王顏顏，夏茂寧，明春艷，黃 勁，劉濤華，周 兵，康穎倩

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分子信標(biāo)探針技術(shù)用于PCR檢測諾卡氏菌SecA1基因

王顏顏1，夏茂寧1，明春艷1，黃 勁2，劉濤華1，周 兵1，康穎倩1

目的 將諾卡氏菌屬細菌的一段特異性DNA設(shè)計成分子信標(biāo)探針，用于該細菌的PCR檢測。方法 將諾卡氏菌屬細菌、戈登氏菌屬細菌及紅球菌屬細菌菌株分別接種于腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基分離培養(yǎng)，觀察其生長情況，提取菌株DNA作為擴增模板；設(shè)計諾卡氏菌屬細菌基于secA1基因的特異性分子信標(biāo)探針，在實時熒光定量PCR反應(yīng)譯體系中加入分子信標(biāo)探針，PCR產(chǎn)物進行熒光信號檢測。結(jié)果 諾卡氏菌secA1基因經(jīng)實時熒光定量PCR擴增后可產(chǎn)生陽性熒光信號，紅球菌屬細菌及戈登氏菌屬細菌的secA1基因、陰性對照實驗組及空白對照組經(jīng)實時熒光定量PCR擴增后不產(chǎn)生熒光信號，為陰性。結(jié)論secA1作為看家基因，是用來進行種水平的鑒定及系統(tǒng)進化研究非常理想的靶分子，而分子信標(biāo)探針技術(shù)可以準(zhǔn)確、快速、靈敏的進行諾卡氏菌secA1基因檢測。

諾卡氏菌屬；SecA1基因；分子信標(biāo)探針；實時熒光定量PCR

諾卡氏菌屬(Nocardia)為需氧放線菌，是土壤中腐生菌，不是人和動物體內(nèi)的正常菌群。諾卡氏菌感染既可發(fā)生在健康人體外傷后，又可引起免疫缺陷患者致死性感染，當(dāng)吸入或者由外傷進入人體后，可引起肺部及皮下組織的感染，也可播散至全身，引起各種內(nèi)臟器官發(fā)生感染[1-3]。諾卡氏菌屬中對人或動物致病的的病原體至少有25個種，從人體內(nèi)分離出來的諾卡菌重星形諾卡氏菌占90%，巴西諾卡氏菌占7%，而豚鼠諾卡菌占3%[4]。有報道稱，星形諾卡氏菌是報道最多的引起動物疾病的病原需氧放線菌，其中最常見的動物疾病為牛乳腺炎，也曾被報道可引起魚類感染[5]。在臨床上除非是已經(jīng)懷疑有相應(yīng)感染可能性，需氧放線菌的感染通常會被漏診或誤診[6]，目前常規(guī)使用的諾卡氏菌屬細菌的分離培養(yǎng)、生理生化反應(yīng)及經(jīng)典的PCR技術(shù)等檢測方法操作繁瑣、耗時長，不適于臨床上諾卡氏菌屬細菌的快速鑒別診斷。因此，建立諾卡氏菌屬細菌的快速、可靠、特異、靈敏且操作簡單的檢測方法十分必要。

特異性基因是多數(shù)細菌存在的最直接的標(biāo)志，有多項研究表明，在以核苷酸序列為基礎(chǔ)的放線菌分類及鑒別研究中，16S rRNA 序列難以區(qū)分某些種，而看家基因secA1的序列具有足夠的保守性以及可變性，可作為區(qū)分不同種的靶分子。Fischer[7]等擴增了分枝桿菌屬29 個種的47 株ATCC 標(biāo)準(zhǔn)菌和59 株臨床分離菌的secA1基因序列，首次發(fā)現(xiàn)分泌相關(guān)基因可以用于區(qū)分分枝桿菌屬內(nèi)的不同菌種。 Conville[8]等分析比較了諾卡氏菌屬的29 個種的16S rRNA 以及secA1基因序列，發(fā)現(xiàn)secA1基因能更好更準(zhǔn)確地區(qū)分和鑒別諾卡氏菌屬內(nèi)的菌種。同樣地，國內(nèi)學(xué)者康穎倩[9]等對戈登氏屬的23 個模式種分別進行了secA1基因和16S rRNA 系統(tǒng)進化關(guān)系的比較分析，而后得出結(jié)論，secA1作為看家基因用來進行種水平的鑒定以系統(tǒng)進化的研究，是非常理想的靶標(biāo)，同時還發(fā)現(xiàn)[9-10]，對于放線菌目中的幾種主要相關(guān)菌屬如諾卡氏菌屬、戈登氏菌屬、分枝桿菌屬、鏈霉菌屬等細菌的secA1基因翻譯出來的氨基酸序列，不同屬別的菌種各有其特異性的基序。本研究利用分子信標(biāo)探針技術(shù)對諾卡氏菌進行secA1基因檢測。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株與試劑

1.1.1 諾卡氏菌屬菌株CMCC(F)D4C、紅球菌屬菌株CMCC(F)D4B及戈登氏菌屬菌株IFM10866各一株，菌株由中國科學(xué)院微生物研究所及日本千葉大學(xué)真菌醫(yī)學(xué)研究所惠贈。

1.1.2 腦心浸出液固體培養(yǎng)基；洗滌液: 50 mmol/L Tris，pH7.7，25 mmol/L EDTA，0.1% PVP；裂解液:50 mmol /L Tris，pH8，25 mmol /L EDTA，20% SDS，1.2% PVP；抽提液:10 mmol/L Tris，pH8，1 mmol/L EDTA；3 mol/L NaAc，1.2%PVP；1×TAE緩沖液；PCR試劑；DNA Marker；瓊脂糖。

1.2 儀器 ABI StepOnePlus 實時熒光定量PCR儀為賽默飛世爾科技(中國)有限公司產(chǎn)品。

1.3 分子信標(biāo)探針的設(shè)計與合成

1.3.1 按照一般雜交探針設(shè)計的要求，根據(jù)GenBank上公布的諾卡氏菌菌株secA1基因序列，采用Primer 軟件設(shè)計分子信標(biāo)探針，并將選取的19 bp的DNA片段與諾卡氏菌屬菌株基因組DNA序列進行同源比較，確定是一段無同源片段的特異性DNA。再按照分子信標(biāo)探針設(shè)計的要求，在19 bp 特異性DNA片段的5′和3′端分別添加互補的且與目的DNA無關(guān)的6個堿基臂，5′端為CCTAGA，3′端為TCTAGG，形成一個發(fā)卡結(jié)構(gòu)(如圖1)，19 bp特異性DNA構(gòu)成發(fā)夾的嚕撲環(huán)，6個互補堿基配對形成發(fā)夾的莖。在發(fā)夾結(jié)構(gòu)的5′端標(biāo)記熒光素FAM，3′端標(biāo)記淬滅劑DABCYL。

1.3.2 分子信標(biāo)探針由立菲生物技術(shù)有限公司合成，將合成的探針用高效液相色譜(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)純化：A液(0.1 mol/L醋酸三乙酰)30%-80%，B液(75%乙腈+A液)20%-70%，梯度洗脫25 min,再用B液(100%)洗5 min，流速1 mL/min，收集相應(yīng)的峰，獲得純度較高的分子信標(biāo)探針。

圖1 分子信標(biāo)探針示意圖Fig.1 The sketch map of molecular beacon probe

1.4 模板制備 陰性對照和陽性對照的模板按下列方法處理[11]：各細菌于37 ℃溫箱培養(yǎng)5-7 d后：①挑取0.05 g濕菌體，加入35 μL裂解液及15 μL 20%SDS溶液后混勻；②微波90 s；③快速加入459 μL抽提液，混勻；④加入500 μL酚氯仿抽提液，混勻，13 400 g離心10 min，盡量吸取上清液；⑤重復(fù)步驟④一次；⑥取上清液加入800 μL無水乙醇及80 μL 3M 乙酸鈉(pH4.8-5.2)后，室溫靜置10 min；⑦13 400 g離心10 min后去上清，用70%的乙醇(150～200 μL)洗1-2次；⑧離心去上清，于37 ℃～55 ℃溫箱烘干；⑨加30～50 μL 1×TAE溶解后放入-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

M：DL2 000；1-3：諾卡氏菌CMCC(F)D4C；4：紅球菌屬菌株CMCC(F)D4Bs；5：戈登氏菌屬菌株IFM10866M:DL2000;1-3:Nocardia CMCC(F)D4C；4：GordinaCMCC(F)D4B；5：RhodococcusIFM10866圖2 3株實驗菌株secA1基因擴增瓊脂糖凝膠電泳Fig.2 Three strains agaroseg electrophoresis of amplification production of secA1 gene

1.5 實時熒光定量PCR的擴增 對上一步驟中已擴增出特異性secA1基因片段所對應(yīng)細菌DNA模板進行實時熒光定量PCR擴增，采用20 μL體系：PCR Mix 10 μL，引物各1 μL，DNA模板1 μL，分子信標(biāo)探針1 μL，雙蒸水6 μL,設(shè)空白對照。按常規(guī)PCR條件進行擴增：95 ℃ 5 min后，95 ℃ 1 min，63 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)，72 ℃ 10 min。每個模板重復(fù)3次實驗操作。

2 結(jié) 果

2.1 分子信標(biāo)探針對PCR擴增的影響 分別以含有諾卡氏菌特異性DNA的菌株作為PCR擴增模板，設(shè)計兩個實驗，一是在PCR反應(yīng)液中加入分子信標(biāo)探針，另一實驗在PCR反應(yīng)液中不含探針，同時進行PCR擴增。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明(圖3)，在PCR反應(yīng)液中加入探針及不含探針的擴增條帶基本位于同一位置，擴增產(chǎn)物的量也基本一致，這表明在PCR擴增液中加入分子信標(biāo)探針不會影響PCR的擴增反應(yīng)。

M：DL2000；1-2：諾卡氏菌CMCC(F)D4C；3-4：諾卡氏菌CMCC(F)D4C+分子信標(biāo)探針M:DL2000;1-2:Nocardia CMCC(F)D4C；3-4：Nocardia CMCC(F)D4C+ molecular beacon probe圖3 分子信標(biāo)探針對PCR擴增的影響Fig.3 Effect of molecular beacon probe on PCR amplification

2.2 分子信標(biāo)探針的特異性 本研究所設(shè)計的分子信標(biāo)探針用于檢測諾卡氏菌屬細菌secA1基因，經(jīng)實時熒光PCR檢測后發(fā)現(xiàn)：僅諾卡氏菌屬細菌產(chǎn)生陽性信號，另一實驗組紅球菌屬細菌及戈登氏菌屬細菌的secA1基因、陰性對照實驗組及空白對照組經(jīng)實時熒光定量PCR擴增后不產(chǎn)生熒光信號，為陰性(見圖4)。說明本研究設(shè)計的用于檢測諾卡氏菌屬細菌secA1基因的分子信標(biāo)探針能快速、特異、靈敏地檢測諾卡氏菌，可與其他需氧放線菌不同屬細菌進行鑒別區(qū)分。

A：諾卡氏菌CMCC(F)D4C+分子信標(biāo)探針；B：戈登氏菌IFM10866+分子信標(biāo)探針；C：馬紅球菌CMCC(F)D4B+分子信標(biāo)探針；D：陰性對照；E：空白對照A：Nocardia CMCC(F)D4C+ molecular beacon probe；B：Gordina CMCC(F)D4B+ molecular beacon probe；C：Rhodococcus IFM1086+ molecular beacon probe；D:Negative control;E:Blank control圖4 不同實驗組的實時熒光定量PCR結(jié)果Fig.4 Result of RT-PCR in different experimental groups

3 討 論

分子信標(biāo)探針的原理是熒光共振能量轉(zhuǎn)移，當(dāng)目的DNA不存時，分子信標(biāo)探針兩端的堿基臂可互補配對形成穩(wěn)定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，此時FAM 和DABCYL距離較近，在紫外光激發(fā)下，F(xiàn)AM吸收的能量通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移并傳遞給與它靠近的DABCYL，最終DABCYL再將能量以熱量的形式散失，因此無熒光產(chǎn)生；當(dāng)存在諾卡氏菌屬細菌目的DNA時，分子信標(biāo)探針的嚕撲環(huán)可與目的DNA互補結(jié)合，發(fā)生比兩臂雜交更長也更穩(wěn)定的配對，從而使發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開，F(xiàn)AM 和DABCYL隨之分開，在紫外光激發(fā)下FAM吸收能量，而FAM與DABCYL相距較遠，F(xiàn)AM吸收的能量不能轉(zhuǎn)移給DABCYL，因此產(chǎn)生熒光信號。

據(jù)報道，影響分子信標(biāo)探針的構(gòu)型變化的參數(shù)主要包括臂長、臂序列%GC含量、嚕撲環(huán)長度及溶液鹽濃度，尤其是二價陽離子如Mg2+對兩臂形成的雜交莖有較強的穩(wěn)定作用[12]，所以在本研究中常規(guī)PCR擴增時，Mg2+是反應(yīng)體系中重要的成分之一，但在進行實時熒光定量PCR擴增時未加入Mg2+的原因之一；一般探針設(shè)計的要求是嚕撲環(huán)長度至少應(yīng)該為臂長的兩倍才能保證探針與目的DNA雜交后熒光素與淬滅劑分開，所以在設(shè)計本研究的分子信標(biāo)探針時，嚕撲環(huán)長度為19個堿基，而臂長僅為6個堿基，從而保證了本研究中進行探針特異性檢測時熒光素與淬滅劑可以分開；另外，臂序列GC含量一般要求是在50%以上，這有利于形成較穩(wěn)定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，鑒于此，在設(shè)計本研究的分子信標(biāo)探針時，嚕撲環(huán)中堿基數(shù)量GC為6個，GC含量為50%，完全符合分子信標(biāo)探針設(shè)計的一般要求[13]。

目前設(shè)計分子信標(biāo)探針時可選用的熒光染料很多，而分子信標(biāo)探針依賴的是供體與受體之間的共振能量轉(zhuǎn)移，為了熒光能被有效淬滅，供體的發(fā)射光譜應(yīng)完全覆蓋受體的激發(fā)光譜，而本研究中所選用的FAM與DABCYL完全符合這一要求[14]，F(xiàn)AM的熒光效率較高，DABCYL吸收供體能量后以熱量散失，減少了干擾，因此FAM-DABCYL是較好的供體-受體對。

據(jù)文獻報道，分子信標(biāo)探針與目的DNA雜交后，未雜交的探針會有殘余熒光，這可能是由于熒光素和淬滅劑與探針堿基之間的接頭過長或雜交莖末端瞬間解開造成的熒光本底，從而影響了分子信標(biāo)探針檢測的靈敏性，因此降低熒光本底是在進行實時熒光定量PCR擴增時應(yīng)該解決的首要問題[15]。但在本研究中，即使在PCR擴增循環(huán)數(shù)較低情況下，所測得的熒光強度仍然高于本底的熒光強度，并不影響對諾卡氏菌屬細菌快速、準(zhǔn)確的鑒定。

本課題的下一步研究將會持續(xù)完善診斷鑒別分子信標(biāo)探針功能，后續(xù)將研發(fā)相關(guān)的試劑盒并投入臨床檢驗測試，收集臨床上疑似諾卡氏菌感染的病例標(biāo)本驗證所研發(fā)試劑盒的性能。

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PCR detection of theNocardiageneSecA1 using molecular beacon probe

WANG Yan-yan1, XIA Mao-ning1, MING Chun-yan1, HUANG Jing2,LIU Tao-hua1, ZHOU Bing1, KANG Ying-qian1

(1.DepartmentofMicrobiology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550025,China;2.DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550025,China)

Molecular beacon probe was designed based on a specific DNA sequence ofNocardiato PCR detection of this bacterium. The strains ofNocardia、GordinaandRhodococcuswere inoculated in Brain Heart Infusion Agar medium separately, then the growth condition was observed, DNA was extracted as a template; the molecular beacon probe was designed based on the partialsecA1 gene sequences ofNocardiastrains, and the probe was added into the reaction system of real-time fluorescence quantitative PCR (RT-PCR),and the fluorescence signal was tested at the end of PCR.Showed that the amplifiedsecA1 gene ofNocardiacould produce positive fluorescence signal in RT-PCR, but those ofGordoniaandRhodococcuswith control groups showed negative results because of no fluorescence signal. In conclusion as a housekeeping gene,secA1 is an ideal target molecule to identify the actinomycetes strains on the species level in the systematic evolution research, and the technique of fluorescence molecular beacon probe is accurate, rapid and sensitive for detecting theNocardiastrains withsecA1 gene.

Nocardia;SecA1gene;molecular beacon probe; RT-PCR

Kang Ying-qian,Email: joycekangtokyo@qq.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.06.007

國家自然基金(No.31260029)，貴州省國際科技合作項目(黔科合外G字[2014]7006)，貴陽市人民政府-貴州醫(yī)科大學(xué)科學(xué)技術(shù)聯(lián)合基金“貴陽市科技局創(chuàng)新團隊”項目(GY2015-18)和貴州省科技計劃項目(黔科合[2010]3154號)聯(lián)合資助

康穎倩，Email:joycekangtokoyo@qq.com

1.貴州醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室，貴陽 550025; 2.貴州醫(yī)科大學(xué)生化與分子生物學(xué)教研室，貴陽 550025

R379.1

A

1002-2694(2017)06-0508-05

2016-11-26 編輯：梁小潔

Supported by the National Natural Science Fund of China(No. 31260029), the International Science and Technology Cooperation Project of Guizhou(No.[2014]7006), the Technology Innovation Team Project of Guiyang(No.GY2015-18),and the Science and Technology Plan Project of Guizhou(No. [2010]3154)