邵圣娟,衛(wèi)靜莉

(太原工業(yè)學(xué)院 化學(xué)與化工系,山西太原 030008)

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聚乙二醇-硫酸銨雙水相體系萃取松花粉中總黃酮的工藝研究

邵圣娟,衛(wèi)靜莉

(太原工業(yè)學(xué)院 化學(xué)與化工系,山西太原 030008)

采用聚乙二醇-硫酸銨雙水相體系萃取純化松花粉中的總黃酮,確定雙水相體系組成為26% PEG400-20%(NH4)2SO4,以萃取率和分配系數(shù)為指標(biāo),考察pH、溫度和NaCl添加量對雙水相萃取分配行為的影響,并結(jié)合正交實驗優(yōu)化萃取工藝參數(shù)。確定最佳萃取工藝條件為NaCl添加量為2.0%、pH4、溫度為40 ℃,在此條件下松花粉總黃酮萃取率達(dá)到98.93%,其中NaCl添加量對于萃取分配行為的影響最大。此方法操作簡便,水環(huán)境溫和,分相時間短、萃取率較高,是松花粉總黃酮等天然活性產(chǎn)物分離純化的一種有效方法。

雙水相體系,分配系數(shù),萃取率,黃酮類化合物,松花粉

松花粉作為藥食兼用的花粉品種,含有豐富的營養(yǎng)成分和生物活性物質(zhì),對于腦血管疾病、糖尿病、肝損傷、神經(jīng)衰弱等方面具有一定的療效,同時還具有提高人體免疫力、美容養(yǎng)顏、抗衰老等功效[1]。

研究表明每1 g松花粉含有17.6 mg黃酮類化合物[2],其主要成分為黃酮和黃酮醇類[3],使松花粉表現(xiàn)為明顯的抗氧化、抗衰老、降血糖、保肝護(hù)肝等藥理作用。

雙水相萃取技術(shù)(Aqueous Two-phase Extraction,ATPE)利用物質(zhì)在以聚合物水溶液和鹽溶液組成的互不相溶的兩水相間分配系數(shù)的不同而達(dá)到萃取效果[4]。以聚合物和無機(jī)鹽溶液組成的雙水相體系,具有萃取條件溫和、成相穩(wěn)定、時間短,選擇性高、易于放大和操作簡便等優(yōu)點,特別適用于生物活性物質(zhì)、天然產(chǎn)物的提純和分離,如酶[5]、多糖[6]、色素[7]、多酚[8-9]、黃酮類[10-11]等。

本實驗主要研究PEG400/(NH4)2SO4雙水相體系對于松花粉總黃酮的萃取分配行為,考察雙水相組成、pH、溫度、NaCl添加量等因素對于松花粉總黃酮萃取率的影響,以期為松花粉總黃酮的分離純化提供新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

馬尾松花粉PinusmassonianaLamb.(40目) 云南省藥材市場;蘆丁對照品(純度>98%) 中國藥品生物制品檢定所;無水乙醇、PEG400、(NH4)2SO4、NaOH、NaNO2、Al(NO3)3、NaCl、檸檬酸、磷酸氫二鈉 天津市北辰方正試劑公司。

722s型可見分光光度計 上海棱光技術(shù)有限公司;WBFY-205型微波化學(xué)反應(yīng)器 天津科諾儀器設(shè)備有限公司;TGL20-B離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;HH-1恒溫水浴鍋 金壇市雙捷實驗儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 松花粉總黃酮的粗提取 準(zhǔn)確稱取10 g松花粉粉末,按料液比1∶25(g/mL)加入體積分?jǐn)?shù)80%乙醇溶液,450 W微波處理5 min,將提取液于5000 r/min條件下,離心處理10 min。將離心后的上清液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,濃縮液用60%乙醇定容至50 mL容量瓶中。濃縮液質(zhì)量濃度記為C0,將濃縮液配制成不同的濃度,備用。

1.2.2 雙水相相圖繪制 采用濁點滴定法[12]繪制PEG400-(NH4)2SO4雙水相體系相圖。操作方法如下:稱取2.0 g質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%的PEG400溶液于50 mL比色管中,逐滴加入40%(NH4)2SO4溶液,使體系出現(xiàn)渾濁,記錄(NH4)2SO4的滴加量;再滴加去離子水至體系完全澄清,記錄所加水的質(zhì)量,重復(fù)上述兩步直至體系不再發(fā)生渾濁;計算各個濁點時PEG400和(NH4)2SO4的質(zhì)量濃度,繪制 PEG400-(NH4)2SO4雙水相體系相圖。

1.2.3 單因素分配實驗 在50 mL離心管中加入松花粉總黃酮粗提液2 mL和一定量的(NH4)2SO4、PEG400溶液,調(diào)節(jié)適宜的pH,保證雙水相體系總量為10 g,充分混勻后以2000 r/min離心處理5 min,精確讀取上、下相體積,并分別移取1 mL上、下相溶液,測定兩相中松花粉總黃酮含量,計算相應(yīng)的分配系數(shù)K和萃取率Y。

式中:R為相比,Vt為上相體積,mL,Vb為下相體積,mL;Ct為上相黃酮的質(zhì)量濃度(mg/mL),Cb為下相黃酮的質(zhì)量濃度(mg/mL)。

1.2.4 正交實驗 根據(jù)單因素實驗結(jié)果,以分配系數(shù)K、萃取率Y為實驗指標(biāo),設(shè)計NaCl添加量、pH、溫度三因素三水平正交實驗,對萃取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。

表1 L9(34)正交實驗因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.5 微波輔助雙水相萃取 稱取1 g松花粉粉末,按料液比1∶25 (g/mL)加入26% PEG400、20%(NH4)2SO4組成的雙水相體系中,在微波條件下直接萃取松花粉中的總黃酮,計算總黃酮的得率,并與微波乙醇法進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 松花粉總黃酮含量的測定

以蘆丁為對照品,采用“NaNO2-Al(NO3)3-NaOH”[13]絡(luò)合顯色分光光度法測定,得出蘆丁質(zhì)量濃度C(mg/mL)與吸光度A之間的線性回歸方程為:A=9.6036C+0.0093,R2=0.9992。

2.2 雙水相相圖

PEG400-(NH4)2SO4雙水相相圖如圖1所示,由雙水相相圖可知,曲線下方為單相區(qū),曲線上的點為成相臨界點,上方則為兩相區(qū)。在兩相區(qū),當(dāng)(NH4)2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%,可與之形成雙水相體系的PEG400的質(zhì)量分?jǐn)?shù)需大于17%。此實驗結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)[14]結(jié)果基本一致。當(dāng)PEG400的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%時,(NH4)2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)需大于18%才可與之可形成雙水相體系。因此,應(yīng)選取偏離臨界點的適宜數(shù)值,才易于形成雙水相體系。

圖1 雙水相相圖Fig.1 PEG400/(NH4)2SO4 aqueous two-phase system phase diagram

2.3 雙水相體系的組成

2.3.1 PEG400質(zhì)量分?jǐn)?shù)對雙水相萃取效果的影響 測定結(jié)果如圖2。

圖2 PEG400質(zhì)量分?jǐn)?shù)對雙水相萃取效果的影響Fig.2 Effect of mass fraction of PEG400 on partition ratio and extraction rate

隨著PEG400 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加,上相體積逐漸增加,下相體積逐漸減少,兩相相比R逐漸增大,上相中總黃酮的濃度也逐漸增大,分配系數(shù)K和萃取率Y逐漸增大,與文獻(xiàn)[14]結(jié)果一致。主要是由于隨著上相PEG400質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加,上相水合能力增大,使得上相體積增加,而且利于黃酮在上相的富集,使得上相中總黃酮的濃度也提高,從而分配系數(shù)和萃取率都提高。當(dāng)PEG400 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為26%時,均達(dá)到最大值;當(dāng)PEG400質(zhì)量分?jǐn)?shù)繼續(xù)增大時,雙水相體系黏度逐漸增大,阻礙了相際間的分子轉(zhuǎn)移,不利于傳質(zhì),導(dǎo)致分配系數(shù)下降,影響萃取率,與文獻(xiàn)[15]結(jié)果基本一致。因此,選擇PEG400的最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)為26%。

2.3.2 (NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對雙水相萃取效果的影響 測定結(jié)果如圖3。

圖3 (NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對雙水相萃取效果的影響Fig.3 Effect of mass fraction of(NH4)2SO4on partition ratio and extraction rate

隨著(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加,分配系數(shù)和萃取率逐漸上升,當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到20%時出現(xiàn)下降趨勢。這是因為隨著(NH4)2SO4用量的增加,下相水合能力增強(qiáng),體積增加,而上相體積減小,上相中PEG400相對濃度增加,對黃酮的分配系數(shù)增大,表現(xiàn)為萃取率也增大。但當(dāng)(NH4)2SO4用量繼續(xù)增加,雙水相體系極性增加,使黃酮及水溶性雜質(zhì)主要存在于下相,相應(yīng)分配系數(shù)減小,相比R也減小,造成萃取率急劇下降,不利于黃酮萃取,與文獻(xiàn)[16]結(jié)果基本一致。因此(NH4)2SO4最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%。

2.4 各單因素對雙水相體系萃取的影響

2.4.1 pH對雙水相萃取效果的影響 體系的pH不同,對于溶液中離子的存在形式、電性產(chǎn)生影響,相間電位差發(fā)生變化,從而影響黃酮在兩相間的分配系數(shù)[17]。

對于PEG400-(NH4)2SO4體系,當(dāng)pH>7.0時,(NH4)2SO4發(fā)生水解,放出氨氣,故調(diào)節(jié)雙水相體系pH為2.2～7.0,考察酸性溶液環(huán)境對雙水相萃取效果的影響,測定結(jié)果如圖4。當(dāng)pH<4.0時,松花粉黃酮吸附氫離子帶正電荷,逐漸向電位為負(fù)的下相富集,體系pH愈小,下相黃酮濃度增加,使得分配系數(shù)減小;當(dāng)pH>4.0時,上相體積增加,相比增大,但是上相PEG相對濃度減小,不利于黃酮的富集,而且隨著體系pH接近于7,體系的相間電位差逐漸減小,相間傳質(zhì)減弱,分配系數(shù)和萃取率都逐漸下降,但萃取率下降緩慢,因此,可選擇pH4.0為適宜的pH條件。

圖4 pH對雙水相萃取效果的影響Fig.4 Effect of pH on partition ratio and extraction rate

2.4.2 NaCl的添加量對雙水相萃取效果的影響 對于雙水相體系,當(dāng)添加NaCl等中性鹽電解質(zhì)時,其電解離子在兩相中的不均衡分配會影響該體系的相電位差,或者改變體系溶質(zhì)的靜電荷數(shù),從而影響溶質(zhì)在兩相中的分配系數(shù)[18]。

由圖5可以看出,隨著NaCl添加量的增加,分配系數(shù)和萃取率的變化基本同步,出現(xiàn)了先增大后減小的趨勢。當(dāng)較少量的NaCl加入時,隨著電解離子在兩相間的不均衡分配,使兩相之間的電位差增大,分相加速,黃酮更好的萃取到了上相中,分配系數(shù)和萃取率都呈現(xiàn)上升趨勢;但是當(dāng)加入的NaCl量繼續(xù)增多,鹽濃度超過2%時,雙水相極性增強(qiáng),出現(xiàn)鹽析現(xiàn)象,松花粉黃酮的溶解度變小,從而使分配系數(shù)和萃取率都急劇降低,與相關(guān)文獻(xiàn)[19]結(jié)論一致。因此,NaCl添加量適宜選擇2%。

圖5 NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對雙水相萃取效果的影響Fig.5 Effect of mass fraction of NaCl on partition ratio and extraction rate

2.4.3 溫度對雙水相萃取效果的影響 由圖6可以得出,體系溫度在40 ℃左右時,表現(xiàn)為較高的分配系數(shù)和萃取率。隨著溫度的升高,溶質(zhì)擴(kuò)散速度加快,提高了黃酮在兩相間的分配效率,較短時間內(nèi)實現(xiàn)傳質(zhì)平衡,表現(xiàn)為上相體積減小,PEG和黃酮相對濃度增大,K值急劇上升,萃取率相應(yīng)提高,當(dāng)分配系數(shù)上升至60時,萃取率達(dá)到了98%以上;但溫度繼續(xù)升高時,PEG在下相中的溶解度也增大,造成黃酮分配系數(shù)和萃取率的下降,與文獻(xiàn)結(jié)論基本一致[20]。因此,適合萃取松花粉黃酮的溫度為40 ℃左右。

圖6 溫度對雙水相萃取效果的影響Fig.6 Effect of temperature on partition ratio and extraction rate

表4 兩種提取方法的比較Table 4 Comparison of two extraction methods

2.5 正交實驗結(jié)果

以分配系數(shù)K、萃取率Y為實驗指標(biāo),分別對正交實驗結(jié)果進(jìn)行極差、方差分析,實驗結(jié)果見表2、表3。

表2 正交實驗直觀分析結(jié)果Table 2 Results and analysis of orthogonal test

表3 方差分析表Table 3 Variance analysis of orthogonal test

對于PEG400-(NH4)2SO4雙水相體系萃取純化松花粉總黃酮,由極差R值分析得出,各因素對于分配系數(shù)K的影響先后次序為A>B>C,即NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)>pH>溫度,同時各因素對于黃酮萃取率Y的影響先后次序亦為A>B>C,兩者一致。同時方差分析結(jié)果顯示NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對分配系數(shù)和總黃酮萃取率的影響作用均表現(xiàn)出顯著性(p<0.05),而溫度和pH的影響作用不顯著,與對應(yīng)極差分析結(jié)果一致;綜合分配系數(shù)和萃取率兩指標(biāo),根據(jù)均值k及k′的大小,得出最佳萃取工藝條件為A2B2C2,即雙水相體系pH4、溫度為40 ℃、NaCl添加量為2.0%。

在此條件下,進(jìn)行3次重復(fù)驗證實驗,其分配系數(shù)分別為K1=69.86、K2=93.70、K3=102.10;萃取率分別為Y1=98.69、Y2=99.02、Y3=99.10,平均分配系數(shù)K=88.55、萃取率為98.93%。

2.6 微波輔助雙水相萃取

微波輔助雙水相萃取法與微波乙醇提取法實驗結(jié)果見表4。

由表4可知,微波輔助雙水相直接萃取松花粉中的總黃酮,相較于微波乙醇法,其得率提高了120%,PEG400-(NH4)2SO4雙水相環(huán)境促使黃酮更好的富集到了上相中,達(dá)到了很好的萃取效果。

3 結(jié)論

采用PEG400-(NH4)2SO4雙水相體系萃取純化松花粉中的總黃酮,其雙水相體系組成為26%PEG400-20%(NH4)2SO4,各因素對于萃取分配行為的影響程度依次為NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)>pH>溫度。最佳萃取工藝條件為NaCl添加量為2.0%、pH4、溫度為40 ℃,此條件下分配系數(shù)K=88.55,萃取率Y=98.93%。此外,微波輔助雙水相直接萃取松花粉中的總黃酮,較傳統(tǒng)工藝,總黃酮得率提升了120%,可作為松花粉總黃酮等天然活性產(chǎn)物分離純化的一種有效方法。

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Study on the extraction of total flavonoids from Pine Pollen in PEG400/(NH4)2SO4aqueous two-phase system

SHAO Sheng-juan,WEI Jing-li

(Taiyuan Institute of Technology,Taiyuan 030008,China)

An aqueous two-phase system of PEG400/(NH4)2SO4was used to extract total flavonoids from Pine Pollen. The composition of the aqueous two-phase system was 26%PEG400-20%(NH4)2SO4. Effects of the mass fraction of NaCl,pH and temperature of aqueous two-phase system on the partition ratio and extraction rate of total flavonoids from Pine Pollen were studied through the single factor experiments. The optimal extraction conditions were obtained by the orthogonal experimental design. The optimum conditions were as follows:the mass fraction of NaCl at 2%,pH at 4 and temperature at 40 ℃,and the extraction rate can reach up to 98.93%. The NaCl addition had the most effect on flavonoids partition. The aqueous two-phase extraction has the advantages of simple and convenient procedure,moderate aqueous environment,shorter extraction time and higher extraction rate,which is effective for the separation and purification of total flavonoids.

Aqueous two-phase extraction;partition ratio;extraction rate;total flavonoids;Pine Pollen

2016-11-21

邵圣娟(1987-)，女，碩士，講師，研究方向：天然產(chǎn)物的提取分離，E-mail：youyou121abc@126.com。

太原工業(yè)學(xué)院院級科學(xué)基金(2014LY03)。

TS201.1

B

1002-0306(2017)11-0266-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.11.042