黃勇軍 李 峻

(北京老年醫(yī)院卒中一科，北京 100095)

血管活性肽對自發(fā)性高血壓大鼠免疫細胞群及相關細胞因子的影響

黃勇軍 李 峻1

(北京老年醫(yī)院卒中一科，北京 100095)

目的 探討血管活性肽(VIP)對自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)輔助T細胞(Th)1/Th2和Th17/Treg免疫細胞群及相關細胞因子分泌能力的影響。方法 選用SHR 10只一組，分選na?ve CD4+T細胞，在Th1、Th2、Th17、Treg極化條件下培養(yǎng)，加入或者不加入VIP處理。同時分析用VIP處理與不用VIP處理SHR脾臟中Th1/Th2和Th17/Treg免疫細胞群比例變化。用流式細胞儀、酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)、RT-PCR等方法檢測相關細胞因子、轉錄因子表達情況。結果 與沒有加入VIP相比，加入VIP后，SHR動脈血壓降低，Th2、Treg細胞亞群都得到了促進，相關的細胞因子分泌都增加。而Th1、Th17細胞亞群都被抑制，相關的細胞因子分泌都明顯下降(均P<0.05)。結論 VIP可以促進SHR Th2與Treg亞群形成，抑制Th1、Th17細胞亞群的分化。

血管活性肽；T淋巴細胞；細胞因子；自發(fā)性高血壓

自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)具有穩(wěn)定的高血壓遺傳性，其出生后血壓隨著大鼠的年齡不斷升高，在3～4個月時為高血壓的確立期，6個月時血壓可以升到最高水平。隨著血壓的升高會出現(xiàn)心血管并發(fā)癥。SHR血壓升高是由多基因遺傳決定的，這一點與人類高血壓十分相似。血管活性肽(VIP)是一種含有28個氨基酸的肽激素，屬于胰高血糖素/分泌素超家族，是Ⅱ型G蛋白耦聯(lián)受體的配體〔1〕。在脊椎動物中的很多組織里都有產(chǎn)生VIP，包括腸道、胰腺、腦。VIP有增加肝糖分解，降低動脈血壓，降低氣管和胃平滑肌的作用。在抗原刺激之后，VIP主要由輔助T細胞(Th)2產(chǎn)生，在天然和適應性免疫中發(fā)揮抗感染效應。最近研究表明，淋巴細胞來源的VIP在Th分化中起著重要作用，作為一個T細胞分化重要的調控因子，通過多種機制，例如促進效應Th2和記憶Th2的產(chǎn)生，從而可以促進Th2分化，抑制Th1〔2〕。本實驗旨在探討VIP對SHR免疫細胞群及相關細胞因子的影響。

1 材料與方法

1.1 動物 選取雄性SHR 40只，隨機分為4組，一組分選出na?ve CD4+T細胞，加VIP培養(yǎng)；一組分選出na?ve CD4+T細胞，不加VIP培養(yǎng)；一組尾靜脈注射VIP，連續(xù)2 w；一組不注射。健康的Wistar Tokyo(W K Y)雄性大鼠10只作為組對照。

1.2 大鼠na?ve CD4+T細胞Th0、Th1、Th2和Th17的體外分化 T細胞培養(yǎng)基：RPMI-1640培養(yǎng)基(GIBCO,11875-093)；10%FBS(GEMBIO 900-108)；1×青霉素/鏈霉素溶液(GIBCO 15140-122)；2-巰基乙醇(Invitrogen 21985-023)；白細胞介素(IL)-2(研發(fā)體系402-ML-020),IL-4(biolegend 574302)，IL-6(biolegend 575702)，IL-12(研發(fā)體系419-ML-010)，轉化生長因子(TGF)-β(研發(fā)體系240-B-002)，抗CD3(Biolegend 100302)，抗CD28(Biolegend 102102)，抗IL-4(Biolegend 504102)，抗IL-12(Biolegend 505303)，抗-IFNg(Biolegend 505702)，丙二醇甲醚酯酸酯(PMA)(phorbol 12-myristate-13-acetate,SIGMA 79346)，離子霉素(SIGMA 19657)，莫能菌素(ebioscience 00-4505-51)，Easysep CD4+T 細胞富集試劑盒(stemcell technology,catalog#19752)，胞質和核固定液(ebioscience 4275679)，VIP(PolyPeptide Group,San Diego,CA,USA)。

具體步驟：(1)按照Easysep CD4+T細胞試劑盒的說明富集CD4+T細胞。確保富集后的CD4+T細胞純度高于95%。(2)將富集后的CD4+T細胞篩選得到CD4+CD44loCD62Lhi的原初T細胞。(3)將分選的細胞計數(shù)并鋪板：①96孔板，1×105個/孔，200 μl培養(yǎng)基；②48孔板，2×105個/孔，500 μl 培養(yǎng)基。(4)開始分化培養(yǎng)(終濃度見表1)。(5)2 d后將培養(yǎng)物轉移到新平板上，不需更換培養(yǎng)基。(6)再培養(yǎng)3 d以上。如果培養(yǎng)基變黃，更換含中和抗體和無細胞因子的新培養(yǎng)基。

表1 Th亞群的分化培養(yǎng)條件

1.3 Th1、Th2和Th17、Treg 細胞因子檢測

1.3.1 酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測 取培養(yǎng)4 d左右的T 細胞上清，用ELISA 試劑盒檢測。

1.3.2 流式細胞儀檢測 將培養(yǎng)4 d左右的T 細胞，換新培養(yǎng)基，加入 50 ng/ml PMA和1 μg/ml離子霉素到細胞中并孵育1 h。 再加2 μmol/L莫能菌素并孵育細胞4 h。用ebioscience公司的胞質固定液進行處理，按照說明書操作。通過流式細胞儀檢測胞內IFN-γ、IL-4、IL-17水平。Treg細胞不用刺激，直接用核固定液進行FOXP3染色檢測。

1.3.3 RT-PCR檢測 收培養(yǎng)4 d左右的T 細胞100萬個，用TRIZOL 提取RNA，然后反轉錄，再用TAKARA公司SYBR Green 進行熒光定量PCR檢測。

1.4 SHR脾臟細胞處理及SHR動脈血壓測量 取脾臟，研磨制成單細胞懸液，加入紅細胞裂解液將紅細胞去除。再取200萬個細胞進行流式標記。SHR動脈血壓測量見參考文獻〔3〕。

1.5 統(tǒng)計學方法 應用SPSS19.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1 Th1/Th2和Th17/Treg免疫細胞群的變化 Th1中，經(jīng)過VIP處理后，IFN-γ分泌(78.3%)較對照組(86.3%)下降(P<0.05)。Th2中，經(jīng)過VIP處理后，IL-4分泌上升很明顯(15.4% vs 5.6%)。經(jīng)過VIP處理后，Th17分泌IL-17A能力明顯下降(9.7% vs 15.7%)。VIP處理后，Treg細胞的特異轉錄因子FOXP3表達明顯增強(48.1% vs 38.2%)。Th1與Th17的轉錄因子T-bet(對照組0.162±0.021,注射VIP組0.083±0.011)與RORγt明顯下降(對照組0.064±0.026,注射VIP組0.043±0.017)，而Th2與Treg的轉錄因子GATA3(對照組0.043±0.078,注射VIP組0.081±0.089)與FOXP3(對照組0.019±0.037,注射VIP組0.094±0.025)明顯上升。RT-PCR檢測轉錄因子的結果與流式細胞儀檢測細胞因子分泌的結果一致。

2.2 對Th1/Th2和Th17/Treg分泌相關細胞因子表達的影響 Th1分泌的IFN-γ與IL-2水平都較對照組明顯下降。Th2分泌的IL-4與IL-5都明顯下降，IL-13也有較明顯下降。經(jīng)過VIP處理后，Th17相關的細胞因子IL-17A、IL-17F、IL-21、IL-22都有明顯的降低。Treg相關的細胞因子TGF-β以及IL-10都在經(jīng)過VIP處理后明顯升高，只有IL-35沒有差異。

2.3 VIP對SHR動脈血壓的影響 在處理過程中，SHR未出現(xiàn)心血管疾病。用VIP處理后，健康對照組大鼠動脈血壓有輕微下降，SHR組血壓有顯著下降(P<0.05)。而沒有用VIP處理的SHR，動脈血壓沒有下降。見表2。

表2 VIP對SHR動脈SBP、DBP的影響

與用藥前比較：1)P<0.05

2.4 VIP對SHR外周中不同Th亞群的影響 經(jīng)過VIP處理后的大鼠，其表達的Th1、Th17細胞比例都下降〔未注射組IFN-γ(13.6±3.2)%,IL-17(7.5±2.1)%；注射組分別為(8.8±2.7)%，(5.9±1.5)%〕，而Th2、Treg細胞亞群都上升〔未注射組IL-7(5.6±1.4)%,FOXP3(9.2±2.4)%;注射組分別為(7.3±1.8)%,(14.5±3.1)%〕(P<0.05)。

3 討 論

血管舒-縮活性肽調節(jié)系統(tǒng)的平衡紊亂是促發(fā)動脈粥樣硬化、高血壓等心血管疾病發(fā)生及病變進展的重要因素〔4〕。CD4+T可分泌大量的炎性細胞因子，如IFN-γ 和TGF-β〔5～7〕。不同的CD4+T細胞亞群發(fā)揮的免疫作用也不一樣。Th1細胞主要抵抗胞內微生物，Th2細胞則對胞外病原體，包括寄生蟲等發(fā)揮免疫作用；Th17細胞調節(jié)胞外細菌和真菌，而Treg細胞主要是在維持免疫耐受中起著重要的調控作用。

研究表明，VIP在CD4+細胞中起著重要的作用〔2〕，通過直接或間接的方式借助于抗原提呈細胞影響CD4+細胞的分化發(fā)育。目前，VIP對Th2 T細胞免疫反應的影響研究得較多，發(fā)現(xiàn)VIP可以通過上調B7.2的表達從而促進Th2細胞的反應〔8〕，也可以通過調控不用來源的趨化因子進而影響Th2細胞的效應功能〔9〕。本研究結果顯示，SHR的Th2和Treg亞群都得到了促進作用，而Th1與Th17亞群細胞都被抑制。并且，在用VIP處理后，SHR的血壓得到了降低，提示了VIP可能是通過調節(jié)CD4+T細胞來調節(jié)血壓。

CD4+T細胞通過直接或者間接的方式作用于高血壓，引起血壓升高，導致血管功能失常及腎臟等器官受損等，可以通過分泌細胞因子促進或者抑制高血壓的進展。研究發(fā)現(xiàn)，Treg細胞分泌的IL-10可以減少活性氧在血管壁的產(chǎn)生，通過降低還原型輔酶Ⅱ(NADPH)氧化酶的活性，進而改善血管內皮功能障礙，并且使血壓降低〔10〕。Th1可以產(chǎn)生腫瘤壞死因子(TNF)-α。有研究發(fā)現(xiàn)，采用TNF-α拮抗劑依那西普，可以預防高血壓以及相關的血管功能障礙的產(chǎn)生等，并且在高血壓中可以防止腎臟器官受損〔11〕。Th17細胞可以分泌IL-17，IL-17可招募其他炎性細胞進入血管，從而促進了高血壓的發(fā)生〔12〕。

本研究結果提示高血壓產(chǎn)生可以由免疫細胞介導，免疫治療可能成為新的治療手段。本研究為高血壓發(fā)病機制及治療的研究提供了新的方向與思路。

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〔2017-01-20修回〕

(編輯 袁左鳴)

李 峻(1975-)，女，博士，副主任醫(yī)師，主要從事老年疾病研究。

黃勇軍(1976-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事腦血管疾病、老年疾病研究。

R54

A

1005-9202(2017)11-2622-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.11.009

1 四川大學華西醫(yī)院老年醫(yī)學中心