王中華+陳艷華+徐婧+陳蕙莉+周霞+肖新華+平凡+賀玖明+再帕爾·阿不力孜+張瑞萍

摘 要 系統(tǒng)地比較了3種常用的離子化技術(shù)電噴霧電離（ESI）、大氣壓化學(xué)電離（APCI）、大氣壓光致電離（APPI）對(duì)脂類化合物的離子化效率、檢測靈敏度和覆蓋范圍，以探討多重離子化液相色譜質(zhì)譜（LCMS）方法在血清脂質(zhì)組學(xué)研究中的適用性。血清樣本經(jīng)甲基叔丁基醚萃取后，采用Ascentiss Express C8 色譜柱（150 mm×2.1 mm， 2.7 μm）和二元線性梯度洗脫分離，流動(dòng)相（A）為乙腈水（3∶2， V/V， 含0.1%甲酸， 10 mmol/L甲酸銨），B為異丙醇乙腈（9∶1， V/V， 含0.1%甲酸，10 mmol/L甲酸銨），分別采用ESI、APCI和APPI離子源正、負(fù)離子模式進(jìn)行質(zhì)譜檢測。結(jié)果表明，ESI離子源對(duì)脂肪酸類、甘油脂類、甘油磷脂類化合物、鞘磷脂類化合物的離子化效率最高，對(duì)異戊烯醇脂類化合物的離子化效率與APPI離子源相當(dāng)，APPI離子源對(duì)膽固醇（酯）類化合物的檢測靈敏度最高，APCI離子源對(duì)各類化合物的檢測靈敏度均低于ESI或APPI離子源； 采用ESI和APPI離子源相結(jié)合的LCMS脂質(zhì)組學(xué)分析方法可以提高分析方法的整體靈敏度和血清中脂類信息檢測的完整性。

關(guān)鍵詞 血清脂質(zhì)組學(xué)； 電噴霧電離； 大氣壓化學(xué)電離； 大氣壓光致電離； 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用

1 引 言

脂類化合物是一類易溶解于有機(jī)溶劑的化合物，具有許多重要的生物學(xué)功能，參與調(diào)節(jié)多種生命活動(dòng)過程，包括能量轉(zhuǎn)換、物質(zhì)運(yùn)輸、信息識(shí)別與傳遞、細(xì)胞發(fā)育和分化，以及細(xì)胞凋亡等[1～5]， 最近的研究表明， 脂類化合物的異常代謝與多種疾病， 如動(dòng)脈硬化癥、糖尿病、肥胖癥、阿爾茨海默病以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[6，7]。研究表明， 人血清中的脂類成分具有結(jié)構(gòu)多樣， 濃度水平范圍寬， 極性差異大等特點(diǎn)， 對(duì)人血清脂質(zhì)組學(xué)的分析提出很大的挑戰(zhàn)[8]。

隨著軟電離技術(shù)的發(fā)展， 質(zhì)譜在脂質(zhì)組學(xué)研究中的應(yīng)用越來越廣。目前脂質(zhì)組學(xué)LCMS分析中常用的軟電離技術(shù)包括電噴霧電離（Electrospray ionization， ESI）、大氣壓化學(xué)電離（Atmospheric pressure chemical ionization， APCI）和大氣壓光致電離（Atmospheric pressure photoionization， APPI）。ESI是基于LCMS分析技術(shù)的脂質(zhì)組學(xué)研究中最常用的離子化技術(shù)[9～14]。然而， ESI也有一些不足， 如易在復(fù)雜多組分樣品的檢測中產(chǎn)生離子抑制現(xiàn)象。APCI主要適用于弱極性化合物， 相對(duì)于ESI不易受基質(zhì)效應(yīng)的影響[15，16]， 目前， LCAPCIMS技術(shù)已被應(yīng)用于體液中一些脂類代謝物的檢測[17， 18]。APPI適合于弱極性及非極性化合物的離子化， 相比于ESI與APCI， 其所具有的電勢在一定程度上可以克服或降低離子抑制與基質(zhì)干擾帶來的影響[19，20]， 因而在脂類化合物定量分析中的應(yīng)用越來越廣泛[21～23]。有學(xué)者系統(tǒng)比較了ESI， APCI， APPI離子源在正相色譜條件下對(duì)脂肪酸和甘油酯類化合物的檢測能力， 發(fā)現(xiàn)APPI離子源在檢測靈敏度和定量準(zhǔn)確性方面表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢[24]。然而， 更值得關(guān)注的是這3種常用的離子化方法在應(yīng)用更為廣泛的反相色譜條件下對(duì)各種脂類化合物的檢測適用性， 目前這方面的研究尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本課題組在前期研究中， 基于“互補(bǔ)性”思路建立了應(yīng)用于代謝組學(xué)的組合式離子化LCMS分析方法， 在提高代謝物的檢測靈敏度和覆蓋范圍等方面獲得良好效果[25～27]。因此， 為了探討本方法在脂質(zhì)組學(xué)分析中的應(yīng)用， 本研究系統(tǒng)地比較了ESI， APCI和APPI離子源在反相色譜條件下對(duì)6類17種代表性脂類對(duì)照品和健康人血清中的脂類代謝物的檢測能力， 為脂類化合物的質(zhì)譜分析方法和脂質(zhì)學(xué)研究中離子化方式的選擇提供了依據(jù)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Agilent 1200系列快速高分辨液相色譜儀（德國Waldbronn Aglient Technologies 公司）， 包括二極管陣列檢測器、二元梯度泵、在線脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器（配有恒溫箱）、柱溫箱； QSTARTM Elite型四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國Applied Biosystem/MDS Sciex公司）， 配有 ESI， APCI， APPI 離子源及Analyst QS 2.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。

17種脂質(zhì)對(duì)照品（美國SigmaAldrich公司）如表1所示。乙腈、異丙醇和甲酸（色譜純， Merck公司）： 甲酸銨（色譜純， 美國SigmaAldrich公司）。實(shí)驗(yàn)用水為某品牌純凈水。

20例健康人血清樣本采自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院（符合中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院倫理學(xué)委員會(huì)要求）， 采集后立即于80℃冷凍保存。

2.2 色譜條件

Ascentiss Express C8 色譜柱（150 mm×2.1 mm， 2.7 μm， 德國SigmaAldrich公司）； 流動(dòng)相： A相為乙腈水（3∶2， V/V， 含0.1%甲酸， 10 mmol/L甲酸銨）； B為異丙醇乙腈（9∶1， V/V， 含0.1%甲酸， 10 mmol/L甲酸銨）。線性梯度洗脫條件： 0～1.5 min， 32% B； 1.5～18.5 min， 32%～97% B； 18.5～22 min， 97% B。每次進(jìn)樣前， 色譜柱在初始流動(dòng)相下平衡5 min。流速： 300 μL/min； 柱溫： 55℃； 進(jìn)樣量： 10 μL。

2.3 質(zhì)譜條件

采用正、負(fù)離子全掃描模式， 掃描范圍為120～2000 Da。ESI離子源噴霧電壓為4 kV/4 kV， APCI離子源放電電流為2.5 μA/2.5 μA， APP離子源電離電壓為1.2 kV/1.2 kV。ESI， APCI， APPI離子源溫度分別為450℃、420℃、400℃， 霧化氣： 0.41 MPa， 干燥氣： 0.34 MPa， 氣簾氣： 0.21 MPa。APPI離子源中摻雜劑丙酮的流速為20 μL/min， VWD燈保護(hù)氣流速為1 L/min。實(shí)驗(yàn)所用氣體均為氮?dú)狻?shù)據(jù)采集及處理軟件采用Analyst QS 2.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。

2.4 對(duì)照品溶液及血清樣本的制備

2.4.1 脂類對(duì)照品混合溶液的配制 分別稱取適量17種對(duì)照品， 分別溶于CH2Cl2CH3OH（2∶1， V/V）混合溶液中， 制備脂類對(duì)照品貯備液， SA、SM（d18∶1/16∶0）、PE（14∶0/14∶0）、CoQ10貯備液的濃度為0.1 mg/mL， 其余均為1 mg/mL。取適量脂類對(duì)照品貯備液， 用乙腈異丙醇水（65∶30∶5， V/V）稀釋并定容至5 mL， 配制成各種脂類化合物濃度均為3 μg/mL的對(duì)照品混合溶液。

2.4.2 血清樣本前處理 實(shí)驗(yàn)前將血清樣本在4℃下解凍， 取血清30 μL， 加入甲醇200 μL， 甲基叔丁基醚660 μL， 渦旋混合5 min， 加入水150 μL， 渦旋5 min后靜置5 min， 4000 r/min離心5min后移取上層有機(jī)相500 μL并吹干， 殘留物用500 μL乙腈異丙醇水（65∶30∶5， V/V）混合溶劑復(fù)溶， 15000 r/min離心10 min后進(jìn)樣分析。

2.5 數(shù)據(jù)處理方法

取20例血清樣本經(jīng)LCMS分析后獲得原始數(shù)據(jù)文件， 利用數(shù)據(jù)格式轉(zhuǎn)換軟件 （Wiff to mzData， version 1.0.0.4， Applied Biosystems/MDS Sciex） 將原始數(shù)據(jù)文件轉(zhuǎn)換為mzData格式， 用XCMS進(jìn)行保留時(shí)間校準(zhǔn)、峰識(shí)別、濾噪、峰匹配， 獲得包含質(zhì)荷比、保留時(shí)間、峰面積等信息的原始數(shù)據(jù)矩陣。采用CAMERA （Collection of Algorithms for Metabolite Profile Annotation）軟件標(biāo)注， 并手動(dòng)剔除加合離子、同位素離子以及碎片離子峰。采用自編的程序?qū)?種離子源獲得的離子峰進(jìn)行比較， 設(shè)定質(zhì)荷比與保留時(shí)間的容許偏差值（m/z=0.05， RT=0.2 min）， 即代謝物保留時(shí)間偏差在0.2 min以內(nèi)、質(zhì)量數(shù)偏差<0.05 Da被認(rèn)為是相同代謝物， 最終獲得3種離子化方式檢測到的共有或特有的代謝物[26]。

3 結(jié)果與討論

3.1 3種離子化技術(shù)對(duì)脂類化合物對(duì)照品的離子化特點(diǎn)

采用ESI， APCI， APPI 3種離子源對(duì)不同種類的脂類化合物對(duì)照品的混合溶液進(jìn)行了LCMS分析， 詳細(xì)考察了3種離子源的離子化特點(diǎn)， 結(jié)果見表2。脂肪酸類化合物在3種離子源負(fù)離子條件下均易離子化。甘油脂類化合物在正離子檢測模式下易離子化， 離子化過程中容易發(fā)生中性丟失而脫去水或脂肪酸分子， 所產(chǎn)生的[M+H-H2O]+和[M+H-RCOOH]+ 離子的相對(duì)豐度在APPI離子源中最高、其次是APCI離子源， 在ESI離子源中最弱（圖1）。甘油磷脂和鞘磷脂類化合物在（±）ESI模式下均易離子化， 但在正離子模式下的離子化效率高于負(fù)離子模式。而APPI和APCI離子源條件下， 甘油磷脂和鞘磷脂類化合物的磷酯鍵容易斷裂， 形成多種豐度較低的碎片離子。膽固醇（酯）類化合物在3種離子源正離子模式下均易脫去水分子或脂肪酸分子而被離子化。異戊烯醇脂類化合物易在正離子模式下發(fā)生離子化， 在3種離子源中均形成[M+H]+的基峰離子。

綜上所述， ESI離子源的離子化能力最強(qiáng)， 適用于大多數(shù)脂類化合物。相對(duì)于APCI和APPI離子源， ESI離子源是最溫和的離子化技術(shù)， 除能產(chǎn)生 [M+H]+離子外， 還常產(chǎn)生相對(duì)豐度較高的[M+NH4]+， [M+Na]+等加合離子； 而APPI和APCI離子源條件下， 脂類化合物尤其是磷脂類化合物容易發(fā)生碎裂而得不到準(zhǔn)分子離子。

3.2 3種離子化技術(shù)對(duì)脂類對(duì)照品的檢測靈敏度

脂類對(duì)照品混合液依次連續(xù)進(jìn)樣6次， 采用優(yōu)化后的質(zhì)譜條件進(jìn)行LCMS分析， 根據(jù)不同離子源的離子化特點(diǎn)， 分別選擇各種脂類化合物在各種離子源離子化時(shí)產(chǎn)生的基峰離子， 提取相應(yīng)的離子流色譜峰， 計(jì)算平均峰面積。 結(jié)果（圖2）表明， 17種脂類對(duì)照品在相同濃度下表現(xiàn)出明顯不同的離子化效率。ESI離子源不但對(duì)較易離子化的脂肪酸類、甘油磷脂類、鞘磷脂類代謝物的離子化能力最高， 對(duì)極性較小的甘油二酯和甘油三酯類化合物的離子化效率也優(yōu)于APCI和APPI離子源。推測是由于流動(dòng)相中的甲酸銨能促進(jìn)該類化合物形成[M+NH4]+離子而發(fā)生離子化。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)， 當(dāng)流動(dòng)相中不加入甲酸銨等添加劑時(shí)， 這些[M+NH4]+離子的強(qiáng)度顯著降低， 導(dǎo)致該類化合物在（+）ESI條件下的離子化效率顯著低于（+）APCI和（+）APPI。這一結(jié)果與文獻(xiàn)[24]中正相色譜條件下獲得的結(jié)果一致。ESI離子源對(duì)異戊烯醇脂類化合物的檢測靈敏度與APPI離子源相當(dāng)， 均優(yōu)于APCI離子源。APPI離子源對(duì)膽固醇（酯）類化合物檢測能力最強(qiáng)， 顯著高于APCI和ESI離子源。APCI離子源對(duì)各類化合物的檢測能力均低于ESI或APCI離子源。

3.3 多重離子化LCMS技術(shù)在血清脂質(zhì)組學(xué)分析中的適用性

分別采用ESI、APCI、APPI離子源正、負(fù)離子檢測模式對(duì)20例健康人的血清樣品進(jìn)行了LCMS譜分析， 典型色譜圖見圖3， 同一樣品在不同離子源條件下的LCMS總離子流色譜圖具有明顯差異。ESI離子源對(duì)不同保留時(shí)間的脂類代謝物均有良好的響應(yīng)。APCI和APPI離子源檢測獲得的色譜峰在保留時(shí)間8～13 min的區(qū)域強(qiáng)度較低， 這與這一區(qū)域的化合物主要是磷脂類代謝物有關(guān)。在保留時(shí)間15～18 min的區(qū)域（主要是甘油三酯、固醇酯和異戊烯醇脂類）， ESI、APCI和APPI離子源均具有良好的響應(yīng)。這些結(jié)果與之前采用對(duì)照品分析獲得的結(jié)果一致。

為了進(jìn)一步比較3種離子源對(duì)血清中脂類成分檢測的適用性， 我們對(duì)LCMS分析獲得的色譜峰進(jìn)行了提取， 比較了各種離子源所能檢測到的色譜峰的數(shù)目以及每種離子源所檢測到的特有色譜峰和共有峰（圖4）。從圖4可見， 正離子模式下3種離子源檢測到色譜峰的總數(shù)為1684個(gè)， ESI、APCI、APPI離子源分別檢測到1445， 274， 613個(gè)色譜峰， 分別為色譜峰總數(shù)的86%、 16%、 36%； 負(fù)離子模式下3種離子源檢測到色譜峰的總數(shù)為822個(gè)， ESI， APCI， APPI離子源分別檢測到762， 91， 122個(gè)色譜峰， 分別占色譜峰總數(shù)的93%、 11%、 15%。（+）ESI和（+）APPI檢測到的色譜峰數(shù)目占到3種離子源正離子模式下檢測到色譜峰總數(shù)目的99%， （-）ESI和（-）APPI檢測到的色譜峰數(shù)占3種離子源負(fù)離子模式下檢測到色譜峰總數(shù)的98%。APCI離子源在正負(fù)離子模式下檢測到的色譜峰數(shù)目均少于APPI離子源， 其中大多數(shù)共有峰的響度強(qiáng)度均低于APPI離子源。上述結(jié)果表明， ESI離子源對(duì)血清中脂類代謝物檢測的覆蓋范圍最大， 其次是APPI離子源， APCI離子源的檢測能力最弱。