張全國，張 甜，張志萍，周雪花，王 毅，賀 超

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光合細(xì)菌協(xié)同產(chǎn)氣腸桿菌聯(lián)合發(fā)酵制氫試驗(yàn)

張全國1,2，張 甜1，張志萍1,2，周雪花1,2，王 毅1，賀 超1,2

（1. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部農(nóng)村可再生能源新材料與裝備重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州450002； 2. 生物質(zhì)能源河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，鄭州450002）

暗-光聯(lián)合生物制氫是提高底物利用率和產(chǎn)氫潛力的有益探索。該文以玉米秸稈酶解液為產(chǎn)氫底物，采用光合細(xì)菌()與產(chǎn)氣腸桿菌（）混合培養(yǎng)工藝，進(jìn)行了同步糖化暗-光聯(lián)合生物制氫試驗(yàn)研究。以累積產(chǎn)氫量為主要指標(biāo)，利用單因素試驗(yàn)考察了底物質(zhì)量濃度、初始pH值、光照強(qiáng)度、發(fā)酵溫度對與產(chǎn)氣腸桿菌混合培養(yǎng)條件下聯(lián)合產(chǎn)氫的影響，并在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上通過正交試驗(yàn)對產(chǎn)氫工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明：各工藝參數(shù)對與產(chǎn)氣腸桿菌聯(lián)合產(chǎn)氫影響的主次順序?yàn)椋喊l(fā)酵溫度＞初始pH值＞底物質(zhì)量濃度＞光照強(qiáng)度。發(fā)酵溫度和初始pH值是影響與產(chǎn)氣腸桿菌聯(lián)合產(chǎn)氫的顯著因素。與產(chǎn)氣腸桿菌混合培養(yǎng)聯(lián)合產(chǎn)氫的較佳工藝條件為：底物質(zhì)量濃度35 g/L、初始pH值6.5、光照強(qiáng)度3 500 lx、發(fā)酵溫度30 ℃，在此條件下，72 h的累積產(chǎn)氫量達(dá)到332.6 mL，單位產(chǎn)氫量為47.5 mL/g。該試驗(yàn)研究可為基于秸稈類生物質(zhì)的暗-光細(xì)菌混合培養(yǎng)聯(lián)合產(chǎn)氫的進(jìn)一步研究提供參考。

發(fā)酵；微生物；氫氣；光合細(xì)菌；產(chǎn)氣腸桿菌；混合培養(yǎng)；聯(lián)合生物制氫

0 引 言

能源短缺，環(huán)境污染以及由此引起的人類健康等問題是當(dāng)今社會(huì)面臨的主要難題，因此，研究和開發(fā)可再生的潔凈能源已變得迫在眉睫[1]。在眾多的可再生清潔能源中，氫能因其能量密度高（122 kJ/g）[2-3]，清潔可再生等特點(diǎn)而被認(rèn)為是最理想的化石燃料的替代能源。

在眾多的制氫方法中，生物制氫因其高效、綠色、低成本受到了越來越多的關(guān)注和重視。國內(nèi)外對生物制氫的研究主要集中在厭氧暗發(fā)酵制氫和光發(fā)酵制氫[4-7]，李建政等分別對暗發(fā)酵和光發(fā)酵生物制氫工藝進(jìn)行了研究，得出其可以有效的處理污水和實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)廢棄物等生物質(zhì)原料的能源轉(zhuǎn)化[8-12]。而與單獨(dú)的暗發(fā)酵或光發(fā)酵制氫相比，暗-光細(xì)菌混合培養(yǎng)共發(fā)酵聯(lián)合制氫能夠結(jié)合各種微生物的特性發(fā)揮其優(yōu)勢，從而實(shí)現(xiàn)生物產(chǎn)氫的最大潛能[13-14]，因此，成為生物制氫領(lǐng)域新的探索方向[15]。鄭耀通等[16]最早提出了將光發(fā)酵細(xì)菌和發(fā)酵產(chǎn)氫細(xì)菌混合培養(yǎng)且進(jìn)行共固定來處理有機(jī)廢水的生物制氫工藝技術(shù)。Yokoi等[17-18]以甘薯淀粉殘?jiān)偷矸凵a(chǎn)廢物為底物，利用暗發(fā)酵細(xì)菌和聯(lián)合光合細(xì)菌進(jìn)行生物制氫，產(chǎn)氫能力分別為7.0和7.2 mol/mol葡萄糖。Kawaguchi等[19]采取乳酸菌和光合細(xì)菌進(jìn)行共培養(yǎng)，共培養(yǎng)產(chǎn)氫體系的pH值基本維持在7.0左右，產(chǎn)氫速率達(dá)到(1.55±0.28) mmol/(h·L)。

暗-光聯(lián)合生物制氫能夠?qū)崿F(xiàn)底物的有效利用，但先前研究對底物的處理大多采用的是先水解后產(chǎn)氫的兩步發(fā)酵法[20-21]，以生物質(zhì)為底物進(jìn)行同步糖化生物制氫的報(bào)道不多。和兩步發(fā)酵法相比，同步糖化法用于秸稈類生物質(zhì)制氫可以有效的解除反應(yīng)料液過度酸化對細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)氫的抑制，且同步糖化發(fā)酵還可節(jié)約時(shí)間，降低成本，降低葡萄糖和纖維二糖對纖維素酶的反饋抑制。本課題組先前的對比試驗(yàn)結(jié)果顯示：在相同的產(chǎn)氫條件下，同步糖化法的產(chǎn)氫量較兩步發(fā)酵法的產(chǎn)氫量最低可提高40%，最高可提高1.4倍。因此，該研究還將同步糖化發(fā)酵法用于聯(lián)合生物制氫過程中。中國具有豐富的秸稈類生物質(zhì)資源，若能將其充分利用，將是一條增加能源產(chǎn)出和減少環(huán)境污染的有效途徑。

因此，為了最大限度地提高產(chǎn)氫量和底物轉(zhuǎn)化率以及更好地發(fā)揮菌種間的協(xié)同作用，本研究采用同步糖化發(fā)酵方式，以纖維素含量較高的玉米秸稈[22]為發(fā)酵底物，利用課題組富集培養(yǎng)的光合細(xì)菌（）與暗發(fā)酵產(chǎn)氫菌產(chǎn)氣腸桿菌（）進(jìn)行混合培養(yǎng)共發(fā)酵聯(lián)合產(chǎn)氫試驗(yàn)研究。以累積產(chǎn)氫量為主要指標(biāo)，利用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對與產(chǎn)氣腸桿菌混合培養(yǎng)聯(lián)合產(chǎn)氫的工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化和分析，旨在最大化的實(shí)現(xiàn)玉米秸稈的產(chǎn)氫潛能，為秸稈類生物質(zhì)暗-光發(fā)酵聯(lián)合制氫研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 原料

試驗(yàn)用玉米秸稈產(chǎn)自河南農(nóng)業(yè)大學(xué)科教園區(qū)試驗(yàn)田，自然風(fēng)干后粉碎，經(jīng)60目（0.3 mm）分樣篩過篩后密封儲(chǔ)存?zhèn)溆?。用改良的王玉萬法[23]和EDS能譜[24]對其組分及主要元素進(jìn)行測定和分析，測得其主要成分和主要元素的含量如表1所示。

表1 玉米秸稈各組分及主要元素含量

1.2 產(chǎn)氫細(xì)菌

暗發(fā)酵細(xì)菌：產(chǎn)氣腸桿菌（）。兼性厭氧，革蘭陰性桿菌，無芽孢。產(chǎn)氣腸桿菌生長培養(yǎng)基/產(chǎn)氫培養(yǎng)基：蒸餾水1 000 mL；胰蛋白酶消化物15 g；大豆蛋白酶消化物5 g；NaCl 5 g。

光發(fā)酵細(xì)菌：試驗(yàn)中用到的光發(fā)酵細(xì)菌由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部可再生能源新材料與裝備重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，由深紅紅螺菌（）27%、莢膜紅假單胞菌（）25%、沼澤紅假單胞菌（）28%、類球紅細(xì)菌（）9%、莢膜紅細(xì)菌（）11%組成[25]。光合細(xì)菌生長培養(yǎng)基：蒸餾水1 000 mL；NH4Cl0.5 g；NaHCO31 g；酵母膏0.5 g；K2HPO40.1 g；CH3COONa 2 g；MgSO40.1 g；NaCl 1 g。光合細(xì)菌產(chǎn)氫培養(yǎng)基：蒸餾水1 000 mL；NH4Cl 0.4 g；MgCl20.2 g；酵母膏0.1 g；K2HPO40.5 g；NaCl 2 g；谷氨酸鈉3.56 g。

利用Logistic模型對細(xì)菌生長情況進(jìn)行回歸模擬，得到由細(xì)胞干質(zhì)量表示的細(xì)菌生長曲線如圖1所示。回歸模擬得到其決定系數(shù)2分別為0.999 0和0.990 6，說明擬合效果很好。故分別選擇培養(yǎng)48 h處于對數(shù)生長期細(xì)菌活性和濃度都較大的產(chǎn)氣腸桿菌和光合細(xì)菌進(jìn)行產(chǎn)氫試驗(yàn)。其中，對環(huán)境變化較敏感的光合細(xì)菌用海藻酸鈉溶液進(jìn)行包埋固定，使得光合細(xì)菌處于一個(gè)相對平衡穩(wěn)定的環(huán)境中，在使得培養(yǎng)基中小分子碳源和營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入其內(nèi)為細(xì)菌提供生長及產(chǎn)氫所需基質(zhì)的同時(shí)，還可以阻礙外界不利因素對細(xì)菌的影響，從而提高細(xì)菌對環(huán)境的耐受性以及產(chǎn)氫料液中的菌體濃度，進(jìn)而提高細(xì)菌的產(chǎn)氫量和產(chǎn)氫速率。具體固定方法如下：取已培養(yǎng)好處于對數(shù)生長期的光合細(xì)菌，5 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心5 min得到濕菌體，用無菌水將濕菌體懸浮制備成菌懸液，然后按照海藻酸鈉與濕菌體質(zhì)量比為10:3，將菌懸液加入到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的海藻酸鈉水溶液中，混合均勻后將其迅速吸入無菌注射器中，待凝固后將包埋好的細(xì)菌以球狀顆粒注入反應(yīng)瓶中。

a. 產(chǎn)氣腸桿菌生長曲線圖

a. Growth chart of Enterobacter aerogenes

1.3 產(chǎn)氫試驗(yàn)裝置

混合培養(yǎng)聯(lián)合產(chǎn)氫試驗(yàn)裝置如圖2所示。用電子天平準(zhǔn)確稱取試驗(yàn)所需質(zhì)量的玉米秸稈，置于洗凈烘干備用的150 mL錐形瓶中，向錐形瓶中加入100 mL pH=4.8的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液[26]，按酶負(fù)荷150 mg/g秸稈加入纖維素酶，按比例加入產(chǎn)氫培養(yǎng)基（見本文1.2），按體積分?jǐn)?shù)30%（暗/光=1:1）接入處于對數(shù)生長期的菌種（光合細(xì)菌用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的海藻酸鈉溶液包埋固定），然后調(diào)節(jié)反應(yīng)液的初始pH值至試驗(yàn)所需，最后迅速向錐形瓶中通入氬氣10 min，使反應(yīng)瓶內(nèi)保持厭氧狀態(tài)，振蕩均勻后用橡膠塞密封瓶口，放入恒溫培養(yǎng)箱，進(jìn)行生物制氫試驗(yàn)。試驗(yàn)所需光照由對稱布置的60 W白熾燈提供，生成的氣體用排水法收集。每個(gè)試驗(yàn)梯度均設(shè)置3組平行重復(fù)試驗(yàn)，并將3組平行重復(fù)試驗(yàn)的結(jié)果經(jīng)過平均值計(jì)算和誤差分析后作為最終的試驗(yàn)結(jié)果。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 氣體成分及含量的分析

所產(chǎn)氣體用安捷倫公司生產(chǎn)的6820GC-14B型氣相色譜儀進(jìn)行氫氣含量的測定。色譜條件：進(jìn)樣口溫度100 ℃，柱溫80 ℃，TCD檢測器150 ℃，氬氣作載氣，進(jìn)樣量500L，保留時(shí)間2 min。

1.4.2 pH值的測定

采用上海世諾物理光學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)的PHB—1筆型酸度計(jì)對生物制氫過程中的pH值進(jìn)行動(dòng)態(tài)測定，測量范圍0～14，精度0.1。

1.4.3 光照強(qiáng)度的測定

采用泰仕電子工業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的TES-1332數(shù)位式照度計(jì)對生物制氫過程中的光照強(qiáng)度進(jìn)行測定和設(shè)定，測量范圍：0.1～200 000 lx。

1.4.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

利用圖2所示的生物制氫試驗(yàn)裝置，進(jìn)行光合細(xì)菌（）與暗發(fā)酵產(chǎn)氫菌產(chǎn)氣腸桿菌（）混合培養(yǎng)共發(fā)酵聯(lián)合產(chǎn)氫試驗(yàn)。在課題組前期研究的基礎(chǔ)上，選定單因素試驗(yàn)的起始條件為[27]：發(fā)酵溫度30 ℃，初始pH值7.0，光照強(qiáng)度3 500 lx，接種量30%，酶負(fù)荷150 mg/g，分別考察底物質(zhì)量濃度（5、15、25、35、45 g/L）、初始pH值（5.0、6.0、6.5、7.0、8.0和9.0）、光照強(qiáng)度（2 500、3 000、3 500、4 000、4 500 lx）和發(fā)酵溫度（25、30、35、40、45 ℃）對暗-光細(xì)菌混合培養(yǎng)聯(lián)合生物制氫過程的影響。

1.4.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

正交試驗(yàn)是進(jìn)行多因素試驗(yàn)，尋求最優(yōu)水平組合的一種高效試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法。本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件選擇L9(34)型正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)并對各因素進(jìn)行極差和方差分析，旨在對和產(chǎn)氣腸桿菌聯(lián)合產(chǎn)氫過程的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化并得到其顯著影響因素。正交試驗(yàn)的因素水平如表2所示。

表2 正交試驗(yàn)因素水平表

2 結(jié)果與討論

2.1 底物質(zhì)量濃度對聯(lián)合生物制氫過程的影響

在發(fā)酵溫度為30 ℃、初始pH值為7.0、光照強(qiáng)度為3 500 lx、接種量為30%、酶負(fù)荷為150 mg/g的條件下，設(shè)定底物質(zhì)量濃度分別為5、15、25、35、45 g/L進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)氫試驗(yàn)，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可以看出，不同底物質(zhì)量濃度條件下的累積產(chǎn)氫量相差較大。底物質(zhì)量濃度為35 g/L時(shí)，發(fā)酵72 h 的累積產(chǎn)氫量最大為283.04 mL，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度增大到45 g/L時(shí)，累積產(chǎn)氫量反而有所下降，此條件下的累積產(chǎn)氫量為271.40 mL，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度過低為5和15 g/L時(shí)，發(fā)酵36 h后產(chǎn)氫幾乎停止，累積產(chǎn)氫量很低。結(jié)果表明：底物質(zhì)量濃度對產(chǎn)氫過程影響較大，在合適的范圍內(nèi)，底物質(zhì)量濃度增大可以提高發(fā)酵過程中的產(chǎn)氫量[28]，但底物質(zhì)量濃度過高或過低都不利于產(chǎn)氫[29]。分析其原因如下：底物質(zhì)量濃度過低，產(chǎn)氫微生物得不到充足的營養(yǎng)物質(zhì)而導(dǎo)致生長和代謝受限，從而影響其產(chǎn)氫效率。而底物質(zhì)量濃度過高，底物水解副產(chǎn)物VFAs的大量積累會(huì)造成發(fā)酵料液過度酸化，影響產(chǎn)氫微生物的酶促反應(yīng)，降低酶活性和細(xì)菌活性，抑制產(chǎn)氫反應(yīng)向產(chǎn)氫、產(chǎn)酸方向進(jìn)行；發(fā)酵料液中大量的固體物質(zhì)會(huì)阻擋光的傳輸和增加光的反射所帶走的能量，使得產(chǎn)氫細(xì)菌得不到充足的光能，從而降低其產(chǎn)氫效率；微生物對底物的轉(zhuǎn)化不完全[30]，會(huì)造成底物資源的浪費(fèi)。該試驗(yàn)條件下得到的較佳發(fā)酵底物質(zhì)量濃度為35 g/L。

2.2 初始pH值對聯(lián)合生物制氫過程的影響

選定優(yōu)化后的底物質(zhì)量濃度35 g/L，其他條件仍設(shè)定為發(fā)酵溫度30℃、光照強(qiáng)度3 500 lx、接種量30%、酶負(fù)荷150 mg/g。設(shè)定初始pH值分別為5.0、6.0、6.5、7.0、8.0和9.0 6個(gè)梯度進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)氫試驗(yàn)，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可以看出，不同初始pH值條件下的累積產(chǎn)氫量相差較大。初始 pH 值為6.5時(shí)，發(fā)酵72 h 的累積產(chǎn)氫量最大為327.39 mL，其次是偏酸性或中性pH值6.0和pH值7.0條件下，產(chǎn)氫量分別為309.66和264.57 mL，偏堿性pH值8.0和pH值9.0條件下產(chǎn)氫量較低，分別為175.74和146.26 mL，過度酸性條件pH值5.0時(shí)，基本上沒有氫氣的產(chǎn)生。結(jié)果表明：產(chǎn)氣腸桿菌與混合培養(yǎng)聯(lián)合產(chǎn)氫適宜在偏酸性或中性條件下進(jìn)行，pH值過高或過低都會(huì)影響其產(chǎn)氫效率。分析其原因如下：產(chǎn)氫細(xì)菌的生長和繁殖是其機(jī)體內(nèi)一系列酶促反應(yīng)的結(jié)果，而酶促反應(yīng)需要在合適的pH值范圍內(nèi)進(jìn)行，過高或過低的pH值均會(huì)對酶的活性產(chǎn)生抑制，從而影響其產(chǎn)氫效率，而且pH值過高或過低還會(huì)影響底物（秸稈）糖化過程中纖維素酶的活性，進(jìn)而影響底物的轉(zhuǎn)化率和利用率。該試驗(yàn)條件下得到的產(chǎn)氣腸桿菌與混合培養(yǎng)聯(lián)合產(chǎn)氫的較佳發(fā)酵初始pH值為6.5。

2.3 光照強(qiáng)度對聯(lián)合生物制氫過程的影響

選定優(yōu)化后的底物質(zhì)量濃度35 g/L、初始pH值6.5，其他條件仍設(shè)定為接種量30%、酶負(fù)荷150 mg/g、發(fā)酵溫度30 ℃。設(shè)定光照強(qiáng)度分別為2 500、3 000、3 500、4 000、4 500 lx 5個(gè)梯度進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)氫試驗(yàn)，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可以看出，光照強(qiáng)度從2 500 lx增大到3 500 lx時(shí)，累積產(chǎn)氫量隨著光照強(qiáng)度的增大而增大，光照強(qiáng)度為3 500 lx時(shí)，發(fā)酵72 h的累積產(chǎn)氫量最大為327.39 mL，當(dāng)光照強(qiáng)度增大到4 000 lx時(shí)，累積產(chǎn)氫量有所下降，但下降幅度較小，但當(dāng)光照強(qiáng)度繼續(xù)增大達(dá)到4 500 lx時(shí)，累積產(chǎn)氫量明顯下降，此條件下的累積產(chǎn)氫量僅為242.35 mL。結(jié)果表明：在合適的范圍內(nèi)，光照強(qiáng)度增大可以提高發(fā)酵過程中的產(chǎn)氫量，但光照強(qiáng)度過高或過低都不利于產(chǎn)氫。分析其原因如下：光照強(qiáng)度過低，固氮酶活性和ATP能量水平受到限制，產(chǎn)氫微生物因接收不到充足的光照其生長代謝也受到限制，因而產(chǎn)氫效率降低。而光照強(qiáng)度過高，光合器官吸收超過光合作用所需的光能，會(huì)引起光合系統(tǒng)的過量激發(fā)，產(chǎn)生光抑制和光飽和效應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)菌衰亡，從而影響代謝產(chǎn)氫效率。該試驗(yàn)條件下得到的較佳光照強(qiáng)度為3 500 lx。

2.4 發(fā)酵溫度對聯(lián)合生物制氫過程的影響

選定優(yōu)化后的底物質(zhì)量濃度35 g/L、初始pH值6.5、光照強(qiáng)度3 500 lx，其他條件仍設(shè)定為接種量30%，酶負(fù)荷150 mg/g。設(shè)定發(fā)酵溫度分別為25、30、35、40、45 ℃ 5個(gè)梯度進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)氫試驗(yàn)，結(jié)果如圖6所示。

由圖6可以看出，發(fā)酵溫度為30 ℃時(shí)，發(fā)酵72 h的累積產(chǎn)氫量最大為327.39 mL，當(dāng)發(fā)酵溫度高于30 ℃時(shí)，產(chǎn)氫量開始急劇下降，發(fā)酵溫度高達(dá)45 ℃時(shí)，基本沒有氫氣產(chǎn)生，累積產(chǎn)氫量僅為4.08 mL，發(fā)酵溫度為40 ℃時(shí)，累積產(chǎn)氫量較低為67.08 mL。結(jié)果表明：在一定范圍內(nèi)，發(fā)酵溫度升高可以提高發(fā)酵過程中的產(chǎn)氫量，但發(fā)酵溫度過高或過低都不利于產(chǎn)氫。發(fā)酵溫度過低，產(chǎn)氫微生物的細(xì)胞活性降低，生長代謝活動(dòng)不旺盛，會(huì)降低其代謝產(chǎn)氫效率。發(fā)酵溫度過高，產(chǎn)氫細(xì)菌代謝的酶促反應(yīng)不能正常進(jìn)行，細(xì)菌會(huì)加速衰亡，同樣會(huì)影響其代謝產(chǎn)氫效率。溫度過高或過低，會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵產(chǎn)氫的延遲期變長，降低底物水解過程中纖維素酶的活性，導(dǎo)致底物的轉(zhuǎn)化率和利用率降低，進(jìn)而影響產(chǎn)氫效率。溫度是影響產(chǎn)氫細(xì)菌生長和代謝的重要因素，不同微生物其最適生長和代謝的溫度范圍不同。在該試驗(yàn)條件下得到的較佳發(fā)酵溫度為30 ℃。

2.5 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，基于正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件選擇L9(34)型正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)，并對底物質(zhì)量濃度，初始pH值，光照強(qiáng)度和發(fā)酵溫度4個(gè)因素進(jìn)行極差和方差分析，旨在對與產(chǎn)氣腸桿菌聯(lián)合產(chǎn)氫過程的工藝參數(shù)進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化并得到其顯著影響因素。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

正交試驗(yàn)的結(jié)果采用極差值和參數(shù)值進(jìn)行分析。極差值越大，表明其對應(yīng)因素對產(chǎn)氫過程影響越顯著。值越大，表明產(chǎn)氫量越高，即值所對應(yīng)的因素水平越有利于產(chǎn)氫。由試驗(yàn)結(jié)果中的極差值可以得出：4個(gè)因素對與產(chǎn)氣腸桿菌聯(lián)合產(chǎn)氫過程影響的主次順序?yàn)椋荆荆?，即發(fā)酵溫度＞初始pH值＞底物質(zhì)量濃度＞光照強(qiáng)度。由試驗(yàn)結(jié)果中的值可以得出2222為聯(lián)合產(chǎn)氫的最優(yōu)組合，即底物質(zhì)量濃度35g/L，初始pH值6.5，光照強(qiáng)度3 500 lx和發(fā)酵溫度30℃。在正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中沒有該試驗(yàn)組合，因此在該組合條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到此條件下72 h的累積產(chǎn)氫量達(dá)到332.6 mL，高于其他組合條件下的產(chǎn)氫量。由方差分析結(jié)果中的偏離平方和值和比值可以得出：發(fā)酵溫度和初始pH值是影響與產(chǎn)氣腸桿菌聯(lián)合產(chǎn)氫的顯著因素。發(fā)酵溫度和初始pH值不僅影響底物水解過程中酶的活性，而且還影響產(chǎn)氫過程中產(chǎn)氫菌的生長代謝，進(jìn)而影響整個(gè)系統(tǒng)的產(chǎn)氫效率，這從另一方面也驗(yàn)證了試驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

3 結(jié) 論

暗-光聯(lián)合生物制氫能夠充分發(fā)揮暗發(fā)酵產(chǎn)氫菌與光發(fā)酵產(chǎn)氫菌之間的協(xié)同產(chǎn)氫能力，能夠有效地提高底物利用率和產(chǎn)氫效率。通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，得出光合細(xì)菌與產(chǎn)氣腸桿菌混合培養(yǎng)聯(lián)合產(chǎn)氫的最佳工藝條件為：底物質(zhì)量濃度35 g/L、初始pH值6.5、光照強(qiáng)度3 500 lx和發(fā)酵溫度30 ℃，在此條件下，72 h的最大累積產(chǎn)氫量為332.6 mL，單位產(chǎn)氫量為47.5 mL/g。通過對各因素進(jìn)行極差和方差分析，得出4個(gè)因素對與產(chǎn)氣腸桿菌聯(lián)合產(chǎn)氫過程影響的主次順序?yàn)椋喊l(fā)酵溫度＞初始pH值＞底物質(zhì)量濃度＞光照強(qiáng)度，發(fā)酵溫度和初始pH值是影響與產(chǎn)氣腸桿菌聯(lián)合產(chǎn)氫的顯著因素。

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Experiment of integrated fermentation hydrogen production by photosynthetic bacteria cooperating with

Zhang Quanguo1,2, Zhang Tian1, Zhang Zhiping1,2, Zhou Xuehua1,2, Wang Yi1, He Chao1,2

(1.(),450002,; 2.450002)

Along with the rapid development of society and unceasing improvement of human living standard, the consumption of fossil fuels is rising continuously, which has resulted in several problems such as energy shortage and environmental pollution. Therefore, the research and exploitation of renewable energy become extremely urgent. Hydrogen is a promising alternative energy, and can be produced through different methods. Considering the complementarity between different hydrogen-production microorganisms, dark-photo integrated bio-hydrogen production was regarded as a beneficial way to improve the utilization rate of substrate and the potential of hydrogen production. Dark-photo integrated bio-hydrogen production could combine the characteristics of various microbes, and exert their advantages. Moreover, enzymatic hydrolysis of complex substrate, VFAs production, VFAsconsumption, and hydrogen production could synchronously take place, so it could realize the reuse of byproducts (VFAs) and avoid the accumulation of liquid byproducts. In this study, enzymatic hydrolyzate of corn stover was taken as substrate,() and photosynthetic bacteria () were selected as hydrogen-production microorganisms, and simultaneous saccharification fermentative method was adopted to study the process of dark-photo integrated bio-hydrogen production by mixed cultivation ofand. Cumulative hydrogen yield was taken as key reference to optimize the process parameters of bio-hydrogen production. The single factor experiments were adopted to select the optimal lever and analyze the effects of substrate concentration, initial pH value, light intensity and fermentation temperature on the integrated bio-hydrogen production. On the basis of single factor experiments, orthogonal experimental design was also adopted to further optimize the bio-hydrogen production process parameters and evaluate the significance of influencing factors. The results of orthogonal range analysis showed that primary and secondary order of the influence of various process parameters on integrated bio-hydrogen production was: fermentation temperature＞initial pH value＞substrate concentration＞light intensity. The analysis of variance showed that fermentation temperature and initial pH value were the most significant factors affecting integrated bio-hydrogen production and produced the most significant influence on the process of integrated bio-hydrogen production by mixed cultivation of photosynthetic bacteria and. The optimum process parameters were: substrate concentration of 35 g/L, initial pH value of 6.5, light intensity of 3 500 lx, and fermentation temperature of 30 ℃. The validation experiments under these conditions were performed, and the cumulative hydrogen yield of 332.6 mL for 72 h and the capacity of unit hydrogen production of 47.5 mL/g corn stover were obtained. The optimal process parameters for bio-hydrogen production provide a scientific reference for the further research on integrated bio-hydrogen production by mixed cultivation of dark-fermentative and photo-fermentative bacteria from straw biomass.

fermentation; mircroorganism; hydrogen; photosynthetic bacteria;; mixed cultivation; integrated bio-hydrogen production

10.11975/j.issn.1002-6819.2017.09.032

TK6

A

1002-6819(2017)-09-0243-07

2016-10-24

2017-04-08

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（51676065）；教育部博士點(diǎn)基金新能源優(yōu)先領(lǐng)域項(xiàng)目（20134105130001）

張全國，男，河南鄭州人，博士，教授、博士生導(dǎo)師，主要從事可再生能源工程方面的研究。鄭州 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)450002。 Email：zquanguo@163.com

張全國，張 甜，張志萍，周雪花，王 毅，賀 超. 光合細(xì)菌協(xié)同產(chǎn)氣腸桿菌聯(lián)合發(fā)酵制氫試驗(yàn)[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2017，33(9)：243－249. doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2017.09.032 http://www.tcsae.org

Zhang Quanguo, Zhang Tian, Zhang Zhiping, Zhou Xuehua, Wang Yi, He Chao. Experiment of integrated fermentation hydrogen production by photosynthetic bacteria cooperating with[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2017, 33(9): 243－249. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2017.09.032 http://www.tcsae.org