李健雄，徐剛，施勇，龔甜，周珺，熊英

(江西省疾病預(yù)防控制中心，江西南昌330029)

江西省呼吸道感染兒童人博卡病毒基因特征分析

李健雄，徐剛，施勇，龔甜，周珺，熊英

(江西省疾病預(yù)防控制中心，江西南昌330029)

目的了解近幾年江西省呼吸道感染兒童中人博卡病毒的基因特征和變異情況。方法挑取2011年8月至2015年12月采集的江西省呼吸道感染兒童的人博卡病毒陽性樣本，利用RT-PCR對人博卡病毒全基因進行測序，利用DNAStar和Mega對序列進行拼接分析。結(jié)果共得到22株人博卡病毒全基因組序列，全都屬于HBoV 1型病毒，且Ia簇，Ib簇，II組均有流行。毒株間以及與標(biāo)準(zhǔn)株ST2和ST1間的核酸同源性非常高，為97.6%～100%。蛋白質(zhì)總共有12處氨基酸發(fā)生了變異。結(jié)論引起江西省兒童呼吸道感染的HBoV較為穩(wěn)定，未發(fā)生明顯的變異，但仍應(yīng)該關(guān)注個別位點的變異是否會對病毒感染性及致病性產(chǎn)生影響。

人博卡病毒；呼吸道感染；兒童；基因特征

近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)在病毒學(xué)研究領(lǐng)域中的應(yīng)用，由病毒引起的世界性呼吸道疾病越發(fā)顯得突出。引起呼吸道感染的病毒變異快，種類多，迄今為止，仍有很多呼吸道感染的病因不明。人博卡病毒(Human bocavirus，HBoV)1-4型是最近幾年相繼被發(fā)現(xiàn)的一種病毒[1-4]，HBoV是目前已知的除B19病毒外唯一的對人類致病的細小病毒。當(dāng)前，人博卡病毒已成為常見的導(dǎo)致小兒呼吸道感染的病毒之一，是一種不能忽視的呼吸道病毒，我省2011年至2015年呼吸道感染患兒的HBoV陽性率為5.7%[5]。本研究采集江西省2011年至2015年呼吸道感染兒童的標(biāo)本，并對HBoV陽性標(biāo)本的全基因進行測序，以進行江西省HBoV的基因特征分析及變異研究。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源標(biāo)本采集自江西省兒童醫(yī)院呼吸內(nèi)科，從2011年8月至2015年12月，采集不同發(fā)病時間的發(fā)熱伴呼吸道感染癥狀的15歲以下的1508例兒童咽拭子或支氣管灌洗液，共有86例患兒被檢測出陽性。本研究根據(jù)采樣時間及病毒濃度挑選陽性毒株進行測序。

1.2 主要儀器與試劑美國Bio-Rad PCR儀，法國VILBER LOURMAT凝膠成像系統(tǒng)、Qiagen DNA mini kit提取試劑盒，Promaga GoTaq Master Mix試劑盒。

1.3 方法

1.3.1 病毒核酸提取標(biāo)本震蕩離心處理后，取200μl標(biāo)本，采用提取病毒總核酸，提取方法參考試劑盒說明書。

1.3.2 博卡病毒PCR測序采用Promaga GoTaq Master Mix試劑盒進行RT-PCR反應(yīng)對博卡病毒陽性標(biāo)本進行PCR擴增，引物序列及反應(yīng)條件參考文獻[6]。

1.3.3 基因克隆及測序用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離回收陽性的博卡基因PCR擴增產(chǎn)物，回收的目的DN A片段連接到pGM-T質(zhì)粒上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH 5A感受態(tài)細胞，篩選出的重組質(zhì)粒，用PCR鑒定的陽性克隆送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行雙向測定。

1.3.4 序列分析從GenBank上下載標(biāo)準(zhǔn)毒株ST1 (DQ000495.1)，ST2(DQ000496.1)，CU74(EF203922.1)，WLL-1(DQ778300.1)，SH2(FJ375128.1)，CQ53(JX43 4059.1)，BJ3064(DQ988933.1)，HZ1403(KP710213.1)，F(xiàn)Z40(GQ455987)，HK24(EF450740.1)，ZJ92(JX8874 82.1)，GZ9081(JN794566.1)。采用DNAStar5.0、Mega7.0.21序列分析軟件對人博卡病毒擴增的產(chǎn)物測序后核苷酸的進行拼接、核苷酸和氨基酸同源性以及遺傳進化分析。

2 結(jié)果

2.1 HBoV檢測結(jié)果本研究總共挑選30株陽性毒株進行測序，其中22株毒株測出完整序列，經(jīng)過拼接比對，序列長度為5217bp，且均屬于人博卡病毒I型。含四個編碼序列，分別編碼NS1（213～2132），NP1（2370～3029），VP1（3016～5031），VP2（3403～5031）四個蛋白。

2.2 同源性分析本次測的22株博卡病毒基因的同源性非常高，毒株間NS1，NP1，VP1，VP2四個基因的核苷酸同源性分別為99.3%～100%，98.8%～100%，98.1%～100%，97.7%～99.9%，蛋白同源性達到了99.8%～100%，99.5%～100%，99%～100%，98.9%～100%。與ST1毒株的核苷酸（蛋白）同源性分別為99.4%～99.8%（99.8%～100%），99.5%～100% (98.9%～99.8%)，98%～99.2%（99%～99.7%），97.6%～99.1%（98.9%～99.6%）。而與ST2毒株的核苷酸（蛋白）同源性更高，分別為99.6%～100%（99.8%～100%），99.2%～99.8%(99.5%～100%)，98.3%～100%（99%～100%），98%～99.9%（98.9%～100%）。

利用Mega軟件對四個編碼區(qū)分別進行進化分析，結(jié)果如圖1。從圖1（A）看出，對于核苷酸全基因，JX1938，JX1150，JX109，JX2184，JX1759，JX1 344，JX991和ST2的親緣性較近，屬于Ib簇。JX1 943，JX2200，JX1000，JX2239，JX1339，JX115和ST1的親緣性較近，屬于Ia簇，JX169和CU74的親緣性較近，屬于Ⅱ簇。而其他的毒株相對與三個標(biāo)準(zhǔn)株的親緣性較遠，且并不屬于Ic簇，主要分為五個分支。對于四個基因，不同毒株的親緣性差別較大，在不同基因上分屬于不同的簇，具體見圖1（B），圖1（C），圖1（D）。

圖1 博卡病毒核苷酸序列進化樹

2.3 氨基酸變異分析雖然不同毒株在各基因的核苷酸進化樹分支不同，但核苷酸的有效變異較少，各蛋白間的差異非常小。同ST2株氨基酸相比較，NS1蛋白氨基酸只有JX109毒株在384位發(fā)生了D-＞N的變異。對于NP1蛋白氨基酸，JX1339，JX1943，JX2200，JX2239毒株在79位均發(fā)生了S-＞N的變異。而VP1/VP2蛋白氨基酸的變異相對較多，其中JX165變異最大，有L40S，T149N，G415S，N474S，F(xiàn)540Y，I560V和M613L共7處變異。其他毒株（除JX1344）在474位同ST1一樣均有N-＞S的變異外，只有部分毒株發(fā)生了1處變異，包括D26N（JX1150），L40S（JX1000，JX2239），N546N（JX1293，JX2071），M631L（JX1597）。

3 討論

人博卡病毒屬于細小病毒科，細小病毒亞科，博卡病毒屬，是除B19細小病毒外被發(fā)現(xiàn)的與人類疾病相關(guān)的細小病毒。病毒基因組為線性單鏈DNA，約5.2kb，含3個開放讀碼框，分別編碼蛋白NS1、NP1、VP1和VP2，NS1能夠啟動病毒DNA的復(fù)制；VP1、VP2含有一個共同的重疊區(qū)，是病毒衣殼的重要結(jié)構(gòu)蛋白。其衣殼蛋白VP1包含5’端的獨有區(qū)（VP1-U）具有磷脂酶A2活性，與病毒的感染有關(guān)；NP1的功能尚不明確，可能與病毒基因的翻譯過程有關(guān)[7]。

本研究選取的22株HBoV病毒經(jīng)過測序比對發(fā)現(xiàn)，我省導(dǎo)致兒童呼吸道感染的HBoV均屬于I型，總體上基因組較為保守，各基因間的同源性基本都在98%以上，相對較大變異區(qū)域位于VP1/VP2基因片段上，這和其他文獻的報道是一致的[8～10]。根據(jù)基因進化樹顯示，HBoV可分為2個主要的組（Ⅰ組和Ⅱ組），其中I組又分為Ia，Ib和Ic3簇[11]。本研究對22株全基因的進化樹分析發(fā)現(xiàn)，江西省流行的HBoV比較雜，除Ic3簇外，其余的Ia，Ib和Ⅱ組都有流行，而且還有10個毒株和國內(nèi)流行的部分HBoV一樣并不屬于已知的所有組中。分析原因可能有兩方面，一是江西省處于中部地區(qū)，和其他省份人員交流頻繁，導(dǎo)致多種HBoV在我省流行。二是HBoV同源性較高，各組之間的親緣性非常接近，各別基因的變異就容易導(dǎo)致新的組別產(chǎn)生。

通過對不同毒株蛋白的變異發(fā)現(xiàn)，NS1，NP1蛋白的變異非常小，和ST2株相比分別只有1株和4株毒株的1個位點發(fā)生了變異，但是NP1蛋白的變異位點位于N-糖基化位點，是否會對NP1蛋白的功能產(chǎn)生影響還未知。而VP1/VP2是病毒的衣殼蛋白，其中VP2占95%，VP1占5%[12]。根據(jù)已有的研究報道[13，14]，影響HBoV抗原性的主要區(qū)域有VP1的5’端獨有的VP1U區(qū)、VP2的N端和βG-βH區(qū)域。其中VP1U區(qū)域磷脂酶A2（11～69位）的特異性活性基序（HDXXY，41～45位）是細小病毒科病毒侵入細胞的關(guān)鍵；VP2的N端區(qū)域(VP1的130～165位)富含甘氨酸，并且易于旋轉(zhuǎn)；βG-βH區(qū)域（374～576位）氨基酸序列高度可變，其插入序列具有高度抗原性。本研究中除了474位和ST1株一樣發(fā)生了變異外，其他的只有1株毒株在149位，415位，540位，460位的變異和2株毒株在546位的變異可能位于抗原性活性區(qū)域外，其余毒株均未在抗原活性區(qū)域有變異。而三株變異的毒株，特別是JX165毒株的變異是否會導(dǎo)致病毒的抗原性產(chǎn)生較大變化還有待進一步研究。

綜上所述，本研究通過對江西省22株HBoV毒株的全基因測序，發(fā)現(xiàn)我省的HBoV同源性較高，但是少數(shù)抗原性的關(guān)鍵區(qū)域有個別氨基酸發(fā)生突變，可能與免疫逃逸有關(guān)。因此應(yīng)加強對該病毒基因特性的監(jiān)測，及時掌握其變異情況，這對該病毒引起疾病的預(yù)防和控制有重要作用。

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Study of Genetic Diversity of Human Bocavirus in Children with Respiratory Tract Infection in Jiangxi

LI Jianxiong，XU Gang，SHI Yong，GONG Tian，ZHOU Jun，XIONG Ying.
Jiangxi Center for Disease Control and Prevention，Nanchang 330029，China.

Objective To identify molecular character and variability of human bocavirus(HBoV)in infants and young children with respiratory tract infection.Methods Respiratory specimens were taken from August 2011 to December 2015.The whole sequence of Human Bocavirus positive samples were sequenced to analyze the variation character by DNAStar and Mega.Results Totally 22 HBoV genes were successfully sequenced and phylogenetic analyses shows that were all belonged to type 1，and Ia cluster，Ib cluster，1b group II were all popular.Nucleic acid identity was 97.6%～100%.There were 12 the mutation amino acids in all strains.Conclusion HBoV cause d respiratory tract infection in children in jiangxi province was relatively stable，but still should pay attention to individual locus mutation that may lead to the change of virus infection and pathogenicity.

∶Human bocavirus；Respiratory infection；Children；Genetic traits

R511，R446.62

A

1674-1129(2017)03-0301-03

2016-12-28；

2017-05-18)

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.03.003

江西省衛(wèi)生計生委科技計劃（20156015）

李健雄，男，1986年生，碩士研究生，主管技師，衛(wèi)生檢驗，病毒學(xué)檢驗。