馬 軒， 莫蓓莘， 曹曉風(fēng)

(1. 深圳大學(xué)生命與海洋科學(xué)學(xué)院， 廣東省植物表觀遺傳學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 深圳 518060； 2. 中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所， 北京 100101)

水稻microRNA及其靶基因的系統(tǒng)鑒定

馬 軒1,2， 莫蓓莘1， 曹曉風(fēng)2*

(1. 深圳大學(xué)生命與海洋科學(xué)學(xué)院， 廣東省植物表觀遺傳學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 深圳 518060； 2. 中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所， 北京 100101)

microRNA (miRNA)在植物生長發(fā)育和環(huán)境脅迫中發(fā)揮著重要的作用.本研究基于49個(gè)水稻小RNA 測序數(shù)據(jù)，系統(tǒng)分析了已知miRNA的表達(dá)，并鑒定到了新的水稻miRNA. 研究發(fā)現(xiàn)，miRBase上注釋的水稻miRNA中，只有39%具有可檢測的表達(dá). 此外，對水稻降解組數(shù)據(jù)的分析鑒定到一些新的miRNA靶基因，包括2個(gè)新的miR444靶基因，它們分別編碼WD40蛋白和熱休克因子型DNA結(jié)合蛋白.

水稻; 小RNA測序； 降解組； miRNA； 靶基因

microRNA(miRNA)是一類內(nèi)源性非編碼小RNA，長度約為20～24個(gè)核苷酸[1]. 在植物中，miRNA通過剪切靶mRNA或抑制靶mRNA的翻譯，在RNA或蛋白水平調(diào)控靶基因的表達(dá)，進(jìn)而影響植物的生長發(fā)育和環(huán)境適應(yīng)[2-4]. miRNA基因表達(dá)的初級轉(zhuǎn)錄本經(jīng)過DCL-HYL1-SE復(fù)合體的加工形成miRNA前體，前體折疊形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，經(jīng)過DCL的進(jìn)一步剪切形成miRNA-miRNA*雙鏈小分子RNA[2-4]. 成熟miRNA鏈被裝載到AGO1上，引導(dǎo)AGO1對靶mRNA進(jìn)行剪切或抑制靶mRNA的翻譯[2-4]. 目前，小RNA測序技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)分析已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于miRNA的大規(guī)模鑒定中[5-6]. 降解組測序技術(shù)用來大規(guī)模鑒定植物miRNA的靶基因[7-14].

水稻(Oryzasativa)是最重要的糧食作物之一.水稻miRNA的調(diào)控作用對農(nóng)藝性狀的影響非常重要. 例如，osa-miR156靶向SPL14基因，進(jìn)而調(diào)控營養(yǎng)階段的分枝發(fā)育；osa-miR156突變體分蘗數(shù)減少，花穗和谷粒數(shù)增加[15]. 過表達(dá)osa-miR397可以增大谷粒的大小，促進(jìn)圓錐花序分枝，使得田間試驗(yàn)中谷?？偖a(chǎn)量增高25%[16]. JEONG等[5]進(jìn)行了大規(guī)模小RNA測序，鑒定出了約200個(gè)水稻miRNA. LIY F[17]等進(jìn)行了降解組測序，對水稻miRNA的靶基因進(jìn)行了系統(tǒng)鑒定.

鑒于miRNA在水稻發(fā)育中的重要作用，以及NCBI上迅速增長的水稻小RNA測序數(shù)據(jù)，本研究運(yùn)用新方法結(jié)合新數(shù)據(jù)系統(tǒng)鑒定水稻miRNA，鑒定到44個(gè)新的水稻miRNA，并發(fā)現(xiàn)miRBase上注釋的水稻miRNA中只有39%具有可檢測的表達(dá)水平. 同時(shí)，對水稻降解組數(shù)據(jù)的分析鑒定到了新的miRNA靶基因.

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

水稻小RNA測序數(shù)據(jù)來源于NCBI GEO數(shù)據(jù)庫，數(shù)據(jù)號為GSM1081563,GSM1081564,GSM1081565,GSM1409671,GSM1409672,GSM1409673,GSM1409674,GSM1547539,GSM520637,GSM520640,GSM647192,GSM647193,GSM647194,GSM647195,GSM816687,GSM816688,GSM816689,GSM816690,GSM816691,GSM816692,GSM816693,GSM816694,GSM816695,GSM816696,GSM816697,GSM816698,GSM816699,GSM816700,GSM816701,GSM816702,GSM816703,GSM816730,GSM816731,GSM816732,GSM816733,GSM816735,GSM816736,GSM816737,GSM816738,GSM816739,GSM816740,GSM816741,GSM816742,GSM816743,GSM816744,GSM816745,GSM816746,GSM816747和GSM816748. 降解組數(shù)據(jù)來源于NCBI GEO數(shù)據(jù)庫，數(shù)據(jù)號為GSM455938，GSM455939和GSM434596.

水稻結(jié)構(gòu)RNA序列來源于Rfam(http://rfam.xfam.org/)和TIGR重復(fù)序列數(shù)據(jù)庫. 水稻基因組數(shù)據(jù)來源于TIGR7(http://rice.plantbiology.msu.edu/).

1.2 生物信息學(xué)分析

首先，去除測序數(shù)據(jù)中的結(jié)構(gòu)RNA(rRNA、tRNA、snRNA和snoRNA等)，然后采用miRDeep-P(http://faculty.virginia.edu/lilab/miRDP/)對miRBase上已經(jīng)注釋的水稻miRNA進(jìn)行分析，miRNA的表達(dá)豐度以RPM(小RNA讀段數(shù)占每百萬總測序讀段數(shù)的比例)表示. 數(shù)據(jù)過濾用perl腳本完成.降解組數(shù)據(jù)分析運(yùn)用CleaveLand4工具(https://github.com/MikeAxtell/CleaveLand4).

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻miRNA的表達(dá)的分析

為了系統(tǒng)鑒定水稻miRNA，共分析了49個(gè)已經(jīng)發(fā)表的水稻小RNA測序數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)來源于幼苗、花絮等組織以及干旱、鹽脅迫、高溫和低溫處理等材料. 在miRBase中收集的576個(gè)水稻miRNA中，224個(gè)(39%)在至少一個(gè)文庫中具有可檢測的表達(dá)(RPM≥10). 在這224個(gè)miRNA中，109個(gè)屬于植物界高度保守的20個(gè)miRNA家族，15個(gè)屬于單子葉植物保守的miRNA家族，其余100個(gè)是水稻特異的miRNA. 圖1顯示，保守miRNA相對于非保守miRNA具有更高的表達(dá). 同時(shí)，352個(gè)miRBase上注釋的水稻miRNA并沒有在分析中檢測到，這說明miRBase上收錄的很多miRNA豐度很低或者不完全可信. 應(yīng)用Randfold(v2.0)對miRBase上的水稻miRNA前體進(jìn)行了生物信息學(xué)折疊分析(P值<0.01). 結(jié)果顯示，96個(gè)miRNA(17%)不能通過Randfold的檢驗(yàn)，因此，miRBase上收錄的水稻miRNA并不全是高度可信的. 本研究鑒定到了224個(gè)水稻miRNA，它們中的139個(gè)是JEONG等[5]報(bào)道的典型miRNA，12個(gè)和17個(gè)分別為JEONG等[5]報(bào)道的次要miRNA和類似siRNA的miRNA. 這說明本研究與以往研究具有很大一致性，同時(shí)又存在小的差別. 一些保守的miRNA(例如osa-miR156j, osa-miR166j, osa-miR169q和osa-miR396h等)在以往的研究中被遺漏了，然而在本研究中能夠被鑒定到，說明了本研究的可靠性.

圖1 鑒定的miRNA在不同小RNA測序文庫中的表達(dá)

Figure 1 Expressions of identified miRNAs in various small RNA-seq libraries

2.2 鑒定新的水稻miRNA

為了鑒定新的水稻miRNA，采用miRDeep-P與多種過濾相結(jié)合的方法，共鑒定到了44個(gè)新的miRNA，圖2列舉了3個(gè)新的miRNA(命名為miR_n1，miR_n11，miR_n37). 這3個(gè)miRNA前體能夠形成穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，小RNA測序數(shù)據(jù)顯示，miRNA的豐度是miRNA*豐度的70～90倍，說明這些前體能夠產(chǎn)生大量的miRNA.

圖2 3個(gè)新鑒定的miRNA的例子Figure 2 Three examples of newly identified miRNAs

這44個(gè)miRNA中的8個(gè)與miRBase上注釋的水稻miRNA是同源的. 這8個(gè)miRNA包括一個(gè)與玉米(Zeamays)miR2275和二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)miR2275直系同源的miR2275，命名為osa-miR2275e(圖3A). 不同植物的miR2275前體的序列比對(圖3B)表明，水稻miR2275e(紅圈標(biāo)記)、玉米miR2275和二穗短柄草miR2275的親緣關(guān)系更近，形成一個(gè)分支；miRBase上注釋的水稻miR2275ad屬于另一個(gè)分支，具有很多的旁系同源基因. 這8個(gè)miRNA包括一個(gè)新的miR5808(命名為osa-miR5808b)，如圖3C紅圈所示. 對水稻miRNA前體序列分析表明，osa-miR5808a、osa-miR5808b和osa-miR5801是同源的miRNA(圖3C). 這8個(gè)miRNA還包括2個(gè)新的miR812(命名為osa-miR812w和osa-miR812x，圖3D紅色標(biāo)記). 在miRBase注釋的水稻miRNA中，miR812具有24個(gè)拷貝，是拷貝最多的miRNA之一. miR812成員分為2個(gè)分支，本研究鑒定的2個(gè)新的miR812親緣關(guān)系較近，屬于第一分支(圖3D).

圖3 新鑒定到的與已知miRNA同源的miRNA

Figure 3 Novel miRNAs that are homologous to known miRNAs

2.3 水稻miRNA靶基因的鑒定

為了系統(tǒng)鑒定水稻miRNA的靶基因，筆者對已經(jīng)發(fā)表的3組降解組測序數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析. 這3組數(shù)據(jù)來源于水稻幼苗和花絮等材料，數(shù)據(jù)分析采用CleaveLand4工具，鑒定的標(biāo)準(zhǔn)是：(1)降解組峰值類型為0或1；(2)罰分≤4. 共鑒定到247對miRNA靶基因，其中的239對(97%)收錄于TarBase(v6)，即是已經(jīng)報(bào)道的miRNA靶基因. 在8對新鑒定的miRNA靶基因中，miR444-LOC_Os02g49090和miR444-LOC_Os03g63750是高可信度的靶基因(圖4A).LOC_Os02g49090編碼一個(gè)WD40結(jié)構(gòu)域蛋白，LOC_Os03g63750編碼一個(gè)熱激因子(HSF)類型的DNA結(jié)合蛋白.

3 討論

miRNA在植物的生長發(fā)育和環(huán)境適應(yīng)等方面起著重要的作用. 目前，小RNA測序和降解組測序已經(jīng)被應(yīng)用于水稻miRNA及其靶基因的鑒定中，以往的研究對水稻miRNA進(jìn)行了系統(tǒng)鑒定. 但是，鑒于NCBI上迅速增長的水稻小RNA測序數(shù)據(jù)，有必要運(yùn)用新方法結(jié)合新數(shù)據(jù)對水稻miRNA進(jìn)行系統(tǒng)鑒定. 本研究運(yùn)用miRDeep-P方法結(jié)合各種過濾，鑒定到了44個(gè)新的水稻miRNA，對水稻miRNA的開發(fā)和功能研究是有意義的. 同時(shí)，筆者對水稻降解組數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析，鑒定到了新的miRNA靶基因，例如在單子葉植物中保守的miR444可以調(diào)控多個(gè)基因，這有助于對miRNA和靶基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的解析. 目前，關(guān)于水稻miRNA調(diào)控靶基因的功能研究比較缺乏，需要應(yīng)用新技術(shù)(例如CRISPR敲除miRNA或其靶位點(diǎn))進(jìn)行深入研究.

圖A、B中，上圖顯示miRNAT和靶基因配對，下圖降解組數(shù)據(jù)顯示，miR444在基因轉(zhuǎn)錄本的剪切位點(diǎn)具有高剪切效率(如紅色線所示)；TP10M. 剪切位點(diǎn)的讀段數(shù)占每千萬總讀段數(shù)的比例.

圖4 miR444的2個(gè)新的靶基因

Figure 4 Two new targets of miR444

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【中文責(zé)編：成文 編輯助理：冷佳奕 英文責(zé)編：李海航】

Systematic Identification of microRNAs and Their Targets inOryzasativa

MAXuan1,2,MOBeixin1,CAOXiaofeng2*

(1. College of Life Sciences and Oceanography, Shenzhen University, Shenzhen 518060, P. R. China;2. Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences,Beijing100101, China)

microRNA (miRNA) play essential roles in plant development and environmental adaption. Here, based on 49Oryzasativa(rice) small RNA-seq datasets, It was systematically analyzed the expressions of known miRNAs and identified novel miRNAs in rice. It was showed that only 39% annotated miRNAs on miRBase had detectable expressions. Additionally, analysis of rice degradome datasets identified a few new miRNA targets including two miR444 targets that encode a WD40 protein and a HSF (heat shock factor)-type DNA-binding protein.

rice； small RNA-seq； degradome； miRNA； targets

2015-11-20 《華南師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)》網(wǎng)址：http://journal.scnu.edu.cn/n

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31571332，31210103901，91440105)

Q786

A

1000-5463(2017)03-0055-04

*通訊作者:曹曉風(fēng)，研究員，中國科學(xué)院院士，Email:xfcao@genetics.ac.cn.