穆凌云 李金霞 張秋云 陳煜 高連印 杜宇瓊

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截?cái)嗄嫱旆綄?duì)慢加急性肝衰竭大鼠死亡受體途徑的影響

穆凌云 李金霞 張秋云 陳煜 高連印 杜宇瓊

目的 觀察“截?cái)嗄嫱旆健睂?duì)慢加急性肝衰竭大鼠JNK信號(hào)通路死亡受體途徑的影響。方法 SPF級(jí)Wistar雄性大鼠70只，隨機(jī)分為正常組、模型組、截?cái)嗄嫱旆浇M和SP600125組，各組大鼠給予豬血清腹腔注射13周，聯(lián)合D氨基半乳糖/脂多糖(D-galactosamine/lipopolysaccharide,D-GalN/LPS)急性攻擊，構(gòu)建慢加急性肝衰竭大鼠模型，截?cái)嗄嫱旆浇M在急性攻擊前給予截?cái)嗄嫱旆竭B續(xù)灌胃3天，SP600125組于急性攻擊前半小時(shí)腹腔注射。各組大鼠均在急性攻擊后4、8、12小時(shí)平行取材。用免疫組化法(Immunohistochemical detection,IHC)檢測(cè)肝組織中半胱氨酸蛋白酶-8(Cysteine Proteinase-8,Caspase-8)、Caspase-3、脂肪酸合成酶(Fatty acid synthase ,Fas)的表達(dá)量，用蛋白印跡法(Western Blot,WB)檢測(cè)肝組織中Fas配體(Fas ligand,FasL)的表達(dá)量。結(jié)果 與正常組相比，模型組各時(shí)間點(diǎn)Caspase-3、Caspase-8、Fas、FasL表達(dá)增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，截?cái)嗄嫱旆浇M及SP600125組在4小時(shí)和8小時(shí)表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)，12小時(shí)較模型組升高，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 截?cái)嗄嫱旆娇梢杂行Ы档虲aspase-3、Caspase-8、Fas、FasL的表達(dá)量，阻斷死亡受體途徑，減少模型大鼠肝細(xì)胞凋亡。

慢加急性肝衰竭； 截?cái)嗄嫱旆剑?細(xì)胞凋亡； 死亡受體途徑

慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure，ACLF)是在慢性肝病的基礎(chǔ)上，較短時(shí)間內(nèi)發(fā)生急性或亞急性肝功能失代償?shù)呐R床癥候群[1]。細(xì)胞凋亡又稱(chēng)程序性細(xì)胞死亡，是維持生物體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和保證機(jī)體正常發(fā)育的主動(dòng)死亡進(jìn)程[2]，過(guò)度細(xì)胞凋亡可以導(dǎo)致肝組織細(xì)胞大量死亡，并破壞其生理結(jié)構(gòu)及功能。作為參與細(xì)胞凋亡的重要信號(hào)傳導(dǎo)途徑之一，死亡受體途徑的傳導(dǎo)機(jī)制是細(xì)胞表面的死亡受體接受胞外信號(hào)，經(jīng)由胞質(zhì)內(nèi)的死亡結(jié)構(gòu)域(death domain，DD)進(jìn)一步傳遞，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究通過(guò)觀察截?cái)嗄嫱旆綄?duì)ACLF模型大鼠肝組織半胱氨酸蛋白酶-8(Cysteine proteinase-8，Caspase-8)、Caspase3、脂肪酸合成酶(Fatty acid synthase,Fas)及Fas配體(Fas ligard,FasL)表達(dá)的影響，探討該方對(duì)肝細(xì)胞凋亡的部分作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Wistar雄性大鼠70只，SPF級(jí)，體質(zhì)量(180～200) g，購(gòu)于中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物房SPF級(jí)飼養(yǎng)，每籠三只，不控制水食，室溫18～23℃，濕度為(50.0±2.0)%，每隔12小時(shí)開(kāi)燈照明。

1.2 主要試劑

豬血清(北京平睿生物有限公司，批號(hào)：20140713)；D-GalN(Inalco，批號(hào)：P29/14/221)；LPS(Sigma，批號(hào)：109K4075)；小鼠超敏二步法試劑盒(中杉金橋，批號(hào)：PV-9005)，兔二步法檢測(cè)試劑盒(中杉金橋，批號(hào)：PV-9001)，DAB試劑盒(中杉金橋，批號(hào)：ZLI-9018)；Caspase-8 p18 antibody(Santa Cruz，批號(hào)：sc-5263)；Caspase-3(P12) antibody(普益華，批號(hào)：BA3968)；Anti-Fas antibody(Abcam,批號(hào)：ab82419)；Anti-Fas Ligand antibody(Abcam，批號(hào)：ab15285)；Beta-tubulin rabbit polyclonal antibody(Proteintech，批號(hào)：10094-1-AP)，Beta-actin rabbit polyclonal ntibody(CST，批號(hào)：4967S)；封閉用羊血清原液(中杉金橋，批號(hào)：ZLI-9021)；RegeRuler Prestained Protein Ladder(Fermentas，批號(hào)：26616)。

1.3 主要藥物

截?cái)嗄嫱旆浇M成：苦味葉下珠30 g、瓜蔞30 g、金錢(qián)草30 g、生黃芪30 g、槲寄生30 g、三七6 g、莪術(shù)6 g、丹參20 g、生地黃20 g、黑附片15 g，藥材購(gòu)自北京同仁堂藥店，濃煎，生藥量為4.34 g/mL，4℃保存?zhèn)溆?，使用?7℃水浴加熱。

1.4 主要儀器

Eclipse 80i共聚焦熒光顯微鏡(Nikon)；Universal 320R低溫離心機(jī)(Hettich)；1-14高速離心機(jī)(Sigma)；F6/10超細(xì)勻漿器(Fluko)；Model680酶標(biāo)儀(Bio-Rad)；165-8003垂直電泳儀(Bio-Rad)；電泳電源(Bio-rad，Powerpac universal power supply 164-5070)；170-3930濕轉(zhuǎn)電轉(zhuǎn)儀(Bio-Rad)；Odysseey2.1紅外熒光掃描成像系統(tǒng)(LI-COR)；EM-1400高襯度投射電子顯微鏡(JEOL)。

教育是未來(lái)的事業(yè)，兒童是民族的未來(lái)。教師要把一個(gè)不懂事的孩子培養(yǎng)成國(guó)家的棟梁，民族的脊梁，要付出畢生的精力。教師工作是平凡的，每天上課下課、備課、批改作業(yè)，為學(xué)生解惑排難；但教師的職業(yè)又是偉大的，教師要把兒童這個(gè)幼苗培育成參天大樹(shù)。古人說(shuō)：“十年樹(shù)木，百年樹(shù)人?！闭f(shuō)明創(chuàng)造物質(zhì)是比較容易的，塑造人、鑄造人的精神是要經(jīng)過(guò)幾代人的努力。因此，教師要滿(mǎn)懷對(duì)學(xué)生的真心關(guān)愛(ài)，以學(xué)生的發(fā)展為本，甘為人梯，樂(lè)于奉獻(xiàn)，用心靈和汗水一點(diǎn)一滴地滋潤(rùn)學(xué)生的心田，把全部精力和滿(mǎn)腔熱情獻(xiàn)給教育事業(yè)。

1.5 方法

1.5.1 大鼠模型的建立ACLF大鼠模型建立方法 (1)免疫階段：Wistar雄性大鼠70只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組6只和處理組64只，處理組腹腔注射豬血清每次一只、一周兩次注射0.5 mL，正常組大鼠注射等量生理鹽水，共13周，造模過(guò)程中無(wú)死亡。于13周末隨機(jī)抽取1只處理組大鼠處死，取肝組織做病理觀察，根據(jù)《肝纖維化中西醫(yī)結(jié)合診療指南》[3]判定免疫型肝纖維化造模是否成功。造模成功后，將處理組隨機(jī)分為模型組、截?cái)嗄嫱旆浇M及SP600125組，各21只。(2)急性攻擊階段：模型組、截?cái)嗄嫱旆浇M及SP600125組同時(shí)給予D-GalN 800 mg/kg聯(lián)合LPS 100 μg/kg腹腔注射造成急性攻擊，建立ACLF模型。

1.5.2 分組與給藥方法 急性攻擊前，截?cái)嗄嫱旆浇M給予截?cái)嗄嫱旆綕饪s液21.7 g/(kg·d)連續(xù)灌胃三天，正常組及模型組給予同等劑量生理鹽水灌胃。各組大鼠分別于急性攻擊4小時(shí)、8小時(shí)、12小時(shí)進(jìn)行平行取材，每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)7只。大鼠麻醉后腹主動(dòng)脈取血，摘取肝右葉同一部分置于10%福爾馬林溶液固定，余下部分于液氮中快速凍存。

1.5.3 IHC法檢測(cè)肝組織中Caspase-3、Caspase-8、Fas蛋白的表達(dá) 10%福爾馬林固定肝組織后進(jìn)行石蠟包埋、切片，常規(guī)脫蠟、水化，微波抗原修復(fù)，10%正常羊血清封閉1小時(shí)，Caspase-3多克隆抗體(1∶50)、Caspase-8多克隆抗體(1∶200)、Fas多克隆抗體(1∶50)4℃過(guò)夜孵育，PBS洗滌后滴加HRP標(biāo)記二抗37℃孵育1小時(shí)，Caspase-3、Caspase-8、FasDAB分別顯色2分鐘、4分鐘、90秒，蘇木素復(fù)染。每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀察三張切片，隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野進(jìn)行拍攝，并運(yùn)用NIKON NIS-Elements BR軟件進(jìn)行陽(yáng)性表達(dá)的標(biāo)示及積分光密度值(IOD)檢測(cè)。

1.5.4 WB法檢測(cè)肝組織中FasL蛋白的表達(dá) 取出凍存肝組織樣品，在冰上操作，每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取5支進(jìn)行勻漿、蛋白定量，按照蛋白定量試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟測(cè)定蛋白濃度。每支上樣蛋白84 μg，經(jīng)10%SDS-聚丙烯凝膠電泳分離后300 mA電轉(zhuǎn)1小時(shí)至0.22 μm NC膜上，5%脫脂奶粉封閉1小時(shí)，F(xiàn)asL抗體(1∶500)4℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌，加山羊抗兔二抗(1∶5000)室溫孵育1小時(shí)，紅外熒光掃描成像系統(tǒng)Oddsey掃膜。以β-actin作為參照蛋白，使用ImageJ2x軟件獲得目的蛋白條帶的灰度值，通過(guò)灰度比較的方法來(lái)確定目的蛋白相對(duì)于內(nèi)參的表達(dá)量，以分析樣本之間目的蛋白表達(dá)量差異。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

Caspase-3被染成棕褐色，在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)。與正常組相比，模型組各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)增多，4小時(shí) Caspase-3表達(dá)明顯增多，隨著時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增多，8小時(shí)達(dá)到高峰，12小時(shí)較前減少，經(jīng)LSD檢驗(yàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組相比，在4、8小時(shí)截?cái)嗄嫱旆浇M及SP600125組Caspase-3蛋白表達(dá)明顯降低，經(jīng)LSD檢驗(yàn)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而12小時(shí)其表達(dá)經(jīng)LSD檢驗(yàn)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05); 同時(shí)Caspase-3蛋白表達(dá)減少，證明截?cái)嗄嫱旆娇梢杂行p慢細(xì)胞凋亡的進(jìn)程，抑制蛋白表達(dá)，減少肝細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制與JNK抑制劑SP600125相似。詳見(jiàn)表1、圖1。

表1 各組大鼠Caspase-3表達(dá)IOD值比較

注： 與正常組比較，aP<0.05，與對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)模型組比較，bP<0.05，cP<0.01；與同一處理組前一時(shí)間點(diǎn)比較，dP<0.01。

注：A.正常組；B.截?cái)嗄嫱旆?小時(shí)組；C.模型4小時(shí)組； D.SP600125 4小時(shí)組；E.截?cái)嗄嫱旆?小時(shí)組； F.模型8小時(shí)組；G.SP600125 8小時(shí)組；H.截?cái)嗄嫱旆?2小時(shí)組； I.模型12小時(shí)組；J.SP600125 12小時(shí)組

圖1 免疫組化法檢測(cè)大鼠肝組織Caspase-3蛋白表達(dá)(×200)

2.2 截?cái)嗄嫱旆綄?duì) ACLF 大鼠肝組織Caspase-8蛋白表達(dá)的影響

Caspase-8被染成棕褐色，在細(xì)胞核表達(dá)。與正常組相比，模型組4小時(shí)Caspase-8表達(dá)明顯增多，隨著時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)逐漸增多，至8小時(shí)達(dá)到高峰，12小時(shí)表達(dá)則較前減少，經(jīng)LSD檢驗(yàn)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)明顯差異(P<0.01)；與4、8小時(shí)模型組相比，截?cái)嗄嫱旆浇M及SP600125組Caspase-8蛋白表達(dá)明顯降低，經(jīng)Tamhane’s T2檢驗(yàn)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，至12小時(shí)表達(dá)略高，整體趨勢(shì)隨著時(shí)間的推移而逐漸升高。提示截?cái)嗄嫱旆娇梢砸种艭aspase-8的表達(dá)，其作用同JNK抑制劑SP600125相似。詳見(jiàn)表2、圖2。

表2 各組大鼠Caspase-8表達(dá)IOD值比較

注：與同一時(shí)間點(diǎn)模型組比較，aP<0.01；與同一時(shí)間點(diǎn)正常組比較，bP<0.05、cP<0.01；與同一處理組上一時(shí)間點(diǎn)比較，dP<0.01。

注：A.正常組；B.截?cái)嗄嫱旆?小時(shí)組；C.模型4小時(shí)組； D.SP600125 4小時(shí)組；E.截?cái)嗄嫱旆?小時(shí)組； F.模型8小時(shí)組；G.SP600125 8小時(shí)組；H.截?cái)嗄嫱旆?2小時(shí)組；I.模型12小時(shí)組；J.SP60012512小時(shí)組

圖2 免疫組化法檢測(cè)大鼠肝組織Caspase-8蛋白表達(dá)(×200)

注：A.正常組；B.截?cái)嗄嫱旆?小時(shí)組；C.模型4小時(shí)組；D.SP600125 4小時(shí)組；E.截?cái)嗄嫱旆?小時(shí)組；F.模型8小時(shí)組； G.SP600125 8小時(shí)組；H.截?cái)嗄嫱旆?2小時(shí)組；I.模型12小時(shí)組；J.SP600125 12小時(shí)組

圖3 免疫組化法檢測(cè)大鼠肝組織Fas蛋白表達(dá)(×200)

2.3 截?cái)嗄嫱旆綄?duì)ACLF大鼠肝組織Fas蛋白表達(dá)的影響

Fas蛋白被染成棕褐色，在細(xì)胞核表達(dá)。與正常組相比，模型組4小時(shí)Fas表達(dá)明顯增多，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)其表達(dá)逐漸增多，至8小時(shí)達(dá)到高峰，12小時(shí)表達(dá)則較前減少，經(jīng)LSD檢驗(yàn)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組相比，在4、8小時(shí)截?cái)嗄嫱旆浇M及SP600125組Fas蛋白表達(dá)明顯降低，經(jīng)LSD檢驗(yàn)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而至12小時(shí)其表達(dá)則略高于模型組，其表達(dá)隨著時(shí)間的推移呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)。結(jié)果提示截?cái)嗄嫱旆郊癝P600125可以有效抑制FasL蛋白的表達(dá)，減少肝細(xì)胞凋亡，與SP600125作用大致相似。詳見(jiàn)表3、圖3。

表3 各組大鼠Fas表達(dá)IOD值比較

注：與同一時(shí)間點(diǎn)模型組比較，aP<0.01；與同一時(shí)間點(diǎn)正常組比較，bP<0.05、cP<0.01；與同一處理組上一時(shí)間點(diǎn)比較，dP<0.05。

2.4 截?cái)嗄嫱旆綄?duì)ACLF大鼠肝組織FasL蛋白表達(dá)的影響

與正常組相比，模型組4小時(shí)FasL蛋白表達(dá)增多，至8小時(shí)達(dá)到高峰，12小時(shí)表達(dá)減少，經(jīng)LSD檢驗(yàn)具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；截?cái)嗄嫱旆浇M4、8小時(shí)FasL蛋白表達(dá)較模型組少，而12小時(shí)表達(dá)較多，整體呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)。與模型組相比，SP600125組4小時(shí)(P<0.05)、8小時(shí)(P<0.01)FasL蛋白表達(dá)較少，經(jīng)LSD檢驗(yàn)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而12小時(shí)(P>0.05)經(jīng)Tamhane’s T2檢驗(yàn)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，蛋白呈持續(xù)增高表達(dá)。結(jié)果提示截?cái)嗄嫱旆娇梢杂行б种艶asL蛋白的表達(dá)，減少肝細(xì)胞凋亡，作用機(jī)制與SP600125大致相似。

注：A.SP600125 12小時(shí)組； B.模型12小時(shí)組； C.截?cái)嗄嫱旆?2小時(shí)組；D.SP600125 8小時(shí)組；E.模型8小時(shí)組；F.截?cái)嗄嫱旆?小時(shí)組；G.P600125 4小時(shí)組；H.模型4小時(shí)組； I.截?cái)嗄嫱旆?小時(shí)組；J.正常組

圖4 Western Blot法檢測(cè)各組大鼠肝組織FasL蛋白表達(dá)情況

表4 各組大鼠FasL表達(dá)IOD值比較

注：與同一時(shí)間點(diǎn)模型組比較，aP<0.01；與同一時(shí)間點(diǎn)正常組比較，bP<0.05、cP<0.01；與同一處理組上一時(shí)間點(diǎn)比較,dP<0.01。

3 討論

ACLF可在短期內(nèi)出現(xiàn)較高死亡率，28天內(nèi)死亡率可高達(dá)15%[4]，臨床多采用內(nèi)科常規(guī)治療、人工肝及肝移植等措施，但治療效果均不理想。近些年來(lái)，中醫(yī)藥對(duì)ACLF的干預(yù)研究在臨床實(shí)踐和基礎(chǔ)研究方面均取得了很大進(jìn)展，為中醫(yī)藥參與治療并不斷提高療效奠定了良好的基礎(chǔ)。JNK抑制劑SP600125可以對(duì)JNK信號(hào)通路產(chǎn)生特異性地抑制作用，目前已有相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)SP600125可以直接抑制c-Jun磷酸化并且在一定程度上干預(yù)治療動(dòng)物疾病模型[5-6]。據(jù)此，有望為中醫(yī)藥臨床治療ACLF提供新的分子作用靶點(diǎn)。

筆者課題組前期實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明[7-9]：截?cái)嗄嫱旆娇筛纳聘渭?xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷、降低ACLF大鼠死亡率；也可以降低血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、白細(xì)胞介素1β、白細(xì)胞介素6及肝組織腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和腫瘤壞死因子受體(TNFR1)的含量，即可通過(guò)阻斷TNF-α/TNFR1途徑減輕肝細(xì)胞凋亡。肝細(xì)胞凋亡主要通過(guò)兩種途徑介導(dǎo)：線粒體途徑和死亡受體途徑。且李金霞等[10]已證實(shí)截?cái)嗄嫱旆娇梢詼p輕肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷程度以及抑制Bid、CytC蛋白的表達(dá)，與阻斷線粒體途徑有關(guān)。死亡受體途徑又稱(chēng)外源性凋亡途徑，由胞外信號(hào)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，凋亡介導(dǎo)的通路主要有三條[11]：Fas/FasL途徑、TNFR途徑、TRAIL途徑。死亡受體屬于TNFR超家族，已知存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面的至少有8種：TNFR1、TNFR2、Fas、DR3、DR4、DR5、DcR1和DcR2[12]。Fas/FasL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是細(xì)胞表面的Fas蛋白被激活后，啟動(dòng)了Fas配體FasL的表達(dá)，F(xiàn)asL與Fas結(jié)合后，誘導(dǎo)Fas胞內(nèi)的死亡區(qū)形成三聚體并活化，然后募集胞漿內(nèi)Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白，形成并激活死亡信號(hào)復(fù)合物[13]，引起Caspase-8激活，啟動(dòng)下游Caspase蛋白級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此外，Caspase-8還可以激活Bid、Bax等Bcl-2家族蛋白，促進(jìn)Cytc釋放，通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。吳文秀等[14]證實(shí)截?cái)嗄嫱旆娇梢杂行Ы档透渭?xì)胞Caspase-3、Caspase-8表達(dá)量，減輕肝細(xì)胞凋亡和壞死。

本實(shí)驗(yàn)中，與正常組相比，模型組在4～8小時(shí)Fas、FasL、Caspase-3、Caspase-8表達(dá)均呈現(xiàn)逐漸升高趨勢(shì)，提示Fas與FasL結(jié)合，并激活下游Caspase-3、Caspase-8蛋白發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，高峰出現(xiàn)在急性攻擊后8小時(shí)。12小時(shí)Fas、FasL、Caspase-3、Caspase-8表達(dá)均較8小時(shí)降低，但仍高于正常組，這可能與8～12小時(shí)肝細(xì)胞發(fā)生大量死亡有關(guān)，此時(shí)細(xì)胞凋亡活動(dòng)減少。截?cái)嗄嫱旆浇M及SP600125組在4小時(shí)、8小時(shí)時(shí)Fas、FasL、Caspase-3、Caspase-8表達(dá)量均較模型組減少，4～12小時(shí)呈現(xiàn)持續(xù)升高表達(dá)。以上結(jié)果表明截?cái)嗄嫱旆郊癝P600125可以在4、8小時(shí)有效減少Fas、FasL、Caspase-3、Caspase-8的表達(dá)。但12小時(shí)模型組蛋白表達(dá)減少，而給藥組表達(dá)量卻持續(xù)增多，提示ACLF大鼠急性攻擊后可能出現(xiàn)肝細(xì)胞大量死亡，凋亡活動(dòng)減少。

上述結(jié)果提示截?cái)嗄嫱旆娇梢杂行Ы档虯CLF大鼠肝組織蛋白Fas、FasL、Caspase-3、Caspase-8的含量，抑制死亡受體信號(hào)途徑上關(guān)鍵蛋白表達(dá)，其作用機(jī)制與JNK抑制劑SP600125相似。

綜上分析，降低肝組織蛋白Fas、FasL、Caspase-3、Caspase-8表達(dá)，干預(yù)JNK信號(hào)通路相關(guān)死亡受體途徑從而減少肝細(xì)胞凋亡，可能是截?cái)嗄嫱旆綔p輕ACLF模型大鼠肝細(xì)胞損傷的部分作用機(jī)制。

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(本文編輯： 王馨瑤)

Effect ofJieDuanNiWanprescription on death receptor pathway in acute-on-chronic liver failure rat model

MUlingyun,LIjinxia,ZHANGqiuyun,etal.

CapitalMedicalUniversitySchoolofTraditionalChineseMedicine&BeijingKeylaboratoryofTCMCollateralDiseaseTheoryResearch,Beijing100069,China

ZHANGqiuyun,E-mail:zhangqiuyun8202@aliyun.com

Objective To observe the effect ofJieduanNiwan(JDNW) on the death receptor pathway of JNK signaling pathways in acute-on-chronic liver failure (ACLF) rats, and study its mechanism. Methods 70 SPF male Wistar rats were randomly divided into normal group, model group,Jieduan-Niwanprescription group and JNK inhibitor SP600125 group. Except normal group, other groups were given intraperitoneal injection with porcine serum for 13 weeks combined with D-galactosamine / lipopolysaccharide (D-GalN/LPS) acute attack to induce the model of ACLF,JDNWgroup intragastric administration for 3 days before acute attack, SP600125 group was intraperitoneal injection half an hour before acute attack. The rats were sacrificed in 4,8,12h after acute attack. Caspase-3, Caspase-8, Fas in liver tissue was detected by immunohistochemical method, the expression of FasL in liver tissue was detected by Western Blot. Results Compared with normal group, the expression of Caspase-3, Caspase-8, Fas, FasL were increased(P< 0.05) in model group at different time points; compared with the model group,JDNWgroup and SP600125 group was reduced at 4h and 8h(P<0.01 orP<0.05), while that was higher than model group at 12h, result had not statistically significant (P>0.05). BothJDNWgroup and SP600125 group can reduce the expression of Caspase-3, Caspase-8, Fas, FasL, and the mechanism was similar. Conclusion The prescription ofJieduan-Niwancan effectively reduce the expression of Caspase-3, caspase-8, Fas, FasL, the mechanism may be related to blocking the death receptor pathway of JNK signaling pathway.

Acute-on-Chronic Liver Failure;JieduanNiwanformula; Apoptosis; Death receptor pathways

首都中醫(yī)藥研究專(zhuān)項(xiàng)(14ZY01)

100069 北京, 首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院[ 穆凌云(碩士研究生) 、李金霞(碩士研究生)、張秋云、高連印、杜宇瓊] ; 中醫(yī)絡(luò)病研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室[ 穆凌云( 碩士研究生) 、張秋云、高連印、杜宇瓊]；首都醫(yī)科大學(xué)附屬佑安醫(yī)院人工肝中心(陳煜)

穆凌云(1992- )，女，2014級(jí)在讀碩士研究生。研究方向：中醫(yī)藥防治肝膽證治規(guī)律。E-mail：mumu920308@163.com

張秋云(1962- )，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師。研究方向：中醫(yī)內(nèi)科肝病。E-mail: zhangqiuyun8202@aliyun.com

R259

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.04.007

2016-12-17)