喬天陽 劉文蘭 王文娟 王程 孟月

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一貫煎及骨髓間充質(zhì)干細胞對肝纖維化大鼠陰虛證表征影響的實驗研究

喬天陽 劉文蘭 王文娟 王程 孟月

目的 觀察骨髓間充質(zhì)干細胞在一貫煎的作用下對肝纖維化大鼠陰虛證的影響并探討該過程的發(fā)生機制。方法 將54只SD大鼠隨機分為6組，即正常對照組、模型組、陽性對照組、骨髓干細胞組、骨髓干細胞一貫煎組及一貫煎治療組。除正常對照組外，其他5組建立CCl4誘導的肝纖維化模型。造模停止第三天，骨髓干細胞組及骨髓干細胞一貫煎組經(jīng)尾靜脈注射骨髓間充質(zhì)干細胞。一貫煎組及骨髓干細胞一貫煎組給予一貫煎濃縮液灌胃，模型組、正常組灌服生理鹽水，陽性組給予秋水仙堿灌胃，每天一次，一共給藥4周，給藥期間每周測量大鼠體質(zhì)量、體溫、血流速度、飲水量。4周后取材，將pH試紙置于大鼠舌面20秒，測量前后重量變化，判定大鼠舌面干濕度；通過HE染色和馬松染色評價肝臟炎癥活動度和纖維化程度；通過苦味酸—天狼星紅染色評判造模大鼠肝組織細胞膠原面積比；通過熒光示蹤評判骨髓間充質(zhì)干細胞在肝纖維化大鼠肝組織中的表達。結(jié)果 (1)一貫煎加骨髓間充質(zhì)干細胞組的炎癥活動度和纖維化程度明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；(2)肝纖維化大鼠有陰虛證的表征，一貫煎和骨髓間充質(zhì)干細胞可以改善大鼠陰虛證的癥狀。(3)中藥組、骨髓間充質(zhì)干細胞組、中藥加骨髓間充質(zhì)干細胞組和陽性組體重增長均明顯高于模型組(P<0.05)；一貫煎加骨髓間充質(zhì)干細胞組大鼠舌重較骨髓間充質(zhì)干細胞組較模型組增高(P<0.05)；模型組舌面溫度為較正常組明顯增高(P<0.05)；一貫煎加骨髓間充質(zhì)干細胞組與模型組相比較明顯降低(P<0.05)；一貫煎加骨髓間充質(zhì)干細胞組舌血流速度與模型組相比較降低更為明顯(P<0.05)；一貫煎加骨髓間充質(zhì)干細胞組大鼠飲水量與模型組相比較明顯降低(P<0.05)。(4)一貫煎組、陽性對照組、骨髓間充質(zhì)干細胞組和一貫煎加骨髓間充質(zhì)干細胞組的膠原面積比明顯低于模型組(P<0.05)。(5)一貫煎加骨髓間充質(zhì)干細胞組的骨髓間充質(zhì)干細胞熒光面積與骨髓間充質(zhì)干細胞組相比較明顯增高(P<0.05)。結(jié)論 骨髓間充質(zhì)干細胞可以改善肝纖維化大鼠的陰虛證表征，而一貫煎通過促進骨髓間充質(zhì)干細胞向肝組織轉(zhuǎn)移而增強骨髓間充質(zhì)干細胞對肝纖維化大鼠陰虛證表征的改善作用。

陰虛證； 肝纖維化； 一貫煎； 骨髓間充質(zhì)干細胞

肝纖維化是指肝組織內(nèi)細胞外基質(zhì)成分過度增生與異常沉積導致肝臟結(jié)構(gòu)和功能異常的病理變化[1]，肝纖維化的逆轉(zhuǎn)是肝病治療的重要環(huán)節(jié)[2]。一貫煎記載于《續(xù)名醫(yī)類案》，具有滋陰疏肝的功效，是臨床治療肝腎陰虛的代表方劑。本課題組前期研究表明[3-4]，肝纖維化大鼠具有陰虛證的特點，一貫煎不僅可以改善肝組織病理，還可以改善陰虛證的癥狀，且對骨髓間充質(zhì)干細胞逆轉(zhuǎn)肝纖維化有促進作用。本實驗制備CCl4致肝纖維化大鼠模型，觀察該模型大鼠陰虛證表征，探討一貫煎對促進骨髓間充質(zhì)干細胞逆轉(zhuǎn)肝纖維化的作用原理。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

Sprague-Dawlay大鼠，雄性，體質(zhì)量180～220 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，合格證號SCXK(京)2006-0008，共54只，飼養(yǎng)在首都醫(yī)科大學實驗動物科學部SPF級動物室，自由飲食，室溫18～23℃，濕度為(20.0±3.0)%。

1.2 藥物及試劑

一貫煎濃縮液：根據(jù)一貫煎原方藥物劑量和比例，選取北京同仁堂藥店的標準中藥北沙參9 g、麥冬9 g、當歸9 g、生地黃20 g、枸杞子12 g、川楝子4.5 g，將飲片置煎煮容器內(nèi)，加相當于藥材量5～7倍的冷水浸泡1～2小時，煮沸30分鐘，過濾。藥渣加3～5倍量水繼續(xù)煎煮，煮沸20分鐘，過濾。合并2次濾液。冷卻裝入滅菌藥瓶，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

CCl4分析純專用試劑(純度≥99.5%，北京現(xiàn)代東方精細化學品有限公司，批號：140611)；邁薩維諾特級初榨橄欖油(希臘艾美可油脂有限公司，批號：14015)，配成50%濃度；秋水仙堿(西雙版納版納藥業(yè)有限責任公司生產(chǎn)，批號：140521)，大鼠劑量依據(jù)成人用量的30倍(即0.25 mg/kg)，使用時以蒸餾水調(diào)制藥液成0.025 g/L。

1.3 儀器

正置熒光顯微鏡(Leica DM4000B，德國)，組織包埋機(LEICA EG1140H，德國)，冰凍切片機(LEICA CM3050s，德國)，石蠟切片機(LEICARM2135，德國)，圖像分析系統(tǒng)(Leica Qwin，德國)，低溫離心機(heraeus，Biofuge 15r)。

1.4 方法

1.4.1 分組與造模 將54只大鼠隨機分為6組，即正常對照組、模型組、陽性對照組、骨髓干細胞組、骨髓干細胞一貫煎組及一貫煎治療組，每組9只。適應性飼養(yǎng)1周后，模型組、陽性對照組、骨髓干細胞組、骨髓干細胞一貫煎組及一貫煎治療組大鼠予腹腔注射50% CCl4橄欖油溶液(0.2 mL/100 g)造模，每周2次，共2周；于第三周開始腹腔注射0.1 mL/100 g的CCl4橄欖油溶液，每周2次，共2周；于第五周開始腹腔注射0.05 mL/100 g的CCl4橄欖油溶液，每周2次，共2周；同時，正常對照組腹腔注射等量橄欖油。

1.4.2 給藥方法 在CCl4停止注射后3天，骨髓干細胞組、骨髓干細胞一貫煎組每只動物經(jīng)尾靜脈注射1 mol濃度為5×106mmol/L的骨髓間充質(zhì)干細胞；一貫煎治療組、骨髓干細胞一貫煎組給予一貫煎濃縮液2 mL/200 g灌胃，1次/天，連續(xù)4周；陽性對照組給予秋水仙堿灌胃(0.25 mg/kg)，1次/天，連續(xù)給藥4周。正常對照組和模型組按相同方法灌服等量生理鹽水。

1.4.3 骨髓間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng) 另取SD大鼠2只，雄性，120 g左右，脫頸處死，酒精浸泡消毒，分離脛骨，于超凈臺使用完全培養(yǎng)基沖洗骨髓腔，過濾，將元代骨髓干細胞置于37℃培養(yǎng)箱中，細胞濃度達到80%時傳代，將第四代骨髓間充質(zhì)干細胞標記熒光。置于培養(yǎng)箱過夜后，經(jīng)胰酶消化至細胞終濃度，濃度為5×106mmol/L，經(jīng)尾靜脈注射。

1.4.4 取材方法 收集血清、肝臟標本待用：大鼠以10%水合氯醛0.35 mL/100 g的劑量腹腔注射麻醉后，仰臥位固定，打開腹腔，觀察肝臟的色、質(zhì)、形態(tài)和體積，拍照，測量肝、舌的微循環(huán)。經(jīng)腹主動脈采血，3500 rpm離心15分鐘，取上清1 mL分裝，-80℃保存?zhèn)溆谩７蛛x肝臟，稱重，取肝左葉同一部位，放入4%多聚甲醛溶液中固定6～8小時，然后入20%蔗糖溶液中，進行冰凍切片，于正置位顯微鏡(Lecia DM4000B)430 nm波長下進行觀察。石蠟包埋，HE染色，切片。取肝剩余組織分裝置于凍存管，迅速投入液氮中保存，隨后放于-80℃低溫冰箱冷藏。

1.4.5 肝臟炎癥活動度和纖維化程度 于取材后將肝組織石蠟包埋，切片進行HE染色，依據(jù)2000年第十次全國病毒性肝炎及肝病學術(shù)會議制定的慢性肝炎分級標準，對樣本的肝炎活動度和纖維化程度進行病理分級。

1.4.6 大鼠陰虛證表征指標檢測 每周測量一次大鼠體重，記錄大鼠體重增加趨勢；于取材當天測量大鼠舌面干濕度、體溫、血流速度、飲水量。

1.4.7 膠原面積比較 將石蠟包埋的組織切片進行苦味酸—天狼星紅染色，通過膠原面積評比，判定各組樣本的纖維化程度。

1.4.8 骨髓間充質(zhì)干細胞在肝組織中的表達 肝組織于冷箱切片機冰凍切片，于熒光顯微鏡下觀察骨髓間充質(zhì)干細胞。使用Leica DM4000B正置熒光顯微鏡，經(jīng)Leica QWin圖像分析系統(tǒng)處理，測量20倍鏡下骨髓間充質(zhì)干細胞分布。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝臟病理組織炎癥分級、纖維分期結(jié)果比較

各組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，并做組間兩兩比較。模型組肝組織與正常組對照比較，炎癥活動度、纖維化程度差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示肝纖維化大鼠模型造模成功。一貫煎組、骨髓干細胞組與模型組相比較纖維化程度有所降低(P>0.05)。一貫煎加骨髓干細胞組與模型組相比較肝纖維化程度明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。提示一貫煎及骨髓干細胞均能改善肝纖維化大鼠肝組織的炎癥程度和纖維化程度，而二者相互配合改善效果最為明顯。詳見表1、圖1。

表1 各組大鼠肝組織炎癥活動度、纖維化程度變化趨勢比較

注： 與正常組相比較，aP<0.05；與模型組相比較bP<0.05。

圖1 各組大鼠肝組織HE染色(×200)

2.2 體質(zhì)量變化趨勢

各組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，并做組間兩兩比較。模型組大鼠體持量增長較正常組明顯降低，有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。四個給藥組體質(zhì)量增長均明顯高于模型組；第十周，模型組體質(zhì)量明顯低于四個給藥組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。提示一貫煎及骨髓干細胞可增加肝纖維化大鼠的體重。詳見表2。

2.3 大鼠陰虛證表征指標比較

各組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，并做組間兩兩比較。

舌面干濕度：模型組較正常組明顯降低(P<0.05)，提示大鼠出現(xiàn)口干癥狀。與模型組相比較，四個給藥組舌面干濕度均增高(P<0.05)，其中一貫煎加骨髓干細胞組增加最為明顯，提示一貫煎及骨髓間充質(zhì)干細胞均可緩解模型大鼠口干癥狀，而一貫煎加骨髓間充質(zhì)干細胞效果更明顯。詳見表3。

舌血流速度：模型組舌血流速度較正常組明顯增高(P<0.05)，提示肝纖維化大鼠模型血流速度偏快。陽性對照組、一貫煎組和一貫煎加骨髓間充質(zhì)干細胞組較模型組降低(P<0.05)，其中一貫煎加骨髓間充質(zhì)干細胞舌血流速度降低較為明顯，提示一貫煎及骨髓間充質(zhì)干細胞均可以降低血流速度，而一貫煎加骨髓間充質(zhì)干細胞對模型大鼠的血流速度改善效果更好。詳見表3。

舌面溫度：模型組與正常組相比較明顯增高(P<0.05)，提示肝纖維化大鼠模型體溫偏高。一貫煎組和一貫煎加骨髓間充質(zhì)干細胞組舌面溫度與模型組相比較明顯降低(P<0.05)，骨髓間充質(zhì)干細胞組與模型組相比較有所降低(P>0.05)，提示骨髓間充質(zhì)干細胞均對模型大鼠陰虛內(nèi)熱癥狀有所改善，而一貫煎加骨髓間充質(zhì)干細胞對模型大鼠陰虛內(nèi)熱的癥狀緩解最為明顯。詳見表3。

表2 各組大鼠體重增長比較

注： 與正常組相比較，aP<0.05；與模型組相比較，bP<0.05。

表3 各組大鼠舌面干濕度、舌面溫度、舌血流速度、飲水量比較

注： 與正常組相比較，aP<0.05；與模型組相比較bP<0.05。

飲水量：模型組大鼠飲水量與正常組相比較無統(tǒng)計學差異(P<0.05)，結(jié)合大鼠舌面干濕度說明模型組大鼠雖口干但飲水量并無增加，出現(xiàn)口干不欲飲的癥狀，一貫煎加骨髓間充質(zhì)干細胞組大鼠飲水量與模型組大鼠相比明顯降低(P>0.05)，結(jié)合舌面干濕度情況觀察提示一貫煎加骨髓間充質(zhì)干細胞可以緩解大鼠口干癥狀，故飲水量減少。詳見表3。

2.4 各組大鼠膠原面積的纖維化比較

各組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，并做組間兩兩比較。與正常組相比，模型組膠原面積比明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明肝纖維化大鼠模型建立成功。四個給藥組的膠原面積比明顯低于模型組(P<0.05)，說明一貫煎、骨髓干細胞和一貫煎加骨髓干細胞均對逆轉(zhuǎn)肝纖維化有一定的促進作用。見圖2、表4。

表4 各組大鼠肝組織天狼星紅染色膠原面積比比較

注： 與正常組相比較，aP<0.05；與模型組相比較,bP<0.05。

2.5 骨髓間充質(zhì)干細胞在肝組織中表達的比較

各組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，并做組間兩兩比較。中藥加骨髓干細胞組熒光面積明顯大于骨髓干細胞組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見圖3、表5。

圖3 骨髓間充質(zhì)干細胞組和一貫煎加骨髓間充質(zhì)干細胞組大鼠肝組織中骨髓間充質(zhì)干細胞熒光示蹤

表5 骨髓間充質(zhì)干細胞在大鼠肝組織中的分布面積比較

分組分布面積(平方微米)骨髓間充質(zhì)干細胞組634．22±215．78一貫煎加骨髓間充質(zhì)干細胞組1138．18±591．36a

注： 與骨髓間充質(zhì)干細胞組相比較，aP<0.05。

3 討論

“肝纖維化”一詞于中醫(yī)學中并無敘述，但可以據(jù)其臨床表現(xiàn)歸屬于中醫(yī)“痞積”“臌脹”“脅痛”“肝積”等范疇之內(nèi)。病因病機一般認為是肝腎陰虛，濕熱之邪入侵，而致血行不利，瘀阻脈絡，從而造成肝臟出現(xiàn)纖維化的表現(xiàn)，屬于正虛邪盛，而“濕”“熱”“瘀”“痰”毒等諸邪結(jié)于肝，最終形成肝硬化、甚至肝癌。

大量實驗研究證實，動物模型證候表征存在較為成熟的評價方法。對于大鼠大量的體征和癥狀變化的觀察與研究，包括了大鼠活動減少、食欲不振、消瘦、畏寒喜暖、倦怠、精神萎靡、體溫變化、心率變化、便溏等。這些表征在一定程度上反應了動物的證候類型，成為證候模型評價的重要指標[5-8]。前期研究表明，CCl4誘導的肝纖維化大鼠模型具有體重減輕、口干尿黃等陰虛證的典型癥狀[9]。而著名方劑“一貫煎”是由清代名醫(yī)魏玉橫所創(chuàng)，記于《續(xù)名醫(yī)類案》，用于治療肝腎陰虛所致的口干咽燥，頭暈目眩，脅肋隱痛，遇勞加重，腰膝酸軟，舌紅少津，脈弦細數(shù)等癥，是滋陰疏肝的著名方劑。一貫煎在保護肝臟細胞、減輕肝臟損傷、調(diào)節(jié)肝組織膠原代謝等方面均有顯著作用[10]，并且可以改善陰虛證的癥狀。在肝損傷時，骨髓間充質(zhì)干細胞能夠向肝臟受損部位遷移并對肝損傷有修復的作用[11]。實驗研究證明，來源于骨髓的間充質(zhì)干細胞具有向肝系細胞分化的潛能，并可降低肝臟纖維化程度，逆轉(zhuǎn)病程[12]。進一步研究表明，骨髓間充質(zhì)干細胞所分泌基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9對膠原有降解作用，從而可以減少肝纖維化過程中膠原的沉積[13]。亦有實驗表明，一貫煎能夠促進骨髓間充質(zhì)干細胞向肝組織轉(zhuǎn)移，從而改善肝功能、減輕炎癥、逆轉(zhuǎn)肝纖維化[14-15]。

本實驗研究制備肝纖維化大鼠模型，觀察一貫煎在骨髓間充質(zhì)干細胞向肝組織轉(zhuǎn)移的過程中對肝纖維化大鼠陰虛證表征的影響。研究結(jié)果提示，骨髓間充質(zhì)干細胞確有減輕肝組織炎癥程度和纖維化程度、改善陰虛證相關表征作用，其對模型大鼠體重(消瘦)、舌面干濕度(口干)、舌血流速度(脈數(shù))、舌面溫度(身熱)及飲水(津液損傷)各方面均有所改善，而一貫煎對骨髓間充質(zhì)干細胞改善模型大鼠陰虛證表征的過程有明顯的促進作用，并通過天狼星紅染色及熒光示蹤證實一貫煎促進骨髓間充質(zhì)干細胞向肝組織轉(zhuǎn)移，進一步提示一貫煎有促進骨髓間充質(zhì)干細胞改善肝纖維化大鼠陰虛證表征的作用。

綜上所述，本研究結(jié)果提示：骨髓間充質(zhì)干細胞在改善肝組織的病理，緩解肝纖維化大鼠陰虛證癥狀方面確有作用，而一貫煎在此過程中起到了促進作用。該研究為進一步從細胞及分子層面探討一貫煎是否促進骨髓間充質(zhì)干細胞逆轉(zhuǎn)肝纖維化提供了新的理論依據(jù)。

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(本文編輯： 王馨瑤)

Experimental study on the effect ofYiguanjianand bone marrow mesenchymal stem cells on the expression ofyindeficiency syndrome in rats with hepatic fibrosis

QIAOTianyang,LIUWenlan,WANGWenjuan,etal.

SchoolofTraditionalChineseMedicine,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China

LIUWenlan,E-mail：wenlanliu1900@126.com

Objective To observe the effect ofYiguanjianon bone marrow mesenchymal stem cells on theyindeficiency syndrome in rats with liver fibrosis, and to explore the mechanism of the process.Methods 54 male Sprague-Dawlay rats were divided into normal group, model group, positive group, bone marrow mesenchymal stem cells group,Yiguanjianand bone marrow mesenchymal stem cells group andYiguanjiangroup. In addition to the normal group, hepatic fibrosis model was induced by CCl4. After third day of modeling, bone marrow stem cells group andYiguanjianand bone marrow stem cells group was injected with bone marrow mesenchymal stem cells.Yiguanjiangroup andYiguanjianand bone marrow stem cells group was intragastric administration withYiguanjian(2 mL/200 g),1 time/d. Model group and normal group was intragastric administration with normal saline. Positive group was intragastric administration with colchicine. The weight changes before and after was measured to determine the humidity of rat tongue. The body weight, temperature, amount of blood flow velocity, water intake was measured of rats weekly. After 4 weeks, the pH test strips was put at the rat tongue for 20 seconds; HE staining staining was used to evaluate the activity of liver inflammation and the degree of fibrosis; picric acid - Sirius red staining was used to evaluate area ratio of liver tissue collagen; fluorescence tracer was used to evaluate the expression of bone marrow mesenchymal stem cells in rat liver tissue. Results (1) Compared with the model group, the inflammatory activity and the degree of fibrosis was significantly lower than theYiguanjianand bone marrow mesenchymal stem cells group. The difference was statistically significant (P<0.05). (2) The liver fibrosis rats had characterization ofyindeficiency syndrome,Yiguanjianand bone marrow mesenchymal stem cells can improve the symptoms ofyindeficiency syndrome.(3) Weight gain ofYiguanjiangroup, bone marrow mesenchymal stem cells group,Yiguanjiancombined with bone marrow mesenchymal stem cells group and positive group was significantly higher than that of model group (P<0.05);Yiguanjiancombined with bone marrow mesenchymal stem cells in rats with tongue bone marrow mesenchymal stem cells group was higher than that of model group (P<0.05); the temperature on the surface of tongue of model group was significantly higher than the normal group (P<0.05). Compared with the model group, theYiguanjianand bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) were significantly lower (P<0.05); blood flow velocity of tongue ofYiguanjianand bone marrow mesenchymal stem cells group was decreased significantly compared with the model group(P<0.05); water intake ofYiguanjianand bone marrow mesenchymal stem cells group was significantly decreased compared with the model group (P<0.05). (4) Area ratio of liver tissue collagen ofYiguanjiangroup, positive control group, the bone marrow mesenchymal stem cells group andYiguanjianand bone marrow mesenchymal stem cells groups was significantly lower than that of the model group (P<0.05). (5) Fluorescent area of mesenchymal stem cells ofYiguanjianand bone marrow mesenchymal stem cells group was increased significantly compared with bone marrow mesenchymal stem cells group (P<0.05). Conclusion Bone marrow mesenchymal stem cells can improve the characteristic ofyindeficiency syndrome of liver fibrosis in rats, andYiguanjiancan promote bone marrow mesenchymal stem cells transfer into liver to improve the syndrome ofyindeficiency in rats with hepatic fibrosis

Yindeficiency syndrome; Liver fibrosis;Yiguanjian; Bone marrow mesenchymal stem cells

國家自然科學基金(81573879)；首都中醫(yī)藥研究專項重點課題(15ZY03)

100069 北京，首都醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院[喬天陽(碩士研究生)、劉文蘭、王文娟、孟月(碩士研究生)、王程(碩士研究生)]

喬天陽(1991- )，女，2014級在讀碩士研究生。研究方向：肝纖維化中醫(yī)證候病理的研究。E-mail：qiao.tianyang@163.com

劉文蘭(1968- )，女，博士，副教授，碩士生導師。研究方向：慢性肝炎中醫(yī)證候病理基礎的研究。E-mail：wenlanliu1900@126.com

R259

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.04.009

2016-11-13)