(guān)，向陽處花蕾的發(fā)育速度比較快?；ㄖ炕ㄐ虻陌l(fā)育速度比頂部花序的發(fā)育速度要快。這些結(jié)論為鄧恩桉種子園的營建奠定基礎(chǔ)。

(3)引種鄧恩桉蒴果中子房腔數(shù)量為3～4個，稍低于常見桉樹子房腔的數(shù)量(4～5個)。而鄧恩桉授粉后蒴果內(nèi)種子的發(fā)育與其它桉樹生殖生物學(xué)研究一致[3]，即桉樹內(nèi)具有很多假胚珠，假胚珠長成癟粒，胚珠形成的真正種子數(shù)量很少，每個蒴果4～10粒。蒴果內(nèi)種子萌發(fā)能力測試獲得了平均5株/蒴果的結(jié)果，說明引種鄧恩桉種子發(fā)育正常，具有發(fā)育成苗的能力。

研究獲得了鄧恩桉生殖生長特性的初步資料，特別是花芽、花蕾、蒴果等階段表型性狀的變化特征，尚未深入研究其內(nèi)部機(jī)理和調(diào)控措施，下一步既需要繼續(xù)深入研究生殖生物學(xué)特性，如長中大小孢子的發(fā)育規(guī)律、授粉和花粉萌發(fā)、雙受精過程等節(jié)點(diǎn)，還需要探索研究導(dǎo)致生殖生長的環(huán)境原因，比如土壤結(jié)構(gòu)、養(yǎng)分組成、水分溫度條件等因素，以尋求切實(shí)提高鄧恩桉的開花結(jié)實(shí)率的技術(shù)方法，早日實(shí)現(xiàn)鄧恩桉種子生產(chǎn)的實(shí)用化。

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A Study of Reproductive Growth Characteristics and Seed Germination ofEucalyptusdunniiIntroduced in Sichuan Province

HUANG Zhen CHEN Zhi LI Jia-man GUO Hong-ying*

(Sichuan Forestry Academy,Chengdu Sichuan 610081,China)

Studying the flowering development and seed germination of introducedEucalyptudunniiand mastering its reproductive growth law can provide a theoretical basis for seed garden.In this study,a blooming plant growing in Zitong County was selected as the experiment subject.The results were as follows:florescence date ofEucalyptudunniibeing from Mid and late February to mid and late October.Depending on morphologic change,flowering could be divided into 6 phases:Flower bud differentiation stage,inflorescence formation stage,opercle color change stage,opercle enlargement and shedding ring formation stage,flowering period,seed development stage.The development process of the buds on the same inflorescence was basically the same,and the growth of buds near the base of the same branch was faster than that of the top buds.The development of flower buds in different positions showed a random trend.Opercle had 3 to 4 ovary cavities,the number of shriveled seeds was far more than the number of effective seeds,and on a average,each capsule containing five normal seeds could develop into seedlings.

Eucalyptus,Reproductive growth,Flower bud differentiation,Pollen,Seed germination

2017-02-28

四川省基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項目：鄧恩桉花芽分化及小孢子發(fā)育的細(xì)胞學(xué)特性研究，(JB2016-14)。

黃振(1984-)，男，博士，助理研究員，研究方向：林木遺傳育種。郵箱：hz7210@126.com

郭洪英(1973-)，女，碩士，研究員，研究方向：林木遺傳育種。

10.16779/j.cnki.1003-5508.2017.02.002

S722.3

A

1003-5508(2017)03-0006-05