朱開權(quán)

【摘要】目的 研究SD大鼠心肌梗死后服用瑞舒伐他汀鈣片對其心肌組織炎性反應(yīng)及炎癥信號通路核轉(zhuǎn)錄因子NF-kB（Nuclear factor kB NF-kB）的影響。方法 通過SD大鼠冠狀動脈前降支的結(jié)扎建立心肌梗死模型，模型成功者隨即分為心肌梗死組（MI，n=10）和瑞舒伐他汀鈣片組（RC，n=10，10 mg/（kg.d）），另設(shè)陰性對照組（Sham，n=10），分別2周后觀察；蘇木精-伊紅染色觀察心肌組織病理結(jié)構(gòu)；通過檢測NF-kB的mRNA表達(dá)量大小對比炎性反應(yīng)的影響，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測各組蛋白表達(dá)情況。結(jié)果 心肌梗死后2周：（1）與Sham組比較，MI組和RC組心肌組織結(jié)構(gòu)顯著異常；與MI組比較，RC組心肌結(jié)構(gòu)明顯改善。（2）與Sham組比較，MI組和RC組NF-kB在基因水平上顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與MI組比較，RC組NF-kB在基因水平上表達(dá)顯著減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 瑞舒伐他汀鈣片能夠減輕大鼠心肌梗死后心肌組織的炎性浸潤，下調(diào)NF-kB表達(dá)。

【關(guān)鍵詞】瑞舒伐他汀鈣片；心肌梗死；NF-kB

【中圖分類號】R542.22 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【文章編號】ISSN.2095-6681.2016.27.00.02

【Abstract】Objective To observe the effect of rosuvastatin calcium tablet on the inflammatory infiltration and the expression of nuclear factor-κB （NF-κB） in the inflammatory mediators of myocardial infarction rats.Methods The left anterior descending coronary artery was ligated to establish the rat myocardial infarction model. The surviving rats were randomly divided into myocardial infarction group （MI， n=10） and rosuvastatin calcium group （RC， n=10， 10 mg And the control group （Sham， n=10）. The pathological changes of the myocardium were observed after 2 weeks in each group. The pathologic structure of each group was observed by histopathology. Reverse transcription polymerase chain reaction （RT-PCR） The expression of NF-kB mRNA was detected by immunohistochemistry.Results Compared with Sham group， myocardial tissue of MI group and RC group were significantly abnormal compared with MI group. Compared with MI group， the myocardial structure of RC group was significantly improved. （P<0.01）. Compared with MI group， the expression of NF-κB in RC group was significantly lower than that in MI group （P<0.01）. Compared with Sham group， the expression of NF-κB in MI group and RC group was significantly increased （P

【Key words】Rosuvastatin calcium；Myocardial infarction；NF-kB

心肌梗死后，病理性應(yīng)激會觸發(fā)心室重構(gòu)的發(fā)生，事實上所有心肌梗死的病人都會發(fā)生心室重構(gòu)，包括梗死區(qū)和非梗死區(qū). 心室重構(gòu)的發(fā)生會導(dǎo)致心衰的形成，影響病人的預(yù)后，早期預(yù)防心室重構(gòu)的發(fā)生對于預(yù)防心力衰竭有重要的作用。炎性反應(yīng)對心肌梗死后心室重構(gòu)有較大影響，已經(jīng)有研究表明抗炎治療可以改善心肌組織的重構(gòu)[1]。目前，NF-KB通路被認(rèn)為是調(diào)節(jié)免疫，應(yīng)激，凋亡，心肌缺血再灌注損傷，心力衰竭的最重要的通路。作為炎癥反應(yīng)中的一個主要調(diào)控因子，核轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB）參與了炎癥和免疫應(yīng)答、凋亡及細(xì)胞增殖的調(diào)控。在非活動性細(xì)胞上，細(xì)胞內(nèi)的NF-κB通過P65亞基上的錨定蛋白重復(fù)序列與其抑制物IκB結(jié)合，形成沒有活性的復(fù)合物[2]。當(dāng)其被激活后就會引起一系列炎癥因子的表達(dá)，從而引起心室的重構(gòu)。他汀類藥物作為一種降脂藥物廣泛應(yīng)用在心腦血管疾病中，而且近些年，他汀類藥物在改善心室重構(gòu)，改善預(yù)后，提高患者生存率方面，越來越被人所認(rèn)知[3]。但是瑞舒伐他汀鈣片能否在MI活體抑制NF-kB的表達(dá)，現(xiàn)在還不明確，本研究以SD-大鼠建立的心肌梗死模型為研究對象，研究瑞舒伐他汀鈣片對大鼠心肌梗死后炎性反應(yīng)和核轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的影響，進(jìn)而對探討人心肌梗死后，瑞舒伐他汀鈣片對其心肌組織炎性反應(yīng)及心室重構(gòu)的影響積累一定

經(jīng)驗。

1 資料與方法

1.1 一般資料

主要試劑瑞舒伐他汀鈣片（可定阿斯利康制藥有限公司）、保存組織RNA樣本保存液（天根生物科技公司）、總RNA提取試劑盒（天根生物科技公司）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa）、PCR試劑盒（天根生物科技公司）；兔抗鼠核轉(zhuǎn)錄因子多克隆抗體（博奧森生物技術(shù)公司）、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗（北京博奧森）；組織裂解液、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（武漢博士德公司）；免疫細(xì)胞化學(xué)試劑盒（北京博奧森）、DAB染色試劑盒（C-0010北京博奧森）等。

1.2 方法

實驗大鼠30只，水合氯醛腹腔麻醉，氣管插管成功，左側(cè)第四肋間開胸暴露心臟，5號絲線結(jié)扎冠狀動脈前降支，存活大鼠隨即分為MI組、RC組，另設(shè)sham組（只穿線不結(jié)扎）。

樣品2周后采集，使用10%KCL液2 mL注入大鼠心室，心臟停搏于舒張期。立即打開胸腔，取出心臟。

RT-PCR實驗方法檢測NF-kB mRNA表達(dá)。按照RNA提取試劑盒指示的步驟提取大鼠心肌組織總RNA并檢測其純度和濃度。按照RT及PCR試劑盒說明書，行RT-PCR反應(yīng)。RT反應(yīng)條件為37℃反應(yīng)15 min（反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)），85℃反應(yīng)5 s（反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng)）4℃為保存溫度。PCR反應(yīng)條件為94℃反應(yīng)3 min，94℃反應(yīng)30 s，64℃退火30 s，72℃反應(yīng)1 min，72℃反應(yīng)5 min。第2到第4步驟反應(yīng)30個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參照，進(jìn)行電泳后，使用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行驗證，目的片段與β-actin吸光度比值作為目的片段mRNA的相對含量。

蘇木精—伊紅法進(jìn)行組織石蠟切片染色，對比各組石蠟切片中心肌細(xì)胞形態(tài)，及炎癥細(xì)胞在梗死后心肌組織和非梗死心肌組織的反應(yīng)以及纖維組織增生情況。

免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測核轉(zhuǎn)錄因子蛋白的表達(dá)，依照免疫細(xì)胞化學(xué)試劑盒的實驗方法，兔抗鼠核轉(zhuǎn)錄因子多克隆抗體1：200稀釋。PBS液代替一抗作為陰性對照組，棕黃色顆粒為陽性表達(dá)，測定出的累積吸光度值為目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計量資料以“x±s”表示，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

各實驗組中核轉(zhuǎn)錄因子的基因表達(dá)含量各組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=596.18，P<0.05）。與sham組相比較，MI組NF-kB基因表達(dá)為6.12倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。RC組NF-kB基因表達(dá)分別為3.7倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與MI組相比較，RC組基因表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

蘇木精-伊紅染色：普通顯微鏡下，陰性對照組心肌細(xì)胞無水腫，結(jié)構(gòu)整齊，心肌細(xì)胞間未見炎癥細(xì)胞浸潤及纖維組織的增生。陽性組，心肌梗死區(qū)變薄，可見大量炎癥細(xì)胞浸潤，心肌組織有大量壞死，可見排列紊亂的纖維組織代替；非梗死區(qū)心肌細(xì)胞水腫，可見大量炎性細(xì)胞浸潤及纖維增生。RC組心肌組織結(jié)構(gòu)均較MI組明顯改善。

免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測各組核轉(zhuǎn)錄因子的蛋白表達(dá)：其他兩組與陰性對照組（30084.5±3312.32）w比較，心肌梗死組（91782.2±3188.52）w和RC組（70793.5±3167.32）w NF-kB蛋白累積吸光度值顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與心肌梗死組相比較，RC組蛋白累積吸光度值明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)通過大鼠心肌梗死模型的建立，分別從陰性對照組，藥物干預(yù)組，陽性對照組三方面觀察，組織切片顯示：藥物干預(yù)組與陽性對照組相比較，梗死區(qū)及非梗死區(qū)炎性細(xì)胞浸潤情況明顯減輕，從而說明瑞舒伐他汀鈣片可以減輕心肌梗死后的炎癥反應(yīng)，通過NF-kB的M-RNA表達(dá)及免疫組化蛋白表達(dá)的測定，從量化方面進(jìn)一步證明瑞舒伐他汀鈣片可以抑制NF-kB信號通路的激活，從而減輕炎癥反應(yīng)，從而證明瑞舒伐他汀鈣片可能通過減輕大鼠心肌梗死后的炎癥反應(yīng)，下調(diào)NF-kB表達(dá)，從而起到改善心室重構(gòu)，改善預(yù)后的作用，但是本實驗僅從動物水平驗證，是否在人體心肌梗死后達(dá)到同樣的治療作用，尚需進(jìn)一步研究證明。

參考文獻(xiàn)

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