沈敏，Katherine Coady, 董晶，John Davis，胡璟，柴運(yùn)宙，高仁君

1. 陶氏化學(xué)(中國(guó))投資有限公司，上海 2012032. 陶氏化學(xué)公司，美國(guó) 米德蘭 486743. 陶氏化學(xué)(中國(guó))投資有限公司，北京 100738

化學(xué)品生態(tài)毒性測(cè)試魚(yú)類模式生物的應(yīng)用與展望

沈敏1，Katherine Coady2, 董晶1，John Davis2，胡璟2，柴運(yùn)宙2，高仁君3,

1. 陶氏化學(xué)(中國(guó))投資有限公司，上海 2012032. 陶氏化學(xué)公司，美國(guó) 米德蘭 486743. 陶氏化學(xué)(中國(guó))投資有限公司，北京 100738

水生生物毒性測(cè)試廣泛應(yīng)用于評(píng)估化學(xué)品的水生態(tài)環(huán)境安全，而魚(yú)類生態(tài)毒性數(shù)據(jù)為水生生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估與風(fēng)險(xiǎn)管理提供基礎(chǔ)。本文總結(jié)了現(xiàn)有的魚(yú)類水生毒性測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)及常用的物種。闡述了常用水生魚(yú)類模式生物，如斑馬魚(yú)Danio rerio、青鳉魚(yú)Oryzias latipes、黑頭軟口鰷Pimephales promelas等作為模式魚(yú)類的特征及在生態(tài)毒性測(cè)試中的應(yīng)用。環(huán)保部7號(hào)令推薦稀有鮈鯽Gobiocypris rarus作為中國(guó)本土生物在水生毒性測(cè)試中使用。目前公開(kāi)發(fā)表的利用稀有鮈鯽的水生毒性研究多集中在急性毒性方面，對(duì)其他類型的研究如法規(guī)毒理相關(guān)的長(zhǎng)期慢性毒性有待開(kāi)展。

模式魚(yú)類；稀有鮈鯽；斑馬魚(yú)；青鳉魚(yú)；黑頭軟口鰷；生態(tài)毒理測(cè)試

對(duì)選定的生物物種進(jìn)行科學(xué)研究，用于解釋某種具有普遍規(guī)律生命現(xiàn)象的物種稱為模式生物[1]。模式生物的選擇需主要符合以下幾點(diǎn):(1)生理特征能夠代表生物界的某一大類群；(2)容易獲得并易于在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)飼養(yǎng)和繁殖；(3)世代短、子代多、遺傳背景清楚；(4)容易進(jìn)行試驗(yàn)操作。常見(jiàn)的模式生物有大腸桿菌Escherichia coli、酵母Saccharomyces cerevisiae、線蟲(chóng)Saccharomyces cerevisiae、果蠅Saccharomyces cerevisiae、小鼠Mus musculus、斑馬魚(yú)Danio rerio、非洲爪蟾Xenopus laevis等。其中斑馬魚(yú)和非洲爪蟾為水生模式動(dòng)物可用于評(píng)估環(huán)境及健康安全。斑馬魚(yú)可用于毒理學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、毒理病理學(xué)、基因通路等研究，非洲爪蟾用于細(xì)胞生物學(xué)、毒理學(xué)、神經(jīng)學(xué)、發(fā)育生物學(xué)的研究。

水生毒性測(cè)試主要用于評(píng)估化學(xué)品的水生生態(tài)環(huán)境安全，使用何種水生生物進(jìn)行毒性測(cè)試、如何選擇代表性物種、及物種的數(shù)據(jù)如何外推到其他物種是需要考慮的關(guān)鍵問(wèn)題。水生毒性測(cè)試結(jié)果可用于支持GHS(全球化學(xué)品統(tǒng)一分類和標(biāo)簽制度)分類、PNEC(預(yù)測(cè)無(wú)效應(yīng)濃度)推導(dǎo)及PBT(持久性、生物蓄積性和毒性)等的評(píng)估。急性毒性測(cè)試通常作為起始的試驗(yàn)項(xiàng)目，比如藻類生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)、溞類急性活動(dòng)抑制試驗(yàn)及魚(yú)類急性毒性試驗(yàn)。慢性試驗(yàn)可以對(duì)低濃度化學(xué)物質(zhì)長(zhǎng)期的影響進(jìn)行預(yù)測(cè)，比如大型溞繁殖試驗(yàn)及各種魚(yú)類慢性毒性試驗(yàn)。

1 生態(tài)毒性測(cè)試中的魚(yú)類模式動(dòng)物 (Model Fish for Ecotoxicity Test)

魚(yú)類作為脊椎動(dòng)物是生態(tài)毒理學(xué)測(cè)試常見(jiàn)的試驗(yàn)材料。Di Giulio和Hinton[2]列舉了測(cè)試魚(yú)種的選擇標(biāo)準(zhǔn)：(1)普遍可用及有足夠背景信息的魚(yú)類；(2)敏感度和行為歷史已知；(3)首先考慮土著和有代表性的魚(yú)類，(4)容易進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室培育和養(yǎng)護(hù)。為提高生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估可靠性，獲得有代表性魚(yú)類的毒性數(shù)據(jù)非常必要。魚(yú)類生態(tài)毒性數(shù)據(jù)是水生生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估與風(fēng)險(xiǎn)管理的基礎(chǔ)。魚(yú)類急性毒性試驗(yàn)主要測(cè)試化學(xué)品對(duì)魚(yú)類短期內(nèi)的毒性效應(yīng)(96 h半致死濃度)。魚(yú)類胚胎急性毒性測(cè)試化學(xué)品對(duì)魚(yú)類胚胎的短期毒性效應(yīng)，是魚(yú)類急性毒性測(cè)試潛在的替代試驗(yàn)。魚(yú)類慢性毒性試驗(yàn)測(cè)試化學(xué)物質(zhì)對(duì)魚(yú)類不同生命階段或整個(gè)生命周期的致死和亞致死效應(yīng)，亞致死效應(yīng)包括對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育繁殖的毒性效應(yīng)等。表1總結(jié)了生態(tài)毒理魚(yú)類毒性測(cè)試方法及相關(guān)的測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)[3-28]。

表1 魚(yú)類生態(tài)毒性測(cè)試方法Table 1 Ecotoxicity testing guideline of fish toxicity

2 生態(tài)毒性測(cè)試常用模式魚(yú)類比較 (Comparison of commonly used fish species in environmental toxicity testing)

目前國(guó)際上常用的生態(tài)毒性測(cè)試魚(yú)類包括斑馬魚(yú)、青鳉魚(yú)、黑頭軟口鰷等。表2總結(jié)了生態(tài)毒性測(cè)試中常用的魚(yú)類，包括分類、棲息地、測(cè)試主要用途、優(yōu)缺點(diǎn)等。這些測(cè)試魚(yú)種有足夠的背景，敏感度、行為歷史已知，容易實(shí)驗(yàn)室培育和養(yǎng)護(hù)。在代表性方面，斑馬魚(yú)為國(guó)際常用物種，黑頭軟口鰷為北美常用魚(yú)種，而青鳉魚(yú)在東亞常用。

2.1 斑馬魚(yú)

斑馬魚(yú)Danio rerio起源于印度，為小型的熱帶魚(yú)類，繁殖快，便于養(yǎng)殖。斑馬魚(yú)的基因組及發(fā)育都已被很好的表征。作為所有脊椎動(dòng)物(包括人類)的模型，斑馬魚(yú)作為模式生物的使用正逐漸拓展和深入到生命體的多種系統(tǒng)(例如神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等)的發(fā)育、功能和疾病研究中[29-30]，并已應(yīng)用于小分子化合物的大規(guī)模新藥篩選[31]。斑馬魚(yú)產(chǎn)卵周期短，產(chǎn)卵量大，并且可以很容易控制產(chǎn)卵時(shí)間，且胚胎在體外發(fā)育，早期胚胎完全透明，易于觀察內(nèi)部結(jié)構(gòu)，常用斑馬魚(yú)胚胎毒性測(cè)試來(lái)預(yù)測(cè)水生急性毒性。斑馬魚(yú)常用于生態(tài)毒理學(xué)測(cè)試，如急性毒性試驗(yàn)、慢性毒性試驗(yàn)(包括整個(gè)生命周期及內(nèi)分泌篩查測(cè)試)。斑馬魚(yú)及其轉(zhuǎn)基因品種在環(huán)境監(jiān)測(cè)方面也有應(yīng)用，如用于調(diào)查水污染狀況或用于特定污染物的檢測(cè)等[32]。

2.2 青鳉魚(yú)

青鳉魚(yú)Oryzias latipes是起源于亞洲的淡水魚(yú)，主要見(jiàn)于日本、韓國(guó)和中國(guó)東部。其生理學(xué)、胚胎學(xué)和遺傳學(xué)被廣泛研究[33-34]。青鳉魚(yú)的胚胎、仔魚(yú)和幼魚(yú)透明，可用于研究生長(zhǎng)發(fā)育情況[35]。青鳉魚(yú)的基因組已被很好地表征[36]。青鳉魚(yú)的性別可以基因測(cè)定，用于研究性別反轉(zhuǎn)、量化表型和基因性別等。青鳉魚(yú)常被用于生態(tài)急性毒性和慢性毒性及內(nèi)分泌效應(yīng)方面的研究。

2.3 黑頭軟口鰷

黑頭軟口鰷Pimephales promelas是水生毒理學(xué)領(lǐng)域常用的小型模式魚(yú)類，廣泛應(yīng)用于法規(guī)測(cè)試和研究中，特別是在北美地區(qū)[37]。從48 h急性致死到部分或全生命周期測(cè)試，用黑頭軟口鰷進(jìn)行的毒性測(cè)試經(jīng)常用于法規(guī)監(jiān)管項(xiàng)目中，比如高產(chǎn)量化學(xué)品(HPV)篩選評(píng)估，復(fù)雜混合物比如廢水的影響，及內(nèi)分泌干擾篩選項(xiàng)目。這個(gè)物種也被廣泛用于各類研究中，重點(diǎn)的研究主題包括定量構(gòu)效關(guān)系(QSAR)模型開(kāi)發(fā)、混合物毒性、化合物效應(yīng)跨物種外推，以及了解實(shí)驗(yàn)室結(jié)果與野外影響的相關(guān)性。黑頭軟口鰷的屬性讓它成為解決生態(tài)毒理學(xué)新挑戰(zhàn)的很好的模型，比如對(duì)具有不同作用機(jī)制的化合物識(shí)別敏感的生命階段或毒理學(xué)終點(diǎn)、基于生物組織數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)種群水平的效應(yīng)、探索了解基因組學(xué)在研究和法規(guī)中的應(yīng)用等。

2.4 其他

其他魚(yú)類如虹鱒Oncorhynchus mykiss、鯉魚(yú)Cyprinus carpio、藍(lán)鰓太陽(yáng)魚(yú)Lepomis macrochirus等也是常用淡水魚(yú)類，用于測(cè)定水生生態(tài)毒性。除淡水魚(yú)外，海水魚(yú)包括羊鯛Cyprinodon variegatus、刺魚(yú)Gasterosteus aculeatus、銀漢魚(yú)Menidia beryllina等是海洋環(huán)境常用的測(cè)試魚(yú)類。

3 中國(guó)稀有鮈鯽的應(yīng)用展望 (Chinese rare minnow application outlook)

根據(jù)環(huán)境保護(hù)部(MEP)2010年發(fā)布的7號(hào)令《新化學(xué)物質(zhì)管理辦法》，新化學(xué)物質(zhì)申報(bào)需在中國(guó)境內(nèi)使用中國(guó)的供試生物完成生態(tài)毒理學(xué)測(cè)試[39]。稀有鮈鯽(Gobiocypris rarus)作為中國(guó)本土生物在水生毒性測(cè)試中被推薦使用。自2010年7號(hào)令實(shí)施以來(lái)，稀有鮈鯽的生態(tài)毒理研究及測(cè)試報(bào)告數(shù)量大幅增加。但與國(guó)際通用魚(yú)種相比，稀有鮈鯽尚未被列入OECD導(dǎo)則推薦魚(yú)種中。從工業(yè)界的角度看，稀有鮈鯽毒性數(shù)據(jù)要被中國(guó)以外的國(guó)家廣泛接受還需要繼續(xù)深入研究和驗(yàn)證。而無(wú)論是稀有鮈鯽還是其他已存在的不同推薦魚(yú)種，對(duì)化學(xué)物質(zhì)毒性敏感性的潛在差異可能會(huì)導(dǎo)致不同國(guó)家或地區(qū)對(duì)水生環(huán)境危害的GHS分類不一致，這一點(diǎn)也需要各國(guó)化學(xué)品環(huán)境管理機(jī)構(gòu)給予關(guān)注。

通過(guò)分析國(guó)際及國(guó)內(nèi)發(fā)表的稀有鮈鯽研究發(fā)現(xiàn)，稀有鮈鯽應(yīng)用于毒理學(xué)的研究呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，毒性終點(diǎn)涉及從基因到個(gè)體等不同水平的研究。目前稀有鮈鯽法規(guī)毒理相關(guān)的水生毒性研究多集中在急性毒性方面，但公開(kāi)發(fā)表的法規(guī)毒理相關(guān)的慢性毒性數(shù)據(jù)非常有限。發(fā)表的文獻(xiàn)對(duì)稀有鮈鯽急性毒性研究的化合物主要集中在重金屬，如Cr、Hg、Cd等重金屬及有機(jī)化合物，如殺蟲(chóng)劑、殺菌劑等的研究[40-46]。除內(nèi)分泌干擾物外[47-48]，對(duì)其他類型化合物的慢性毒性公開(kāi)發(fā)表的文獻(xiàn)比較有限。

通過(guò)對(duì)稀有鮈鯽不同生命階段的毒性效應(yīng)研究發(fā)現(xiàn)，不同生命周期的敏感性可能不同。毒死蜱對(duì)稀有鮈鯽不同生命階段的毒性如下：96 h-LC50胚胎7.59 mg·L-1、仔魚(yú)0.395 mg·L-1、幼魚(yú)0.0478 mg·L-1和成魚(yú)0.0272 mg·L-1[40]，說(shuō)明稀有鮈鯽對(duì)毒死蜱的敏感性隨著其發(fā)育而增強(qiáng)。而鎘對(duì)胚胎72 h-EC50為0.219 mg·L-1[41]、仔魚(yú)96 h-LC50為2.59 mg·L-1[42]、成魚(yú)96 h-LC50為12.2 mg·L-1[43]，說(shuō)明稀有鮈鯽的胚胎對(duì)鎘更加敏感。

表3總結(jié)了不同化合物對(duì)5種魚(yú)類包含稀有鮈鯽和國(guó)際通用魚(yú)種，如斑馬魚(yú)、青鳉和虹鱒魚(yú)等的急性毒性數(shù)據(jù)(96 h-LC50)。對(duì)比分析化學(xué)品對(duì)稀有鮈鯽及國(guó)際通用魚(yú)類毒性發(fā)現(xiàn)：稀有鮈鯽對(duì)5種殺菌劑的敏感性各不相同[44]; 對(duì)于重金屬鉻和對(duì)氯苯胺，斑馬魚(yú)、稀有鮈鯽和虹鱒魚(yú)的急性毒性相似[45-46]；對(duì)于殺蟲(chóng)劑毒死蜱，稀有鮈鯽的敏感性高于斑馬魚(yú)[40]。

吳本麗(2014)等[43]用胚胎-卵黃囊吸收階段毒性試驗(yàn)方法(OECD 212)分析了稀有鮈鯽對(duì)氯化鎘和對(duì)氯苯胺的長(zhǎng)期毒性。對(duì)于環(huán)保部《新化學(xué)物質(zhì)申報(bào)登記指南》中推薦的另外2種慢性毒性測(cè)定方法，魚(yú)類早期生活階毒性試驗(yàn)(OECD 210)及魚(yú)類幼體生長(zhǎng)試驗(yàn)(OECD 215)目前未見(jiàn)有關(guān)稀有鮈鯽的公開(kāi)發(fā)表數(shù)據(jù)。表4比較了2種不同的化合物對(duì)不同魚(yú)類的慢性毒性。

通過(guò)分析國(guó)際及國(guó)內(nèi)發(fā)表的稀有鮈鯽研究發(fā)現(xiàn)，目前其水生毒性的研究多集中在急性毒性方面，對(duì)其法規(guī)毒理慢性毒性研究有待繼續(xù)開(kāi)展。運(yùn)用稀有鮈鯽已有毒性數(shù)據(jù)驗(yàn)證定量構(gòu)效關(guān)系(QSAR)模型或改進(jìn)預(yù)測(cè)模型，可以作為風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的篩選手段。對(duì)比稀有鮈鯽和國(guó)際通用魚(yú)類對(duì)更多化學(xué)品的敏感性，開(kāi)展稀有鮈鯽對(duì)更多化合物的國(guó)際及國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室急慢性試驗(yàn)驗(yàn)證，將會(huì)使稀有鮈鯽對(duì)化學(xué)品的安全性評(píng)價(jià)更具說(shuō)服力，增加國(guó)際間認(rèn)可，為水生GHS分類的一致性及動(dòng)物福利做出重要貢獻(xiàn)。

表3 化合物對(duì)不同魚(yú)類的急性毒性(96 h-LC50)比較 (mg·L-1)Table 3 Comparison of acute toxicity (96 h-LC50) of different fish species (mg·L-1)

表4 化合物對(duì)不同魚(yú)類的慢性毒性比較Table 4 Comparison of chronic toxicity of different fish species

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◆

Application and Outlook of Various Fish Models Used in Chemical Ecotoxicity Test

Shen Min Summer1, Katherine Coady2, Dong Jing1, John Davis2, Hu Jing2, Chai Yunzhou Joe2, Gao Renjun3,*

1. Dow Chemical (China) Investment Limited Company, Shanghai 201203, China2. The Dow Chemical Company, Midland 48674, USA3. Dow Chemical (China) Investment Limited Company, Beijing 100738, China

26 November 2016 accepted 16 December 2016

Aquatic toxicity testing is widely used to assess aquatic hazard of chemicals, and fish aquatic toxicity data is a critical component that contributes to aquatic ecological risk assessments and management decisions. In this paper, existing guidelines for fish toxicity testing and commonly used fish test species are summarized. For commonly used fish species, including zebrafish (Danio rerio), medaka (Oryzias latipas), and fathead minnow (Pimephales promelas), their characteristics as fish model species and their application in ecotoxicity testing are elaborated. The China Ministry of Environmental Protection (MEP) Decree No. 7 recommends Chinese rare minnow Gobiocypris rarus in aquatic toxicity testing. Published studies have mostly focused on acute toxicity, while regulatory toxicology related chronic toxicity studies need to be evaluated in future.

fish model; Gobiocypris rarus; Danio rerio; Oryzias latipas; Pimephales promelas; ecotoxicity test

沈敏(1982—)，女，博士，研究方向?yàn)榄h(huán)境毒理咨詢，E-mail：smshen2@dow.com

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: rgao@dow.com

10.7524/AJE.1673-5897.20161126004

2016-11-26 錄用日期：2016-12-16

1673-5897(2017)2-034-10

X171.5

A

高仁君(1972—)，男，博士，毒理學(xué)家，主要從事產(chǎn)品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工作。

沈敏, Katherine Coady, 董晶, 等. 化學(xué)品生態(tài)毒理測(cè)試魚(yú)類模式生物的應(yīng)用與展望[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2017, 12(2): 34-43

Shen M S, Coady K, Dong J, et al. Application and outlook of various fish models used in chemical ecotoxicity test [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2017, 12(2): 34-43 (in Chinese)