熊 倫,周鐵安*,黃復(fù)深，沈海波，黃靚圓

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 細胞力學(xué)與生物傳感研究所，湖南 長沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖南 長沙 410128；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410128)

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QCM實時監(jiān)測人臍靜脈內(nèi)皮細胞在不同KRGD濃度自組裝膜上的動態(tài)粘附

熊 倫1,2,周鐵安1,2*,黃復(fù)深1,3，沈海波1,2，黃靚圓1,2

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 細胞力學(xué)與生物傳感研究所，湖南 長沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖南 長沙 410128；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410128)

采用自組裝及化學(xué)耦合技術(shù)將細胞粘附分子KRGD(Lys-Arg-Gly-Asp)與3-巰基丙酸(MPA)以及防止細胞非特異性粘附的三乙二醇單-11-巰基十一烷基醚(TGME)修飾于石英晶體微天平(QCM)的金電極上，制備了KRGD-MPA/TGME/Au傳感界面；采用QCM實時監(jiān)測人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)在不同KRGD濃度(0 μg·mL-1、25 μg·mL-1、50 μg·mL-1、75 μg·mL-1、100 μg·mL-1)自組裝膜上的動態(tài)粘附過程。結(jié)果表明，當(dāng)KRGD濃度為50 μg·mL-1時，QCM頻率變化Δf、動態(tài)電阻變化ΔR、細胞黏彈性指數(shù)CVI(ΔR/Δf)最大，表明該條件下HUVEC在QCM表面的粘附最強，顯示出最有組織的細胞骨架結(jié)構(gòu)而最硬；當(dāng)加入肌球蛋白Ⅱ抑制劑blebbistatin后，粘附有細胞的QCM響應(yīng)信號減弱，細胞粘附變?nèi)?，細胞變軟。表明QCM可用于監(jiān)測不同KRGD濃度自組裝膜上HUVEC的動態(tài)粘附及細胞-藥物作用，從而提供有關(guān)細胞粘附強度與黏彈性的動態(tài)信息。

人臍靜脈內(nèi)皮細胞；細胞粘附；細胞黏彈性；石英晶體微天平；KRGD；blebbistatin

石英晶體微天平(QCM)是一種基于壓電效應(yīng)的應(yīng)用廣泛的非標記生物傳感器，具有操作簡便、靈敏度和精確度高等優(yōu)點[1]，在測量細胞力學(xué)性能方面具有非常好的前景。Wu等[2]用QCM比較了年老與年輕腱干細胞的黏彈性，發(fā)現(xiàn)年老細胞的硬度與黏度較年輕細胞大[3]。Li等[4]研究證明，QCM可以有效地用作功能生物傳感器來確定活細胞的黏彈性。Zhou等[5-6]用QCM實時監(jiān)測細胞的粘附過程時發(fā)現(xiàn)，對癌癥與心血管疾病的治療或病理研究可以通過癌細胞和心肌細胞的粘附過程及其黏彈性變化來反映。

細胞粘附過程是動態(tài)的，且能反映微環(huán)境變化對細胞的影響，是研究復(fù)雜活細胞系統(tǒng)最好的模型之一。事實上，在許多生理和病理條件下，細胞粘附過程在很多生物過程(如細胞形態(tài)、生長發(fā)育、免疫反應(yīng)、癌變等)中起著十分重要的作用[7]。細胞粘附過程也是一個力傳感的過程，涉及細胞和基質(zhì)之間的相互作用力，反映活細胞的黏彈性變化，細胞對力信號的敏感過程是通過細胞外基質(zhì)、跨膜整合素受體、細胞骨架結(jié)構(gòu)和相關(guān)的信號分子所介導(dǎo)的[8-9]。

含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp)序列的RGD多肽是整合素與細胞外基質(zhì)表面配體蛋白相互作用的識別位點，在促進細胞粘附和細胞增殖等方面起著重要作用[10]，但關(guān)于RGD濃度如何影響細胞粘附過程的黏彈性變化鮮有報道。在QCM等細胞傳感器的相關(guān)研究中，核心技術(shù)是如何將細胞有效地固定于傳感界面上。細胞傳感界面的優(yōu)化是制備具有優(yōu)良性能細胞傳感器的核心技術(shù)。已有報道將RGD固定于QCM傳感界面用于細胞粘附研究[11-12]，但在促進細胞粘附過程的同時未考慮抑制細胞的非特異性粘附。此前，周鐵安課題組[13]采用自組裝技術(shù)將細胞粘附分子RGDC(Arg-Gly-Asp-Cys)和防止細胞非特異性粘附的三乙二醇單-11-巰基十一烷基醚(TGME)修飾于金電極表面，制備了致密、穩(wěn)定、對大鼠心肌H9C2細胞具有特異性粘附的傳感界面。

KRGD(Lys-Arg-Gly-Asp)是在RGD的一端連接了一個含氨基的賴氨酸，氨基端可經(jīng)酰胺化共價耦合與3-巰基丙酸(MPA)中的羧基相連，另一端的RGD則可與細胞產(chǎn)生粘附作用。鑒于此，作者采用KRGD對QCM金電極表面進行修飾，首先將MPA與TGME混合后自組裝于QCM金電極表面，之后通過1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽/N-羥基琥珀酰亞胺(EDC/NHS)將MPA中的羧基與KRGD中含有氨基的賴氨酸經(jīng)化學(xué)耦合而將KRGD固定在金電極上，制備了KRGD-MPA/TGME/Au傳感界面，研究不同KRGD濃度對人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)動態(tài)粘附與黏彈性的影響；然后在最佳KRGD濃度下，用QCM實時監(jiān)測肌球蛋白Ⅱ抑制劑blebbistatin對HUVEC動態(tài)粘附的影響，以推動細胞傳感技術(shù)的進一步發(fā)展。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

HUVEC，上海通派生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基；胎牛血清；濃硫酸、30%雙氧水、無水乙醇(分析純)，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；TGME、MPA、EDC、NHS，美國Sigma公司；KRGD，上海生工；青霉素-鏈霉素-谷氨酰胺溶液，Life Technologies；磷酸鹽緩沖溶液(PBS)；Millipore Milli-Q超純水。

QCM 922型八通道石英晶體微天平、9 MHz AT切型金電極石英晶體(基底直徑8 mm，電極直徑5 mm)，Seiko-EG&G公司；CO2培養(yǎng)箱，德國Binder公司。

1.2 方法

1.2.1 HUVEC的培養(yǎng)

HUVEC貼壁培養(yǎng)于10%胎牛血清的DMEM/高糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為5%CO2、37 ℃。一般2～3 d傳代一次。

1.2.2 金電極的預(yù)處理

將金電極先用無水乙醇、去離子水清洗，氮氣吹干；然后用Piranha溶液(30%H2O2∶H2SO4=1∶3，體積比，80 ℃)處理30 s；再用去離子水、無水乙醇清洗，氮氣吹干；重復(fù)3次。將無水乙醇滴到金電極上靜置幾分鐘，用滅菌水沖洗，氮氣吹干，備用。

1.2.3 KRGD-MPA/TGME/Au傳感界面的制備及用于HUVEC的粘附

KRGD-MPA/TGME/Au傳感界面的制備在常溫(20±5) ℃下進行。將預(yù)處理過的金電極組裝到Teflon井型池中，清洗的一面與Teflon井型池中的溶液接觸，另一面與O型橡膠圈接觸，與Teflon井型池底部形成一空氣室。連接QCM 922通道，置于20 mmol·L-1MPA+1 mmol·L-1TGME(無水乙醇為溶劑)溶液中，過夜(約15～24 h)，吸出溶液，將無水乙醇輕輕打進井型池中，吸出無水乙醇后，用Millipore Milli-Q超純水輕輕沖洗，氮氣吹干。將150 mmol·L-1EDC、30 mmol·L-1NHS(pH=5.5)溶液加入池中，浸泡約60 min后依次用PBS緩沖溶液(pH=5.5)、Millipore Milli-Q超純水沖洗，氮氣吹干。取200 μL濃度(μg·mL-1)分別為0、25、50、75、100的KRGD溶液(PBS為溶劑)加入到金電極表面，靜置1～2 h，得到不同KRGD濃度的KRGD-MPA/TGME/Au傳感界面。

用PBS緩沖溶液、滅菌水輕輕沖洗，氮氣吹干；加入200 μL HUVEC(約20 000個細胞)。開啟QCM

實時監(jiān)測HUVEC在KRGD-MPA/TGME/Au傳感界面上的動態(tài)粘附過程中(0～15 h)的頻率變化(Δf)與動態(tài)電阻變化(ΔR)。

1.2.4 藥物響應(yīng)

用肌球蛋白Ⅱ抑制劑blebbistatin研究KRGD-MPA/TGME/Au傳感界面的藥物響應(yīng)。在KRGD-MPA/TGME/Au (KRGD濃度為50 μg·mL-1) 傳感界面粘附好20 000個HUVEC得到穩(wěn)定響應(yīng)曲線后，向各通道中同時加入5 μL 50 μmol·L-1blebbistatin，繼續(xù)監(jiān)測其Δf和ΔR，直到響應(yīng)曲線再次趨于穩(wěn)定為止。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同KRGD濃度KRGD-MPA/TGME/Au傳感界面對HUVEC粘附過程中Δf和ΔR的影響

選用5種不同KRGD濃度(0、25、50、75、100，μg·mL-1)的KRGD-MPA/TGME/Au傳感界面，比較KRGD濃度對20 000個HUVEC粘附過程中Δf和ΔR的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同KRGD濃度KRGD-MPA/TGME/Au傳感界面對HUVEC粘附過程中Δf(a)和ΔR(b)的影響

從圖1可以看出，在不同KRGD濃度KRGD-MPA/TGME/Au傳感界面上，HUVEC粘附過程中的Δf和ΔR由小到大的順序依次為：0 μg·mL-1<20 μg·mL-1<100 μg·L-1<75 μg·mL-1<50 μg·mL-1，表明KRGD濃度為50 μg·mL-1時，KRGD-MPA/TGME/Au傳感界面對HUVEC的粘附最強。

2.2 不同KRGD濃度KRGD-MPA/TGME/Au傳感界面對HUVEC粘附過程中黏彈性指數(shù)(CVI)的影響

細胞黏彈性是與細胞結(jié)構(gòu)與功能密切相關(guān)的重要生物物理特性，其大小主要由細胞骨架決定，在細胞生長、分化等過程中起著重要作用。用于單細胞黏彈性

參數(shù)的研究方法較多，如原子力顯微鏡(AFM)已被用于不同細胞(包括內(nèi)皮細胞)硬度的測定[14]。用于細胞群黏彈性測定的方法較為缺乏，QCM由于其無損、動態(tài)監(jiān)測、且可從細胞與細胞外基質(zhì)粘附界面處研究細胞群的平均黏彈性等特征而成為細胞群黏彈性研究的重要方法。

本實驗采用細胞黏彈性指數(shù)CVI(ΔR/Δf)來表征細胞的黏彈性，CVI越大，細胞骨架的組織程度越高、細胞越硬；CVI越小，細胞越軟[5]。不同KRGD濃度KRGD-MPA/TGME/Au傳感界面對20 000個HUVEC粘附過程中CVI的影響如圖2所示。

圖2 不同KRGD濃度KRGD-MPA/TGME/Au傳感界面對HUVEC粘附過程中CVI的影響

由圖2可以看出，當(dāng)KRGD濃度為50 μg·mL-1時，CVI最大，而后依次為75 μg·mL-1、100 μg·

mL-1、25 μg·mL-1，最小為0 μg·mL-1(即裸電極)，與Δf及ΔR變化規(guī)律一致。

2.3 blebbistatin對QCM實時監(jiān)測HUVEC粘附過程的影響

肌球蛋白Ⅱ抑制劑blebbistatin是小分子抑制劑的一種，它能與肌球蛋白和ADP-Pi復(fù)合體優(yōu)先結(jié)合，從而減少磷酸根的釋放[15]。blebbistatin可以抑制哺乳動物動脈平滑肌[16]，阻斷肌動蛋白分離狀態(tài)下的肌球蛋白Ⅱ和防止僵化肌動球蛋白交聯(lián)的特性是其體內(nèi)應(yīng)用的一個很大的優(yōu)勢[17]。因此，本實驗研究了blebbistatin對QCM實時監(jiān)測HUVEC粘附過程的影響。待20 000個HUVEC粘附在KRGD-MPA/TGME/Au(KRGD濃度為50 μg·mL-1)上達到平穩(wěn)后(約24 h)，加入5 μL 50 μmol·L-1blebbistatin來研究其對HUVEC粘附過程的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 blebbistatin對QCM實時監(jiān)測HUVEC粘附過程的影響

從圖3a可以看出，在KRGD濃度為50 μg·mL-1的KRGD-MPA/TGME/Au傳感界面上加入20 000個HUVEC后，Δf逐漸降低，ΔR逐漸升高，表明HUVEC粘附在了KRGD-MPA/TGME/Au傳感界面上；待曲線趨于穩(wěn)定后，加入5 μL 50 μmol·L-1blebbistatin(最終濃度為1.22 μmol·L-1)，QCM響應(yīng)信號減弱，Δf上升，ΔR下降。

從圖3b可以看出，在blebbistatin作用下，CVI減小，吸附變?nèi)?、細胞變軟，與Tarantola等[18]研究的加入blebbistatin后細胞軟化的結(jié)論一致。

2.4 討論

本實驗采用自組裝及化學(xué)耦合技術(shù)將KRGD與MPA、TGME修飾于QCM金電極上，制備了5種不同KRGD濃度的KRGD-MPA/TGME/Au傳感界面，通過QCM實時監(jiān)測HUVEC在傳感界面上的Δf、ΔR及CVI。當(dāng)KRGD濃度為50 μg·mL-1時，Δf、ΔR、CVI最大，其次為75 μg·mL-1、100 μg·mL-1、25 μg·mL-1，最小為0 μg·mL-1(即裸電極)。因此可認為當(dāng)KRGD濃度為50 μg·mL-1時，HUVEC與KRGD-MPA/TGME/Au傳感界面有很強的粘附作用并使HUVEC得以順利鋪展，粘附效果最佳，表明細胞應(yīng)力纖維量最多，所搭建的細胞骨架結(jié)構(gòu)最穩(wěn)定、細胞最硬。這可能是由于在較高KRGD濃度(75 μg·mL-1、100 μg·mL-1)下，HUVEC與KRGD-MPA/TGME/Au傳感界面的粘附作用由于KRGD的取向受空間位阻影響較50 μg·mL-1KRGD濃度下有所減弱，較裸電極和25 μg·mL-1KRGD濃度下強很多，故Δf、ΔR、CVI處于中間值；與文獻[19]研究的當(dāng)RGD濃度超過一定值后對細胞已不具備特異性粘附能力的結(jié)論一致。

QCM生物傳感器可用于檢測細胞骨架改變和動力學(xué)，并且可以對受到細胞骨架擾動或細胞附著影響的生物活性藥物或生物大分子進行有價值的篩選[1,20]。本實驗發(fā)現(xiàn)，KRGD-MPA/TGME/Au傳感界面粘附HUVEC后，在blebbistatin的作用下，細胞黏彈性減小、細胞變軟、與傳感界面之間的粘附作用減弱。

3 結(jié)論

用QCM實時監(jiān)測HUVEC在不同KRGD濃度KRGD-MPA/TGME/Au傳感界面上的動態(tài)粘附過程以及加入肌球蛋白Ⅱ抑制劑blebbistatin后的響應(yīng)變化。結(jié)果表明，當(dāng)KRGD濃度為50 μg·mL-1時，QCM頻率變化Δf、動態(tài)電阻變化ΔR、細胞黏彈性指數(shù)CVI(ΔR/Δf)最大，表明該條件下HUVEC在QCM表面的粘附最強、顯示出最有組織的細胞骨架結(jié)構(gòu)而最硬；當(dāng)加入肌球蛋白Ⅱ抑制劑blebbistatin后，粘附有細胞的QCM響應(yīng)信號減弱，細胞粘附變?nèi)?、細胞變軟?/p>

本實驗所構(gòu)建的KRGD-MPA/TGME/Au傳感界面可以達到保持細胞活性和穩(wěn)定性的效果，能夠防止細胞的非特異性粘附。通過不同濃度KRGD修飾的傳感界面對細胞粘附效果的對比實驗，獲得了最佳KRGD濃度，確保傳感界面對細胞運動和結(jié)構(gòu)變化等有較高的靈敏度。細胞黏彈性等關(guān)鍵信息可用于量化藥物的影響、突變或疾病細胞的結(jié)構(gòu)分析。該研究對推動細胞傳感技術(shù)的進一步發(fā)展及應(yīng)用于藥物篩選和評估領(lǐng)域具有積極意義。

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Real-Time Monitoring of Dynamic Adhesion of Human Umbilical Vein Endothelial Cells on Self-Assembled Films with Different KRGD Concentrations Using Quartz Crystal Microbalance

XIONG Lun1,2,ZHOU Tie-an1,2*,HUANG Fu-shen1,3,SHEN Hai-bo1,2，HUANG Jing-yuan1,2

(1.InstituteofCellMechanicsandBiosensing,HunanAgriculturalUniversity,Changsha410128,China; 2.CollegeofBioscienceandBiotechnology,HunanAgriculturalUniversity,Changsha410128,China; 3.CollegeofVeterinaryMedicine,HunanAgriculturalUniversity,Changsha410128,China)

CelladhesionpeptideKRGD(Lys-Arg-Gly-Asp),3-mercaptopropionicacid(MPA)andTGMEwhichpreventednon-specificadhesionweremodifiedonquartzcrystalmicrobalance(QCM)Auelectrodebyself-assemblyandchemicalcoupling,andKRGD-MPA/TGME/Ausensinginterfacewasprepared.QCMwasusedforreal-timemonitoringofthedynamicadhesionsofhumanumbilicalveinendothelialcells(HUVEC)onthemodifiedself-assembledfilmswithdifferentKRGDconcentrations(0μg·mL-1,25μg·mL-1,50μg·mL-1,75μg·mL-1,100μg·mL-1).Resultsindicatedthat,QCMgavethelargestresponsesignalsincludingfrequencychangeΔf,motionalresistancechangeΔR,andcellviscoelasticindexCVI(ΔR/Δf)whenKRGDconcentrationwas50μg·mL-1.SoitwasindicatedtheadhesionofHUVEConQCMsurfacewasthestrongest,andthemostorganizedcytoskeletalstructurewasthehardest.InthepresenceofmyosinⅡinhibitorblebbistatin，ΔfandΔRsignalsofQCMadheredHUVECreducedlargely,cells′adhesionbecameweaker,andcellsbecamesofter.TheresultsdemonstratedthatQCMcouldbeusedtomonitortheadhesionofHUVEConthemodifiedsurfaceswithdifferentKRGDconcentrationsandcell-druginteraction,soastoprovidedynamicinformationaboutcelladhesionstrengthandcellviscoelasticity.

humanumbilicalveinendothelialcell(HUVEC);celladhesion;cellviscoelasticity;quartzcrystalmicrobalance(QCM);KRGD;blebbistatin

國家自然科學(xué)基金面上項目(21275048)，湖南省科技廳重點項目(2013TT1009)

2017-01-04

熊倫(1991-)，女，湖南長沙人，碩士研究生，研究方向：細胞與分子生物物理學(xué)，E-mail：15211082804@163.com；通訊作者：周鐵安，教授，tieanzhou@hunau.edu.cn。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.06.008

O647.1

A

1672-5425(2017)06-0036-05

熊倫，周鐵安，黃復(fù)深，等.QCM實時監(jiān)測人臍靜脈內(nèi)皮細胞在不同KRGD濃度自組裝膜上的動態(tài)粘附[J].化學(xué)與生物工程，2017，34(6)：36-40.