孔 靜,易美君,許 昕,姜 麗,郁志芳

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,江蘇南京 210095)

?

冷藏期間蘋(píng)果果實(shí)能量和NADP-蘋(píng)果酸酶及基因表達(dá)的變化

孔 靜,易美君,許 昕,姜 麗,郁志芳*

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,江蘇南京 210095)

為研究冷藏期間蘋(píng)果果實(shí)能量水平和NADP-蘋(píng)果酸酶(NADP-ME)及基因表達(dá)的變化情況,本研究以‘長(zhǎng)富2’蘋(píng)果果實(shí)為實(shí)驗(yàn)材料,定期測(cè)定果實(shí)硬度、可溶性固形物等品質(zhì)指標(biāo)和能量相關(guān)物質(zhì)三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、磷酸腺苷(AMP)含量和能荷變化及NADP-ME、琥珀酸脫氫酶(SDH)活性。結(jié)果顯示,冷藏期間,‘長(zhǎng)富2’果實(shí)ATP含量貯藏前60 d下降，而后恢復(fù)到貯藏初期水平,ADP和AMP貯藏前60 d稍有降低后,隨時(shí)間延長(zhǎng)顯著增加;NADP-ME和琥珀酸脫氫酶(SDH)活性均隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)逐漸降低;輔酶Ⅱ(NADP+)和還原型輔酶Ⅱ(NADPH)含量在貯藏前120 d先增加后下降,與能荷變化相似;MdcyME1-MdcyME3基因表達(dá)雖在時(shí)間上有一定差異，但表現(xiàn)出相似的先增加后下降的趨勢(shì)。冷藏期間蘋(píng)果果實(shí)能量水平和利用效率發(fā)生了改變,且能量水平與NADP-ME活性及其基因表達(dá)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上存在相關(guān)性。

蘋(píng)果,機(jī)械冷藏,能量代謝,酶活,基因表達(dá)

蘋(píng)果(MalusdomesticaBorkh)屬于薔薇科蘋(píng)果屬,果實(shí)酸甜可口,富含礦物質(zhì)和維生素,是人們最常食用的水果之一。蘋(píng)果較水蜜桃等耐貯藏,但仍受采后迅速成熟、呼吸躍變等因素的制約。冷藏是目前果品保鮮中采用較廣泛且有效的技術(shù)手段之一。低溫能抑制果實(shí)的各種代謝活動(dòng),延緩果實(shí)后熟軟化,達(dá)到保鮮的目的[1-2]。

蘋(píng)果的成熟衰老是個(gè)復(fù)雜的過(guò)程,伴隨著一系列生理生化反應(yīng),如乙烯的生成、葉綠素和細(xì)胞壁的降解等,從而引起果實(shí)在質(zhì)地、風(fēng)味等方面的改變,這些反應(yīng)過(guò)程伴隨著能量水平的改變。能量水平與果實(shí)成熟衰老密切相關(guān),而國(guó)內(nèi)外對(duì)蘋(píng)果成熟衰老的諸多研究主要集中在品質(zhì)、生理生化和調(diào)節(jié)控制方面,其中專(zhuān)注于能量水平的研究相對(duì)缺乏。能量在細(xì)胞生命活動(dòng)中起樞紐作用,細(xì)胞需要足夠的能量來(lái)維持正常的代謝進(jìn)程,保持生長(zhǎng)、生物合成等重要的生理功能。研究發(fā)現(xiàn)ATP合成與膜脂降解之間存在相關(guān)性,能量代謝對(duì)細(xì)胞膜完整性起著重要的調(diào)節(jié)作用[3];能量虧損會(huì)促進(jìn)活性氧積累,破壞細(xì)胞膜完整性,從而導(dǎo)致果實(shí)衰老[4],因此維持能量供應(yīng)便能保證細(xì)胞膜完整性,進(jìn)而可延緩果實(shí)衰老。

蘋(píng)果酸是蘋(píng)果中主要的有機(jī)酸,NADP-蘋(píng)果酸酶(NADP-ME)是調(diào)控蘋(píng)果酸代謝的關(guān)鍵酶,可催化蘋(píng)果酸進(jìn)行氧化脫羧反應(yīng)。Liu等[5]研究了1-MCP處理對(duì)蘋(píng)果中有機(jī)酸代謝及NADP-ME活性的調(diào)控作用,證明NADP-ME有降解蘋(píng)果酸的作用。目前,NADP-ME活性的變化及基因表達(dá)情況是關(guān)注的重點(diǎn)。

本研究以‘長(zhǎng)富2’果實(shí)為試材,分析了冷藏期間果實(shí)能量水平和NADP-ME活性及其基因表達(dá)的變化情況,探索果實(shí)能量水平與果實(shí)成熟衰老的關(guān)系,從能量變化和分子層面為進(jìn)一步研究延緩果實(shí)衰老技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

‘長(zhǎng)富2’蘋(píng)果(MalusdomesticaBorkh.,cv. Changfu 2) 于2015年11月15日采收自江蘇省徐州市豐縣師寨果園,采摘后立即運(yùn)至大沙河果園冷庫(kù)在0～2 ℃預(yù)冷,挑選個(gè)體大小一致、無(wú)機(jī)械損傷、病蟲(chóng)害的果實(shí),套網(wǎng)袋裝入瓦楞紙箱內(nèi),于17日運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)處理。果實(shí)隨機(jī)分為四組(每組90個(gè)果實(shí)),每個(gè)蘋(píng)果套網(wǎng)袋放于瓦楞紙箱內(nèi),紙箱置于冷庫(kù)中。貯藏(1～4 ℃)條件下,分別于0、60、120、180 d隨機(jī)從各組取平行樣品3個(gè),每個(gè)平行30個(gè)果實(shí),進(jìn)行能量水平和NADP-ME基因表達(dá)相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定。果實(shí)去皮后取適量果肉,用液氮冷凍后存于-80 ℃待用。2,4-二硝基苯肼、三氯乙酸、高氯酸、磷酸鉀、異抗壞血酸、氫氧化鉀 分析純;甲醇、磷酸 色譜純;ATP、ADP、AMP標(biāo)品 上海源葉生物科技有限公司。

FHM-5 Fruits Hardness Tester Japan;PAL-1 Pocket Refractometer Japan;Agilent HPLC Series 1200 安捷倫科技有限公司;TGL16M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙維爾康湘鷹離心機(jī)有限公司;HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司;KQ-300DB數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;Alpha-1860A紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海譜元儀器有限公司;Bio-Rad CFX96 Real-Time PCR System USA。

1.2 測(cè)定方法

1.2.1 硬度和可溶性固形物含量的測(cè)定 用Fruits Hardness Tester(FHM-5,Japan)測(cè)定去皮果實(shí)硬度,下壓距離為5 mm,探頭直徑為5 mm,下壓速度為1 mm/s,重復(fù)取果測(cè)定10次,記錄數(shù)據(jù),取平均值。用Pocket Refractometer PAL-1(Japan)測(cè)定果實(shí)可溶性固形物含量,重復(fù)取果測(cè)定10次,取平均值。

1.2.2 丙酮酸和蘋(píng)果酸含量的測(cè)定 丙酮酸測(cè)定采用2,4-二硝基苯肼法。取2 g果肉,研磨后加入25 mL 8%三氯乙酸(TCA),靜置30 min后取10 mL研磨液8000 r/min離心15 min。試管中依次加入1 mL上清液,2 mL 8% TCA,1 mL 0.1%的2,4-二硝基苯肼溶液,5 mL 1.5 mol/L的NaOH,搖勻顯色。在520 nm波長(zhǎng)下比色,記錄吸光度。蘋(píng)果酸測(cè)定參考Zhang等采用HPLC法[6]。取2 g果肉,用8 mL超純水研磨成勻漿后轉(zhuǎn)入到10 mL離心管中,80 ℃水浴超聲1 h,冷卻后8000 r/min離心15 min,取5 mL上清液過(guò)濾到10 mL的容量瓶中,殘?jiān)尤? mL超純水再提取,再取5 mL上清液過(guò)濾,用超純水定容至刻度。用0.22 μm濾膜過(guò)濾待測(cè)。色譜條件為Kromasil C18反相柱(ODS,250 mm×4.6 mm),檢測(cè)波長(zhǎng)為214 nm,流動(dòng)相為甲醇和0.1%磷酸水(v∶v=2∶98),流速為1 mL/min,柱溫30 ℃。蘋(píng)果酸含量以mg/g表示。

1.2.3 NADP+和NADPH含量的測(cè)定 NADP+和NADPH含量均采用試劑盒(建成生物技術(shù)有限公司)測(cè)定。

1.2.4 三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、磷酸腺苷(AMP)和能荷(EC)的測(cè)定 參考Liu等[7]略作修改。取2 g果肉,研磨后加入6 mL 0.6 mol/L高氯酸冰浴1 min,8000 r/min、4 ℃離心10 min。上清液用1 mol/L KOH中和至pH6.5～6.8。冰浴30 min后8000 r/min、4 ℃離心20 min,取上清液定容至7 mL,用0.22 μm濾膜過(guò)濾待測(cè)。采用HPLC外標(biāo)法測(cè)定。所用儀器為Hitachi HPLC D-2000。色譜條件為C18柱(250 mm×4.6 mm),檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm,流動(dòng)相為甲醇(A)和0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液(pH7.0)(B)。線(xiàn)性梯度洗脫,時(shí)間為10 min,流速1 mL/min,柱溫20 ℃,流動(dòng)相A在第0、7、9、10 min所占比例分別是0、20%、25%、0,進(jìn)樣量20 μL。用ATP、ADP、AMP標(biāo)品配制不同濃度ATP、ADP、AMP溶液并作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),ATP、ADP、AMP保留時(shí)間分別為7.11、8.21、9.55 min。

EC=([ATP]+0.5[ADP])/([ATP]+[ADP]+[AMP])。

1.2.5 NADP-蘋(píng)果酸酶(NADP-ME)和琥珀酸脫氫酶(SDH)酶活性的測(cè)定 參考郭潤(rùn)姿等[8],史娟等[9]的方法測(cè)定NADP-ME活性。取2 g研磨好的樣品,加入6 mL 預(yù)冷的研磨緩沖液(0.2 mol/L Tris-HCl,pH 8.2,0.6 mol/L蔗糖,10 mmol/L異抗壞血酸),在4 ℃ 4000×g下離心 20 min,取上清液5 mL用提取緩沖液(0.2 mol/L Tris-HCl,pH 8.2,10 mmol/L異抗壞血酸,0.1% Triton X-100)定容到10 mL,取其中6 mL加入等體積的提取緩沖液,混勻待測(cè)。反應(yīng)體系為3 mL(0.8 mol/L Tris-HCl,4 mmol/L MnSO4,3.4 mol/L NADP,4 mmol/L蘋(píng)果酸及待測(cè)液),加入反應(yīng)底物(蘋(píng)果酸)后立即用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定吸光度變化,記錄3 min,以每分鐘吸光度變化0.01為一個(gè)酶活單位U。SDH活性用SDH試劑盒(建成生物技術(shù)有限公司)測(cè)定。

表1 ‘長(zhǎng)富2’蘋(píng)果果實(shí)NADP-ME基因熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequence of NADP-ME genes for RT-qPCR in ‘Changfu 2’ fruit

1.2.6 蘋(píng)果果實(shí)總RNA提取及Real-time熒光定量PCR檢測(cè) 蘋(píng)果果實(shí)總RNA用多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(TIANGEN,China)提取,用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度、A260/A280,并進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳,檢測(cè)RNA質(zhì)量和完整性。RNA質(zhì)量穩(wěn)定后用PrimeSciptTM RT Master Mix試劑盒(TaKaRa,Japan)去除DNA雜質(zhì)并合成cDNA。在蘋(píng)果基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.rosaceae.org/search/features)中搜索并篩選得到MDP0000132833、MDP0000285941、MDP0000376988三個(gè)cDNA序列。參考董慶龍等[10]并結(jié)合premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物(表1),選TUB為內(nèi)參基因。熒光定量PCR包括95 ℃預(yù)變性30 s,95 ℃變性3 s和60 ℃復(fù)性延伸1 min組成的40個(gè)循環(huán)。所用儀器為Real-Time PCR System(Bio-Rad CFX96,USA),所有PCR反應(yīng)均設(shè)3次平行管重復(fù)。PCR反應(yīng)總體系(20.0 μL)為:cDNA模板1.0 μL,SYBR?Premix Ex TaqTM(2×)10.0 μL,上、下游引物各0.8 μL,水7.4 μL。用2-ΔΔCT法對(duì)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel及SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SE)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 硬度和可溶性固形物含量

圖1 冷藏期間‘長(zhǎng)富2’蘋(píng)果果實(shí)硬度和可溶性固形物含量的變化Fig.1 Change of firmness and TSS content in ‘Changfu 2’ apple fruit during storage

硬度和可溶性固形物是果實(shí)成熟衰老過(guò)程中表現(xiàn)果實(shí)品質(zhì)的重要指標(biāo)。圖1顯示,‘長(zhǎng)富2’果實(shí)在整個(gè)冷藏期間呈現(xiàn)較高的硬度,并且隨貯藏時(shí)間的增加呈下降趨勢(shì),由貯藏初期的7 kg/cm2(0 d)降至4 kg/cm2(180 d)。硬度在冷藏前120 d下降較為緩慢,后期急劇下降,由此推測(cè)果實(shí)在120 d后進(jìn)入急劇衰老期。果實(shí)可溶性固形物含量則呈先上升后下降的趨勢(shì),由14.6%(0 d)增加至15%(60 d),隨后下降至13.9%(180 d),這可能由于果實(shí)成熟初期淀粉降解導(dǎo)致還原糖含量上升,而后期還原糖被消耗有關(guān)。

2.2 丙酮酸和蘋(píng)果酸含量

圖2顯示,冷藏期間‘長(zhǎng)富2’果實(shí)丙酮酸含量在前60 d保持基本不變,而后快速增加,貯藏180 d時(shí)達(dá)到貯藏初期的3.9倍。王翠華等[11]研究證明菌體在能荷下降時(shí)丙酮酸大量合成,由此推測(cè)貯藏后期丙酮酸含量急劇增加與后期能量代謝加快,能量虧損有關(guān)。蘋(píng)果酸作為三羧酸循環(huán)產(chǎn)能過(guò)程中重要的中間物質(zhì),其含量與能量水平的變化密切相關(guān)。蘋(píng)果酸含量在冷藏期間呈下降趨勢(shì),貯藏前120 d表現(xiàn)尤其顯著,至貯藏結(jié)束時(shí)蘋(píng)果酸含量下降了41.6%。蘋(píng)果酸的減少與其作為呼吸底物被消耗有關(guān),進(jìn)而可影響果實(shí)風(fēng)味變化。

圖2 冷藏期間‘長(zhǎng)富2’蘋(píng)果果實(shí)丙酮酸和蘋(píng)果酸含量的變化Fig.2 Change of pyruvate and malate content in ‘Changfu 2’ apple fruit during storage

2.3 NADP+和NADPH含量

NADP+和NADPH可傳遞電子,參與生物體內(nèi)的氧化還原反應(yīng),對(duì)生物體內(nèi)各種代謝活動(dòng)起調(diào)節(jié)作用[12]。NADPH可參與清除破壞膜結(jié)構(gòu)的自由基[12],保持細(xì)胞膜完整性以延緩果實(shí)衰老。圖3顯示,機(jī)械冷藏期間‘長(zhǎng)富2’果實(shí)NADP+和NADPH含量均呈先上升后下降趨勢(shì),變化表現(xiàn)出同步和一致性。NADP+和NADPH含量最高值均出現(xiàn)在120 d,最高值分別可達(dá)19 nmol/g組織和31 nmol/g組織,比0 d時(shí)分別增加了450%和219%。貯藏120 d后果實(shí)NADP+和NADPH含量減少,這可能是因?yàn)橘A藏后期果實(shí)代謝減慢,品質(zhì)下降。

圖3 冷藏期間‘長(zhǎng)富2’蘋(píng)果果實(shí)NADP+和NADPH含量的變化Fig.3 Change of NADP+ and NADPH content in ‘Changfu 2’ apple fruit during storage

2.4 ATP、ADP、AMP含量和能荷的變化

腺苷酸(ATP、ADP、AMP)是生物體重要的供能系統(tǒng),與許多生物反應(yīng)相偶聯(lián),能量虧損會(huì)造成果實(shí)代謝功能紊亂,導(dǎo)致不可逆轉(zhuǎn)損傷[13-14]。圖4顯示,冷藏期間‘長(zhǎng)富2’果實(shí)ATP含量在貯藏前60 d下降而后至120 d恢復(fù)到貯藏初期水平隨后又有所下降,呈現(xiàn)波動(dòng)性變化。冷藏前期低溫減弱呼吸作用,降低整個(gè)代謝速率,導(dǎo)致ATP生成量少,中后期果實(shí)進(jìn)一步成熟衰老,對(duì)ATP的需求促進(jìn)了其積累,含量上升。與此對(duì)比,果實(shí)ADP、AMP含量在貯藏前60 d內(nèi)先有一定幅度的下降而后顯著上升。貯藏前期新陳代謝旺盛,需要ADP、AMP生成ATP,貯藏后期果實(shí)進(jìn)入衰老期,能量虧損,ATP降解形成ADP、AMP。果實(shí)能荷在冷藏前120 d一直保持在較高水平,120 d后急劇下降,果實(shí)的衰老裂變與能量水平密切相關(guān),且能荷表示細(xì)胞中腺苷酸系統(tǒng)的能量狀態(tài)[12],因此能荷的這種變化可能與冷藏后期果實(shí)能量虧損,機(jī)體衰老有關(guān)。

圖4 冷藏期間‘長(zhǎng)富2’蘋(píng)果果實(shí)ATP、ADP、AMP含量和能荷的變化Fig.4 Change of ATP,ADP and AMP content and energy charge in ‘Changfu 2’ apple fruit during storage

2.5 NADP-ME和SDH活性

圖5顯示,冷藏期間‘長(zhǎng)富2’果實(shí)NADP-ME和SDH活性均呈顯著下降變化。NADP-ME活性在冷藏前120 d下降較緩慢,120 d后迅速下降,與蘋(píng)果酸含量出現(xiàn)相反的變化,表明NADP-ME起著降解蘋(píng)果酸的作用,且與能荷在冷藏前120 d保持較高水平,120 d后迅速下降變化相似。線(xiàn)粒體是細(xì)胞能量代謝和物質(zhì)轉(zhuǎn)化的中樞,是ATP產(chǎn)生的重要場(chǎng)所[4],而SDH是線(xiàn)粒體內(nèi)呼吸代謝關(guān)鍵酶,其活性下降會(huì)造成線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)和功能破壞,影響能量生成。貯藏結(jié)束時(shí),與0 d相比，NADP-ME酶活下降了3000 U,琥珀酸脫氫酶(SDH)下降了3500 (U/mg prot)之多,如此大的酶活變化提示‘長(zhǎng)富2’果實(shí)有機(jī)酸代謝速率和能量水平發(fā)生了顯著變化。另外,需要注意的是‘長(zhǎng)富2’蘋(píng)果果實(shí)中NADP-ME和SDH兩種酶活性呈同步性快速下降,提示果實(shí)成熟期間能量代謝速率發(fā)生了顯著變化。

圖5 冷藏期間‘長(zhǎng)富2’蘋(píng)果果實(shí)NADP-蘋(píng)果酸酶(NADP-ME)和琥珀酸脫氫酶(SDH)活性的變化Fig.5 Changes of activities of NADP-ME and SDH in ‘Changfu 2’ apple fruit during storage

2.6 MdcyME基因表達(dá)

高等植物中編碼NADP-ME的基因不是唯一的,而是由多個(gè)基因組成的小基因家族編碼[10]。圖6顯示,冷藏期間MdcyME2和MdcyME3的相對(duì)表達(dá)量均呈先上升后下降的趨勢(shì),且均在貯藏60 d達(dá)到最大表達(dá)量,表現(xiàn)出同步性,而MdcyME1表達(dá)量呈整體上升趨勢(shì)。MdcyME1相對(duì)表達(dá)量在貯藏60 d時(shí)可達(dá)0 d的1.8倍,且在貯藏后期也有1.46倍以上的表達(dá)量,而MdcyME2相對(duì)表達(dá)量在貯藏60 d時(shí)達(dá)到0 d的1.3倍,在貯藏后期降至0.5倍以下,基本不表達(dá)。MdcyME3在整個(gè)貯藏前4個(gè)月內(nèi)表達(dá)量較高,可達(dá)0 d的3倍左右,但貯藏后期迅速下降,低至0.28倍,波動(dòng)性較大。冷藏后期,NADP-ME活性持續(xù)下降,與MdcyME2和MdcyME3變化一致。以上結(jié)果表明MdcyME1-MdcyME3對(duì)NADP-ME的合成起重要作用,并不是合成NADP-ME的關(guān)鍵基因,且其表達(dá)具有階段性。

圖6 冷藏期間‘長(zhǎng)富2’蘋(píng)果果實(shí)中MdcyME基因表達(dá)的變化Fig.6 Change of gene expression of MdcyME in ‘Changfu 2’ apple fruit during storage

2.7 蘋(píng)果果實(shí)能量水平與NADP-ME活性及其基因表達(dá)的相關(guān)性分析

對(duì)能量水平相關(guān)指標(biāo)和NADP-ME活性及基因表達(dá)作相關(guān)性分析(表2)。ADP、AMP與NADP-ME活性呈顯著負(fù)相關(guān),能荷與NADP-ME活性呈極顯著正相關(guān),表明能量水平與NADP-ME相關(guān);而ATP、NADP+、NADPH與NADP-ME活性無(wú)明顯相關(guān)關(guān)系,這可能與NADP-ME并不直接參與能量代謝有關(guān),其具體機(jī)理還有待研究。ATP與MdcyME1呈顯著負(fù)相關(guān),NADP+、NADPH與MdcyME1則呈顯著正相關(guān)關(guān)系;ADP、能荷與MdcyME2呈顯著正相關(guān),AMP則與MdcyME2呈顯著負(fù)相關(guān);ADP、AMP與MdcyME3呈顯著負(fù)相關(guān),而能荷、NADPH與MdcyME3則呈極顯著正相關(guān)。以上結(jié)果表明能量水平(ATP、ADP和AMP)與NADP-ME活性及基因表達(dá)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上存在相關(guān)性,其具體代謝相關(guān)性還有待深入研究。

表2 蘋(píng)果果實(shí)能量水平相關(guān)指標(biāo)與NADP-ME活性及其基因表達(dá)的相關(guān)系數(shù)Table 2 Correlation analysis between indexes associated with energy level and activities and gene expression of NADP-ME in apple fruit

注:*表示在0.05水平上顯著相關(guān),**表示在0.01水平上極顯著相關(guān)。

3 討論與結(jié)論

果實(shí)成熟衰老期間能量水平發(fā)生明顯變化。本研究中,蘋(píng)果果實(shí)冷藏后期能荷急劇下降,果實(shí)能量虧損,品質(zhì)下降,表明果實(shí)成熟衰老與能量狀況相關(guān)。ATP含量冷藏前期下降后期上升,與冷藏期間荔枝果實(shí)ATP含量持續(xù)下降[15]存在差異,這可能與果實(shí)種類(lèi)、貯藏時(shí)間長(zhǎng)短等不同有關(guān)。蘋(píng)果整個(gè)180 d冷藏期間,ATP、ADP、AMP、蘋(píng)果酸和NADP(H)的含量變化表明果實(shí)能量水平降低,這可能與果實(shí)硬度和可溶性固形物含量下降,果實(shí)品質(zhì)降低有關(guān)。研究表明,能量對(duì)維持細(xì)胞膜完整性具有非常重要的作用,能量虧損會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜系統(tǒng)損傷[16],從而導(dǎo)致果實(shí)衰老[4],因此維持能量供應(yīng)便能保證細(xì)胞膜完整性,進(jìn)而可延緩果實(shí)衰老。由此可從維持果實(shí)能量水平方面研究果實(shí)保鮮的方法。

NADP-ME是與能量和碳水化合物代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)[17],對(duì)保持細(xì)胞滲透勢(shì)、pH等有重要作用。本研究中,蘋(píng)果果實(shí)NADP-ME活性在冷藏前期下降緩慢后期迅速下降,而能荷在冷藏前期保持較高水平而后期亦迅速下降,二者存在一定的相關(guān)性,表明前期較高的能量水平可能能夠延緩NADP-ME活性的下降,至于其具體代謝相關(guān)性和影響機(jī)理還有待研究。另外,NADP-ME降解蘋(píng)果酸的同時(shí)產(chǎn)生NADPH,使得NADPH不斷積累,以清除破壞膜結(jié)構(gòu)的自由基,從而對(duì)延緩果實(shí)成熟衰老有一定作用。本研究中,蘋(píng)果果實(shí)NADP-ME和SDH活性呈同步的快速下降,表明蘋(píng)果果實(shí)成熟期間能量代謝速率發(fā)生了明顯變化,這可能是因?yàn)楣麑?shí)貯藏期間線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)遭到了破壞[18],影響了能量生成效率。由此可為從提高NADP-ME和SDH活性方面探索延緩果實(shí)成熟衰老的方法提供理論依據(jù)。MdcyME1-MdcyME3在合成NADP-ME過(guò)程中起著重要作用,低溫可誘導(dǎo)NADP-ME基因表達(dá),產(chǎn)生新NADP-ME維持膜的流動(dòng)性,以保證細(xì)胞各項(xiàng)代謝活動(dòng)正常進(jìn)行[19]。MdcyME2和MdcyME3表達(dá)量呈先上升后下降趨勢(shì),這可能是由于其貯藏前期受到低溫誘導(dǎo)而后期果實(shí)進(jìn)入衰老期,并且這與蘋(píng)果果實(shí)能荷變化相似,由此推測(cè)蘋(píng)果果實(shí)較高的能量水平可能有利于NADP-ME的基因表達(dá),其具體影響機(jī)理還有待研究。

本研究結(jié)果顯示,6個(gè)月的冷藏期間,‘長(zhǎng)富2’果實(shí)蘋(píng)果酸持續(xù)減少、丙酮酸后期大量累積,貯藏中后期ADP和AMP增加而后期能荷急劇下降,NADP+和NADPH含量呈先上升后下降趨勢(shì),NADP-ME和SDH兩種酶的活性亦同步快速降低,提示果實(shí)貯藏期間能量水平和利用效率發(fā)生變化,且與NADP-ME活性和其基因表達(dá)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上存在一定的相關(guān)性,推測(cè)前期較高的能量水平可延緩NADP-ME活性的下降和保持NADP-ME的基因表達(dá),有利于保持果實(shí)品質(zhì)。

[1]Wei J,Qi X,Guan J,et al. Effect of cold storage and 1-MCP treatment on postharvest changes of fruit quality and cell wall metabolism in sweet cherry[J]. Journal of Food,Agriculture & Environment,2011,9(3&4):118-122.

[2]李琛,劉穎,翁楨,等. 貯運(yùn)環(huán)境對(duì)葡萄品質(zhì)的影響[J]. 現(xiàn)代食品科技,2013,29(2):230-235.

[3]Rawyler A,Pavelic D,Gianinazzi C,et al. Membrane lipid integrity relies on a threshold of ATP production rate in potato cell cultures submitted to anoxia[J]. Plant Physiology,1999,120(1):293-300.

[4]Yi C,Qu H,Jiang Y,et al. ATP-induced changes in energy status and membrane integrity of harvested litchi fruit and its relation to pathogen resistance[J]. Journal of Phytopathology,2008,156(6):365-371.

[5]Liu R,Wang Y,Qin G,et al. Molecular basis of 1-methylcyclopropene regulating organic acid metabolism in apple fruit during storage[J]. Postharvest Biology and Technology,2016,117:57-63.

[6]Zhang Y,Li P,Cheng L. Developmental changes of carbohydrates,organic acids,amino acids,and phenolic compounds in ‘Honeycrisp’apple flesh[J]. Food Chemistry,2010,123(4):1013-1018.

[7]Liu H,Jiang Y,Luo Y,et al. A simple and rapid determination of ATP,ADP and AMP concentrations in pericarp tissue of litchi fruit by high performance liquid chromatography[J]. FoodTechnology and Biotechnology,2006,44(4):531-534.

[8]郭潤(rùn)姿. 不同處理對(duì)采后黃冠梨果實(shí)有機(jī)酸代謝酶及其基因表達(dá)的影響[D]. 天津:天津大學(xué),2012.

[9]史娟,李方方,馬宏,等. 不同中間砧對(duì)蘋(píng)果果實(shí)蘋(píng)果酸代謝關(guān)鍵酶活性及其相關(guān)基因表達(dá)的影響[J]. 園藝學(xué)報(bào),2016(1):132-140.

[10]董慶龍,王海榮,安淼,等. 蘋(píng)果NADP依賴(lài)的蘋(píng)果酸酶基因克隆,序列和表達(dá)分析[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,46(9):1857-1866.

[11]王翠華,李友元,陳長(zhǎng)華,等. Torulopsis glabrata 620在丙酮酸生物合成中的能荷變化和氧化-還原態(tài)趨勢(shì)[J]. 華東理工大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2006,32(5):552-555.

[12]李輝,林毅雄,林河通,等. 1-MCP延緩采后‘油木奈’果實(shí)衰老及其與能量代謝的關(guān)系[J]. 現(xiàn)代食品科技,2015(4):121-127.

[13]陽(yáng)小成,王伯初. 機(jī)械振蕩對(duì)獼猴桃愈傷組織ATP含量的影響[J]. 生物技術(shù)通訊,2003(5):393-395.

[14]Jiang Y,Jiang Y,Qu H,et al. Energy aspects in ripening and senescence of harvested horticultural crops[J]. Stewart Postharvest Review,2007,3(2):1-5.

[15]Liu H,Song L,You Y,et al. Cold storage duration affects litchi fruit quality,membrane permeability,enzyme activities and energy charge during shelf time at ambient temperature[J]. Postharvest Biology and Technology,2011,60(1):24-30.

[16]陳蓮,陳夢(mèng)茵,林河通,等. 解偶聯(lián)劑DNP處理對(duì)采后龍眼果實(shí)果皮褐變和活性氧代謝的影響[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,42(11):4019-4026.

[17]Shi Y,Jiang L,Zhang L,et al. Dynamic changes in proteins during apple(Malus x domestica)fruit ripening and storage[J]. Horticulture Research,2014,1(6):1-21.

[18]闞娟,王紅梅,金昌海,等. 桃果實(shí)成熟過(guò)程中活性氧和線(xiàn)粒體呼吸代謝相關(guān)酶的變化[J]. 食品科學(xué),2009(8):275-279.

[19]劉增輝,邵宏波,初立業(yè),等. 干旱,鹽,溫度對(duì)植物體NADP-蘋(píng)果酸酶的影響與機(jī)理[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào),2009,30(2):3334-3339.

Change of energy level and gene expression of NADP-dependent malic enzyme in apple fruit during refrigerated storage

KONG Jing,YI Mei-jun,XU Xin,JIANG Li,YU Zhi-fang*

(College of Food & Technology,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China)

In order to investigate the change of energy level and gene expression of NADP-dependent malic enzyme during storage,‘Changfu 2’ apple fruits were taken as experimental material. Fruit firmness,total soluble solid(TSS),the activity of NADP-dependent malic enzyme(NADP-ME)and SDH,contents of ATP,ADP,AMP and energy charge were determined during storage. The results showed that the ATP content in apple fruit during storage period declined for the first 60 days thereafter recovering to storage beginning level,while the ADP and AMP content in fruit declined slightly for the first 60 days thereafter increased significantly. Both activities of NADP-ME and SDH declined gradually during whole storage period. The content of NADP+and NADPH in apple fruit performed similar trend with the energy charge that all increased obviously for the first 120 days then declined in the last 60 days. Although there was some difference on the time course,the gene expression of MdcyME1-MdcyME3 performed similar trend that they all increased during the early storage and then declined. These results demonstrated the energy levels and efficiency in apple fruits changed during storage and energy level has relevance with the activities and gene expression of NADP-ME.

apple;refrigerated storage;energy metabolism;enzyme activity;gene expression

2016-12-02

孔靜(1991-),女,碩士,研究方向:采后生物學(xué),E-mail:kongjingfly@163.com。

*通訊作者:郁志芳(1960-),男,博士,教授,研究方向:采后生物學(xué),E-mail:yuzhifang@njau.edu.cn。

江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項(xiàng)目(CX(15)1022);江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(2015022)。

TS255.1

A

1002-0306(2017)11-0329-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.11.055