任可姚楠陸軍施鑫吳蘇稼馬捷王宸

·臨床研究與應(yīng)用·

黏著斑激酶在骨肉瘤中的表達(dá)及臨床意義*

任可①姚楠②陸軍①施鑫③吳蘇稼③馬捷④王宸①

目的：探討骨肉瘤組織中黏著斑激酶（focaladhesion kinase，F(xiàn)AK）的表達(dá)情況及其與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系。方法：收集1999年12月至2011年l2月東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院和南京軍區(qū)南京總醫(yī)院收治的經(jīng)手術(shù)病理確診的骨肉瘤標(biāo)本113例，免疫組織化學(xué)檢測(cè)病灶中FAK表達(dá)量及磷酸化水平，并通過RNA干擾觀察改變FAK的表達(dá)與激活水平對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖、凋亡、遷移及侵襲活動(dòng)的影響。結(jié)果：70例標(biāo)本（61.95%）FAK過表達(dá)，其中42例（37.17%）pFAK陽性。FAK表達(dá)譜與性別、年齡、AJCCⅡA/ⅡB期、病灶部位、術(shù)式、術(shù)前化療效果等臨床病理參數(shù)均無顯著相關(guān)性。生存分析顯示FAK的過表達(dá)及其磷酸化顯著縮短了總生存時(shí)間（overallsurvival，OS）和無轉(zhuǎn)移生存時(shí)間（metastasis-free survival，mFS），其與術(shù)前化療效果是預(yù)測(cè)骨肉瘤生存時(shí)間和轉(zhuǎn)移早晚的兩個(gè)獨(dú)立預(yù)后因素。細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)則顯示FAK的表達(dá)和激活可以促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲活動(dòng)，并能抑制凋亡。結(jié)論：FAK的過表達(dá)及其磷酸化與骨肉瘤惡性程度密切相關(guān)，可為生存期及預(yù)后判斷提供一定參考。

骨肉瘤 黏著斑激酶 預(yù)后 遷移 侵襲

骨肉瘤是青少年最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，其侵襲性強(qiáng)，肺轉(zhuǎn)移早，預(yù)后差［1-2］。20世紀(jì)70年代出現(xiàn)的新輔助化療是骨肉瘤治療中里程碑式的進(jìn)步，但不少患者仍會(huì)出現(xiàn)原發(fā)或繼發(fā)性化療耐藥并發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，而這正是骨肉瘤治療失敗的主要原因［3-4］。所以，探查骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制并尋找傳統(tǒng)治療之外的新靶點(diǎn)具有重要意義。

黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）是一種非受體酪氨酸激酶，位于細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合部位整合素（integrin）構(gòu)成的灶性黏附復(fù)合體（focalad?hesion complex）上，調(diào)控多種細(xì)胞活動(dòng)。397位酪氨酸殘基（Tyr397）是FAK主要的自身磷酸化部位，Tyr397磷酸化的FAK可與多種含SH2或SH3結(jié)構(gòu)域的蛋白分子結(jié)合，通過整合素、FAK/Ras/MAPK、FAK/ Src/pl30CAS/JNK、FAK/PI3K、FAK-ROCK/RhoA等多條信號(hào)通路廣泛參與多種細(xì)胞學(xué)行為［5-7］。

近年來發(fā)現(xiàn)FAK與腫瘤細(xì)胞的黏附、遷移、侵襲、增殖及凋亡密切相關(guān)，并參與腫瘤的生長(zhǎng)、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、血管新生及血管生成擬態(tài)［5］。研究顯示，F(xiàn)AK在大腸癌、食管癌、子宮癌、乳腺癌和甲狀腺癌等惡性腫瘤中表達(dá)明顯增高并且是疾病的獨(dú)立預(yù)后因素［8-9］。因此，F(xiàn)AK可能作為臨床判斷腫瘤侵襲及預(yù)后的標(biāo)志，以FAK及其介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路為靶點(diǎn)的靶向治療也可能成為腫瘤治療的新方向。

然而，對(duì)于骨肉瘤中FAK的功能及其與侵襲、轉(zhuǎn)移和新血管形成等相關(guān)性的研究則鮮見報(bào)道，尤其缺少大樣本臨床研究。本研究擬觀察FAK表達(dá)水平與臨床病理特征之間的關(guān)系，分析病灶中FAK的表達(dá)和磷酸化對(duì)骨肉瘤患者生存時(shí)間及侵襲轉(zhuǎn)移的影響，初步探討FAK在骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用及其與患者預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 一般資料收集1999年12月至2011年l2月東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院和南京軍區(qū)南京總醫(yī)院收治的經(jīng)手術(shù)病理確診的113例原發(fā)性骨肉瘤患者的存檔石蠟標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：1）原發(fā)灶位于四肢骨骼；2）美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)（AJCC）分期為Ⅱ期；3）組織學(xué)亞型為普通型；4）治療方案為新輔助化療-根治性手術(shù)-輔助化療；5）具備化療前活檢標(biāo)本以便用于組織形態(tài)學(xué)觀測(cè)。排除標(biāo)準(zhǔn)：1）源發(fā)于中軸骨骼、顱骨、骨盆、肋骨和骨外組織的骨肉瘤；2）繼發(fā)性骨肉瘤；3）骨旁骨肉瘤和骨膜骨肉瘤等其他組織學(xué)亞型；4）初診時(shí)發(fā)現(xiàn)跳躍性病灶或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶；5）初診前已有放療或化療史；6）隨訪期間失訪的患者。

通過病歷和通信聯(lián)系，收集記錄患者的性別、年齡、原發(fā)灶部位、術(shù)式（保肢/截肢）、腫瘤最大直徑、術(shù)前化療的腫瘤壞死百分率。隨訪時(shí)間截止到2015年12月31日，隨訪終點(diǎn)為死亡、失訪或生存至截止日期，隨訪期間的失訪者算作刪失值。自確診至患者死亡之間的時(shí)間定義為總生存時(shí)間（overall survival，OS），自手術(shù)之日至發(fā)生轉(zhuǎn)移之間的時(shí)間為無轉(zhuǎn)移生存時(shí)間（metastasis-free survival，mFS）。

1.1.2 主要試劑兔抗人FAK多克隆抗體（C-20）購自美國(guó)Santa Cruz公司，1:100稀釋；兔抗人磷酸化FAK［pY397］單克隆抗體購自美國(guó)Invitrogen公司，1:100稀釋；Envision試劑盒以及DAB顯色試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司；CCK-8檢測(cè)試劑盒及BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒均購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒LipofectamineTM2000購自美國(guó)Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 組織形態(tài)學(xué)觀察1）蘇木精-伊紅（HE）染色113例骨肉瘤標(biāo)本和22例正常松質(zhì)骨組織標(biāo)本以4%的多聚甲醛溶液固定，4%EDTA-2Na溶液脫鈣，乙醇逐級(jí)脫水，二甲苯透明，石蠟包埋后連續(xù)切片，HE染色，在BH-2光學(xué)顯微鏡Olympus下作光鏡觀察，篩選結(jié)構(gòu)典型的取材部位。2）免疫組織化學(xué)染色石蠟標(biāo)本以4μm厚切片，烤干，于二甲苯溶液及不同濃度的乙醇中脫蠟至水后，微波熱修復(fù)，修復(fù)完畢后加抗人FAK或FAK［pY397］一抗，4℃過夜。根據(jù)Elivision plus染色試劑盒要求滴加相應(yīng)的試劑并孵育，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，最后予脫水、透明及封片。采用乳腺癌組織作為陽性對(duì)照，以PBS液代替一抗作為陰性對(duì)照。3）免疫組織化學(xué)結(jié)果判定隨機(jī)選擇5個(gè)有代表性的高倍鏡視野，每個(gè)視野記數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞。FAK免疫組織化學(xué)染色評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：當(dāng)陽性細(xì)胞百分率≥90%且染色強(qiáng)度（不著色、臨界著色、著色淺、中等著色和強(qiáng)烈著色分別為0、1、2、3、4分）≥3時(shí)，視為FAK過表達(dá)和pFAK磷酸化陽性［10-11］。

1.2.2 細(xì)胞學(xué)試驗(yàn)1）細(xì)胞培養(yǎng)人骨肉瘤細(xì)胞株143B和MG-63購自美國(guó)組織細(xì)胞庫（Manassas，VA，USA）。細(xì)胞復(fù)蘇后，加入含10%胎牛血清（FBS，Invitrogen）、100 U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，5% CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)。融合度至90%后消化傳代。實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞均在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。2）細(xì)胞轉(zhuǎn)染及Western blot驗(yàn)證設(shè)計(jì)4條siRNA［12-14］，由Qiagen GmbH（Hilden，Germany）公司合成：非特異性（錯(cuò)義）siRNA（5'-AATTCT CCGAACGTGTCACGT-3'）；FAK siRNA，F(xiàn)1（5'-GGUUC AAGCUGGAUUAUUU-3'）；FAK siRNA，F(xiàn)2（5'-CCGGTC GAATGATAAGGTGTA-3'）；FAK siRNA，F(xiàn)3（5'-GGAAA UACAGUUUGGAUCU-3'）。確認(rèn)最佳轉(zhuǎn)染效率后，根據(jù)lipo fectamineTM2000試劑盒操作手冊(cè)對(duì)143B和MG-63細(xì)胞株進(jìn)行轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)48 h后，細(xì)胞懸液加入RIPA裂解液，離心，BCA法稀釋，加入上樣緩沖液。8%的SDS-PAGE電泳，將蛋白質(zhì)條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。含5%脫脂牛奶的TBST緩沖液封閉，依次加入一抗及HRP標(biāo)記的二抗，暗室曝光后Imageproplus（IPP）軟件分析結(jié)果，以目的蛋白與GAPDH灰度值的比值進(jìn)行比較分析。3）細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)未轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染siRNA的骨肉瘤細(xì)胞分別接種于96孔板中，每孔1×105細(xì)胞/mL，培養(yǎng)24 h后每孔加入10μLCCK-8，酶標(biāo)儀在450 nm下測(cè)定各孔OD值。4）細(xì)胞凋亡檢測(cè)143B和MG-63細(xì)胞懸液以2×105細(xì)胞/孔接種于6孔板，24 h后離心收獲全部細(xì)胞，重懸后加入5μLAnnexin V-FITC和10μLPI，冰孵15min，流式細(xì)胞儀分析檢測(cè)。5）細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)制備2×105細(xì)胞/mL的細(xì)胞懸液。Transwell小室的下室加入500μL含5%FBS的DMEM；遷移實(shí)驗(yàn)時(shí)將200μL細(xì)胞懸液加入上室，侵襲實(shí)驗(yàn)時(shí)先將80μLMatrigel（80μL）（BDBiosciences）加入上室37°C孵育1 h，待形成凝膠后再向上室加入200μL細(xì)胞懸液。培養(yǎng)24 h后（MG-63的侵襲實(shí)驗(yàn)是48 h），用棉簽去除凝膠，4%多聚甲醛固定20min，蘇木素室溫染色3～5min。顯微鏡下隨機(jī)選擇6個(gè)視野（200倍）計(jì)數(shù)染色細(xì)胞并計(jì)算平均值。所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行5次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料應(yīng)用χ2檢驗(yàn)，生存分析采用Ka?plan-Meier法，并應(yīng)用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析獨(dú)立預(yù)后因素。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨肉瘤中FAK的免疫組織化學(xué)染色情況及其與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

113例骨肉瘤患者包括男性71例（62.8%）和女性42例（37.2%）；年齡5～56歲，中位年齡20.3歲；隨訪時(shí)間7～160個(gè)月，中位隨訪時(shí)間56個(gè)月；5年的總體生存率為51.1%。113例骨肉瘤標(biāo)本中有70例（61.95%）FAK過表達(dá)，染色部位主要在瘤細(xì)胞的胞漿，胞膜偶有染色（圖1）；其中42例（37.17%）pFAK染色陽性。正常松質(zhì)骨標(biāo)本和陰性對(duì)照均未見FAK過表達(dá)及磷酸化。統(tǒng)計(jì)分析顯示，骨肉瘤中FAK或pFAK與患者的性別、年齡、AJCCⅡA/ⅡB期、腫瘤部位、術(shù)式（保肢/截肢）、術(shù)前化療的腫瘤壞死百分率等臨床病理參數(shù)均無顯著相關(guān)性（表1）。

圖1 骨肉瘤與正常松質(zhì)骨組織的FAK免疫組織化學(xué)染色和磷酸化FAK染色Figure 1 Immunohistochem icalstainingof FAK(A,B,E,and G)and pFAK(C,D,F,and H)proteins in osteosarcoma cellsand normalcancellousbone tissues

2.2 FAK的表達(dá)與骨肉瘤患者預(yù)后的關(guān)系

根據(jù)骨肉瘤中FAK是否過表達(dá)及其磷酸化狀態(tài)，患者分為3組：FAK-/pFAK-（A）；FAK+/pFAK-（B）；FAK+/pFAK+（C）。3組的中位OS分別是86、56、39個(gè)月，中位mFS則分別是69、45、24個(gè)月。相應(yīng)3組的5年總生存率分別是78.4%、44.9%、25.8%，而5年無轉(zhuǎn)移生存率分別是55.0%、27.6%、16.9%。這提示FAK的過表達(dá)及其磷酸化可能預(yù)示患者生存時(shí)間較短，轉(zhuǎn)移發(fā)生較早。

采用Kaplan-Meier生存分析各項(xiàng)臨床病理特征，結(jié)果證實(shí)FAK的過表達(dá)及其磷酸化顯著縮短了OS和mFS（圖2）。進(jìn)一步行Log-rank成對(duì)比較，結(jié)果顯示OS在A組和B組之間（P=0.016）、B組和C組之間（P=0.012）以及A組和C組之間（P＜0.001）均有顯著性差異。類似的mFS在A組和B組之間（P=0.042）、B組和C組之間（P= 0.001）以及A組和C組之間（P＜0.001）均有顯著性差異。另外，Kaplan-Meier生存分析還顯示術(shù)前化療效果對(duì)患者的OS和mFS亦有顯著影響（圖2），但其他臨床病理特征與患者生存期及轉(zhuǎn)移均無相關(guān)（表2）。進(jìn)一步采用Cox風(fēng)險(xiǎn)比例回歸模型分析顯示，除FAK分組的B、C兩組之間mFS差異不顯著之外，F(xiàn)AK的過表達(dá)及其磷酸化和術(shù)前化療效果是預(yù)測(cè)骨肉瘤生存時(shí)間和轉(zhuǎn)移早晚的兩個(gè)獨(dú)立預(yù)后因素（表3）。

2.3 siRNA轉(zhuǎn)染降低了FAK和pFAK的表達(dá)

為研究FAK的細(xì)胞學(xué)效應(yīng)，MG-63和143B細(xì)胞株均分別轉(zhuǎn)染了非特異錯(cuò)義siRNA（陰性對(duì)照組）和3種FAK siRNA（干擾組），并通過Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果。3個(gè)干擾組（F1，F(xiàn)2和F3）的MG-63與陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組的MG-63相比，F(xiàn)AK表達(dá)降低了62%～70%；Tyr397磷酸化的FAK（pFAK）表達(dá)也降低了67%～75%（圖3）。143B細(xì)胞株FAK和pFAK表達(dá)下降情況與MG63相似。

2.4 FAK表達(dá)降低對(duì)細(xì)胞增殖及凋亡的作用

增殖檢測(cè)結(jié)果顯示，F(xiàn)AK siRNA（F1，F(xiàn)2和F3）干擾組的MG-63和143B細(xì)胞OD值明顯低于相應(yīng)的陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，而陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組之間OD值無顯著差異（表4）。凋亡檢測(cè)顯示，陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組的凋亡率明顯低于3個(gè)干擾組。這表明抑制FAK的表達(dá)可誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞的凋亡并抑制其增殖（表5，圖4）。

2.5 FAK的下調(diào)抑制了骨肉瘤細(xì)胞的遷移和侵襲

轉(zhuǎn)染FAK siRNA的3個(gè)干擾組遷移到Transwell膜上的細(xì)胞數(shù)明顯少于陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組（圖5），侵襲實(shí)驗(yàn)中也觀察到同樣的結(jié)果（圖6），這顯示FAK及pFAK的過表達(dá)在骨肉瘤細(xì)胞的遷移及侵襲中發(fā)揮重要作用。

表1 AJCC分期Ⅱ期的骨肉瘤患者FAK表達(dá)譜與臨床病理特征之間的關(guān)系Table 1 Association of clinicopathologicaldataand FAKexpression profiles in patientsw ith stage IIAJCCstage extrem ityosteosarcoma

圖2 FAK表達(dá)水平及術(shù)前化療效果不同的各組患者OS和mFS的Kaplan-Meier單因素分析Figure 2 Kaplan-Meier analysis of overalland metastasis-free survival for patientsw ith different FAKexpression levels and different histological responses to pre-operative chemotherapy

表2 骨肉瘤患者OS和mFS的Kaplan-Meier單因素分析Table 2 Univariate analysesof factorsassociatedw ith OSand MFS

表3 骨肉瘤患者預(yù)后的多因素生存分析Table 3 Multivariate analysisof factorsassociated w ith OSand MFS

圖3 Western blot檢測(cè)RNA干擾對(duì)于骨肉瘤細(xì)胞FAK蛋白表達(dá)及磷酸化水平的影響Figure 3 Protein expression and phosphorylation of FAKin siRNA-treated osteosarcoma,control,andmock group cells

表4 FAK的siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖的影響Table 4 Effectof FAKsiRNA transfection on cellproliferation

表5 FAK的siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)骨肉瘤細(xì)胞凋亡的影響Table 5 Effectof FAKsiRNA transfection on cellapoptosis

圖4 FAK表達(dá)對(duì)骨肉瘤細(xì)胞凋亡的影響Figure 4 Effectof inhibiting FAKexpression on apoptosisofosteosarcoma cells.

圖5 FAK表達(dá)對(duì)骨肉瘤細(xì)胞遷移能力的影響Figure 5 Effect of inhibiting FAKexpression onm igration ofosteosarcoma cells

圖6 FAK表達(dá)對(duì)骨肉瘤細(xì)胞侵襲能力的影響Figure 6 Effect of inhibiting FAKexpression on invasion of osteosarcoma cells

3 討論

骨肉瘤缺乏有效的臨床預(yù)后指標(biāo)。FAK是調(diào)節(jié)細(xì)胞行為的關(guān)鍵因子，而Tyr397的磷酸化則是其將細(xì)胞外基質(zhì)的刺激轉(zhuǎn)化為遷移、黏附、增殖等下游細(xì)胞行為過程中的信號(hào)樞紐［5］，正是這些細(xì)胞活動(dòng)導(dǎo)致了腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成［15］?，F(xiàn)觀察到消化道腫瘤、肝癌、肺癌、泌尿系統(tǒng)腫瘤和宮頸癌等FAK的過表達(dá)與預(yù)后不良之間存在密切關(guān)聯(lián)［8-9，16-17］，但骨肉瘤標(biāo)本中FAK的表達(dá)水平與患者的臨床病理特征及生存時(shí)間的關(guān)聯(lián)尚未得到直接論證。為此，需在組織學(xué)和細(xì)胞學(xué)水平進(jìn)行探討。

本研究發(fā)現(xiàn)113例骨肉瘤標(biāo)本中FAK和pFAK的免疫組織化學(xué)染色評(píng)分差異顯著，且pFAK的陽性率明顯低于FAK，其原因可能是激活后的FAK與一些蛋白的物理性結(jié)合對(duì)其抗原產(chǎn)生了掩飾效應(yīng)，從而降低了免疫反應(yīng)特性［18-19］。單因素生存分析顯示FAK/pFAK表達(dá)譜與骨肉瘤患者的OS和mFS密切相關(guān)，A組（FAK-/pFAK-）預(yù)后最好，C組（FAK+/ pFAK+）最差，B組（FAK+/pFAK-）則居中。這提示FAK的過表達(dá)及其磷酸化在骨肉瘤的病程進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。而且，Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析進(jìn)一步顯示FAK/pFAK表達(dá)譜是獨(dú)立預(yù)后因素之一。因此考慮FAK的表達(dá)水平及其磷酸化狀態(tài)具有鑒別高危骨肉瘤患者的潛在臨床應(yīng)用價(jià)值。

遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的主要死因，而瘤細(xì)胞的遷移和侵襲則是轉(zhuǎn)移的重要環(huán)節(jié)。遷移中的腫瘤細(xì)胞需與胞外基質(zhì)（ECM）往復(fù)、協(xié)調(diào)的進(jìn)行黏附和解離，黏著斑與肌動(dòng)蛋白張力纖維的生成正是這一過程的原動(dòng)力［20］。一方面，當(dāng)細(xì)胞與ECM結(jié)合后，β1整合素聚集成簇形成黏著斑，F(xiàn)AK與黏著斑結(jié)合發(fā)生磷酸化且活性增加，通過FAK/Ras/MAPK等通路介導(dǎo)生長(zhǎng)刺激信號(hào)，促進(jìn)細(xì)胞骨架的重組，調(diào)控遷移。另一方面，整合素介導(dǎo)FAK的Tyr397自動(dòng)磷酸化后，與Src家族PTK結(jié)合，形成FAK/Src復(fù)合物，F(xiàn)AK/Src復(fù)合物可能通過促進(jìn)細(xì)胞尾部局灶黏附的分解，促進(jìn)細(xì)胞遷移和存活［20-21］。不僅如此，尿激酶型纖溶酶原激活物（urokinase-type plasminogen activator，uPA）和基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）可通過降解ECM，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移［22-23］。uPA和MMP的分泌過程也需FAK參與的多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑的激活［24］。這些發(fā)現(xiàn)可以在一定程度上解釋FAK作為骨肉瘤患者潛在預(yù)后標(biāo)記的原因和機(jī)理。細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)FAK表達(dá)量及其磷酸化水平的升高促進(jìn)了143B和MG-63細(xì)胞的遷移和侵襲，用RNAi沉默F(xiàn)AK則產(chǎn)生顯著抑制效應(yīng)。因此，本研究考慮激活后的FAK通過肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的重構(gòu)調(diào)控了黏著斑組裝和解離之間的動(dòng)態(tài)平衡，并由此構(gòu)成了骨肉瘤細(xì)胞遷移和侵襲的動(dòng)力學(xué)基礎(chǔ)，進(jìn)而加速了骨肉瘤的轉(zhuǎn)移。

既往研究還顯示FAK與細(xì)胞的生存關(guān)系密切。FAK的活化可激活PI3K信號(hào)通路，經(jīng)PKB/AKT途徑對(duì)抗凋亡［25］。FAK還通過MAPK-ERK通路激活多種轉(zhuǎn)錄因子，代替錨定依賴性生存信號(hào)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活［26］。研究表明，ERK的激活可促進(jìn)c-Fos基因轉(zhuǎn)錄，而且MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)活化的c-Jun N末端激酶（JNK）可以調(diào)節(jié)細(xì)胞循環(huán)G1期。JNK的活化又需要FAK與Src、p130Cas的結(jié)合以及與Crk的締和?；罨腏NK進(jìn)入細(xì)胞核，使轉(zhuǎn)錄因子c-Jun磷酸化，與c-Fos形成AP-1（activator protein-1）轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物調(diào)節(jié)下游基因控制細(xì)胞的增殖過程［27］。本研究中，F(xiàn)AK siRNA抑制了143B和MG-63細(xì)胞的增殖，促進(jìn)了凋亡。還有學(xué)者觀察到抑制FAK活性可誘導(dǎo)另一株骨肉瘤細(xì)胞SAOS-2發(fā)生凋亡［28］。因此，本研究認(rèn)為FAK的表達(dá)及其磷酸化通過復(fù)雜的下游信號(hào)途徑對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的生存和增殖發(fā)揮重要作用，并由此促進(jìn)了疾病進(jìn)展。

綜上所述，本研究在組織學(xué)和細(xì)胞學(xué)層面初步證實(shí)了FAK的過表達(dá)及其磷酸化與骨肉瘤的惡性程度存在顯著相關(guān)性，這可能與其促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲活動(dòng)有關(guān)。FAK/pFAK表達(dá)譜是骨肉瘤的一個(gè)獨(dú)立預(yù)后因素，可能為骨肉瘤患者的生存期及預(yù)后判斷提供一定參考。對(duì)FAK的深入研究不僅有助于揭示骨肉瘤發(fā)病機(jī)制，也可能為其臨床治療提供新方向和新靶點(diǎn)。

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（2017-01-05收稿）

（2017-05-07修回）

（編輯：楊紅欣校對(duì)：武斌）

Clinical significance of expression and phosphorylation of FAK in human osteosarcoma

Ke REN1,Nan YAO2,Jun LU1,Xin SHI3,Sujia WU3,Jie MA4,Chen WANG1
1Department of Orthopaedics,Zhongda Hospital,Southeast University,Nanjing 210009,China;2Laboratory of TranslationalMedicine, Jiangsu Province Academy of TraditionalChinese Medicine,Nanjing 210028,China;3Department of Orthopedics,Nanjing GeneralHospital,Nanjing University,SchoolofMedicine,Nanjing 210002,China;4Departmentof Pathology,Nanjing GeneralHospital,Nanjing University,SchoolofMedicine,Nanjing210002,China

ChenWANG;E-mail:chenwang_southeast@126.com

Objective:To exam ine expression patternsof focaladhesion kinase(FAK)and itsactivated form,phosphorylated FAK(pFAK), in human osteosarcoma and to investigate the correlation of FAKexpressionw ith clinicopathologicalparametersand prognosis.Functional consequence ofmanipulating FAKprotein levelswasalso investigated in human osteosarcoma cell lines.Methods:Immunohistochemical stainingwasused to detect FAKand pFAK levels in pathologicallyarchivedmaterials from 113 patientswith primaryosteosarcoma.Kaplan-Meier survivaland Cox regression analyseswere used to evaluate prognoses.The role of FAK in cytologicalbehaviorofMG63 and 143B human osteosarcoma cell lineswasstudied via the FAKprotein knockdown with siRNA.Cellproliferation,m igration,invasiveness,and apoptosiswere assessed using cell counting kit-8,Transwell,and Annexin V/PIstainingmethods.Results:Both FAK and pFAKwere overexpressed in osteosarcoma patients.Tumor cellsexhibited cytoplasm icity and occasionalmembranous immunoreactivity for FAK.A totalof42 cases(37.17%)mainly showed expressed pFAKin cytoplasm ofosteosarcoma cells.No overexpression stainingofanti-FAKand anti-pFAKantibodieswasobserved in normalcancellousbone tissuesornegative controls.Significantdifferenceswere observed in overall survivalbetween FAK-/pFAK-and FAK+/pFAK-groups(P=0.016),FAK+/pFAK-and FAK+/pFAK+groups(P=0.012),and FAK-/pFAK-and FAK+/ pFAK+groups(P＜0.001).Allgroupsshowed similarmetastasis-free survival.Cox proportionalhazard analysisshowed that FAKexpression profile isan independent indicatorofboth overallandmetastasis-free survival.siRNA-based knockdown of FAKsignificantly reducedm igration and invasion ofMG63 and 143Bcellsand affected proliferation and apoptosis in osteosarcoma cells.Conclusion:Osteosarcomamalignancies in vitro and in vivo were correlated w ith overexpression and phosphorylation of FAK.These findingssuggest that FAKplaysan important biological role in osteosarcoma carcinogenesis.This study providesa betterunderstanding ofdiagnostic and prognostic relevance of FAK overexpression and phosphorylation in osteosarcoma patients.Therefore,FAKand pFAKcan be used as independent predictorsofoverall andmetastasis-free survivalin osteosarcoma patients.

osteosarcoma,focaladhesion kinase,prognosis,m igration,invasion

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.10.019

①東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院骨科（南京市210009）；②江蘇省中醫(yī)藥研究院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室；③南京軍區(qū)南京總醫(yī)院骨科；④南京軍區(qū)南京總醫(yī)院病理科

*本文課題受國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（編號(hào)：81673017）和江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（編號(hào)：BK2012775）資助

王宸chenwang_southeast@126.com

This workk was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81673017)and the Jiangsu Province Natural Science Foundation from the Science and Technology Departmentof Jiangsu Province ofChina(No.BK2012775)

任可專業(yè)方向?yàn)楣侨饬鲅苌蓴M態(tài)的研究。

E-mail：renke1997@sohu.com