劉樹民+張寧+于棟華+王宇+周琦+盧芳

[摘要] 該研究通過肝臟代謝組學(xué)研究從肝論治痛風(fēng)的科學(xué)性以及穿山龍?zhí)崛∥飳?duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型大鼠的防治作用，并找到其相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物和相關(guān)代謝通路。課題組采用尿酸鈉（MSU）誘導(dǎo)的急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型并運(yùn)用UPLC-TOF-MS結(jié)合模式識(shí)別方法探討穿山龍?zhí)崛∥锔深A(yù)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的潛在生物標(biāo)志物及其相關(guān)代謝通路。鑒別出了11個(gè)共同的潛在生物標(biāo)志物，其中穿山龍對(duì)正常大鼠的潛在干預(yù)靶點(diǎn)中，4個(gè)上調(diào)，4個(gè)下調(diào)；穿山龍對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型大鼠的潛在干預(yù)靶點(diǎn)中，5個(gè)代謝物在MSU誘導(dǎo)下被上調(diào)，5個(gè)代謝物被下調(diào)，而穿山龍?zhí)崛∥锉憩F(xiàn)出糾正磷酸腺苷、5-甲基四氫葉酸、氧化型谷胱甘肽、次黃嘌呤、二十二碳六烯酸、谷胱甘肽、尿苷二磷酸葡萄糖、肌苷這8個(gè)代謝物異常表達(dá)的趨勢(shì)，其相關(guān)性最強(qiáng)的代謝通路是谷胱甘肽代謝、淀粉與蔗糖代謝和嘌呤代謝。故推測(cè)穿山龍可以通過干預(yù)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎狀態(tài)下和生理狀態(tài)下肝臟中內(nèi)源性代謝產(chǎn)物變化，實(shí)現(xiàn)防治急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎作用。

[關(guān)鍵詞] 急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎； 穿山龍； 尿酸鈉； 肝臟代謝組學(xué)

[Abstract] To explore the prevention and protection effect of Diosocorea nipponica （DNM）） on acute gouty arthritis （AGA） rats based on liver metabonomics， and find potential biomarkers and related pathways. AGA model rats were induced by monosodium urate crystal suspension. UPLC-TOF-MS coupled with pattern recognition technique was employed to find out the potential biomarkers and related metabolic pathways. Eleven common potential biomarkers were identified. Among the potential intervention targets in normal rats given by DNM， 4 biomarkers were up-regulated， and the other 4 targets were down regulated. Among the potential intervention targets in AGA rats given by DNM， 5 metabolites were up-regulated by MSU and 5 metabolites were down regulated. The abnormal expression levels of adenosine monophosphate， 5-methyltetrahydrofolic acid， oxidized glutathione， hypoxanthine， docosahexaenoic acid， glutathione， uridine diphosphate glucose and inosine could be corrected by DNM extract. Three pathways were founded with greatest correlation， including purine metabolism， starch and sucrose metabolism and glutathione metabolism. Therefore， it could be inferred that D. nipponica has the effect for anti-acute gouty arthritis by intervening endogenous metabolites from the liver under physiological condition and acute gouty arthritis condition.

[Key words] acute gouty arthritis； Diosocorea nipponica； monosodium urate； liver metabonomics

《醫(yī)學(xué)傳燈·痛風(fēng)》記載：“痛風(fēng)者，遍身疼痛，晝減夜甚，痛徹筋骨…皆由肝經(jīng)血少火盛，熱極生風(fēng)，非是外來風(fēng)邪…”[1]，而現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為痛風(fēng)的原因是尿酸含量過高，其根源與肝臟代謝異常有關(guān)[2]，因此讓痛風(fēng)從肝臟得到根治是個(gè)亟待解決的問題，但從肝論治痛風(fēng)是否具有科學(xué)性仍需要臨床和實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步的檢驗(yàn)。穿山龍有祛風(fēng)除濕、舒筋通絡(luò)、活血止痛之功，用于各種關(guān)節(jié)炎[3]。在東北物產(chǎn)豐富，加大對(duì)穿山龍的開發(fā)，為解除患者疼痛、擴(kuò)大社會(huì)生產(chǎn)力、北藥開發(fā)戰(zhàn)略的實(shí)施有極其深遠(yuǎn)的意義。前期實(shí)驗(yàn)表明穿山龍對(duì)高尿酸血癥及痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎有良好的治療作用[4-9]，基于此運(yùn)用肝臟代謝組學(xué)，預(yù)期從整體觀探討穿山龍對(duì)生理及急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎狀態(tài)下大鼠的影響，尋找穿山龍作用于肝臟中的潛在靶點(diǎn)，驗(yàn)證從肝論治痛風(fēng)的科學(xué)性，模擬出穿山龍抗痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的作用通路及其作用機(jī)制。

1 材料

QI軟件（Waters 3.0）；UPLC-TOF-MS超高液相色譜-飛行時(shí)間-質(zhì)譜儀（美國Waters公司）；KDC-160HR高速冷凍離心機(jī)（科大創(chuàng)新有限公司中佳分公司）；MassLynx V4.1工作站（美國Waters公司）。

乙腈（色譜級(jí)，美國Thermo Fisher 科技公司）；甲酸（色譜級(jí)，美國Dikma 科技公司）；亮氨酸腦啡肽（美國Sigma-Aldrich公司）；尿酸鹽（美國Sigma-Aldrich公司）；蒸餾水（屈臣氏）。黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中藥毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)室按本課題組的前期研究方法制得穿山龍?zhí)崛∥?，其中偽原薯蕷皂苷、原薯蕷皂苷、甲基原薯蕷皂苷的總含量達(dá)到 60%[10]。

SD大鼠，雄性，SPF級(jí)，體重（230～280） g，購自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)SCXK（黑）2013-004，飼養(yǎng)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室。飼養(yǎng)條件：12 h光照，12 h避光循環(huán)飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度（22±1） ℃，相對(duì)濕度40%～50%，飼喂標(biāo)準(zhǔn)飼料、飲用水。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥

將SD大鼠40只，隨機(jī)分為對(duì)照組、穿山龍組、MSU模型組和穿山龍干預(yù)組，每組10只。穿山龍組和穿山龍干預(yù)組灌胃給予穿山龍?zhí)崛∥?，劑量?80 mg·kg-1[11]，每天1次，連續(xù)5 d。對(duì)照組和MSU模型組給予等體積的生理鹽水，每天1次，連續(xù)5 d。

用滅菌蒸餾水配成0.025 g·mL^-1的MSU混懸液，取0.2 mL一次性踝關(guān)節(jié)腔注射。第3天灌胃1 h后，將MSU模型組和穿山龍干預(yù)組大鼠仰位固定，后肢膝關(guān)節(jié)周圍剃毛，然后用75%醫(yī)用酒精清洗消毒，膝關(guān)節(jié)輕度彎曲，用6號(hào)注射針在大鼠膝關(guān)節(jié)上方髕上韌帶進(jìn)針，注射0.2 mL MSU混懸液到關(guān)節(jié)腔，以關(guān)節(jié)囊對(duì)側(cè)鼓起為注入指標(biāo)，造成實(shí)驗(yàn)性急性痛風(fēng)關(guān)節(jié)炎模型。對(duì)照組和穿山龍組按上述方法注射等體積生理鹽水。

2.2 肝臟樣本的收集與制備

末次給藥24 h后，將大鼠處死并取出肝臟組織，放入冰冷的生理鹽水中洗去浮血，濾紙吸干后，在冰浴上剪成碎片，稱取適量組織，加入10倍體積冰冷的甲醇進(jìn)行勻漿，隨后勻漿液于13 000 r·min^-1，4 ℃離心15 min，上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管后再重復(fù)該條件離心1次，最后的上清液儲(chǔ)存于-80 ℃中。

2.3 代謝組學(xué)樣本分析方法的建立

2.3.1 UPLC條件 ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm× 50 mm，1.7 μm）；進(jìn)樣量3 μL；流動(dòng)相0.1%甲酸乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），洗脫梯度，0～2.5 min，1%～10% A，2.5～3.5 min，10%～40% A，3.5～11 min，40%～70% A，11～12 min，70%～80% A，12～13 min，80%～100% A，流速0.4 mL·min^-1；柱溫40 ℃。

2.3.2 MS條件 電噴霧離子源（ESI），采用正、負(fù)離子W模式檢測(cè)，鎖定質(zhì)量溶液，采用美國Waters公司LockSprayTM校正系統(tǒng)進(jìn)行在線質(zhì)量校正。亮氨酸腦啡肽準(zhǔn)分子離子峰m/z 556.277 1[M+H]+；m/z 554.261 5[M-H]-，鎖定質(zhì)量濃度為1 μg·L^-1，流速為30 μL·min^-1。掃描方式為全掃描，質(zhì)量掃描范圍為質(zhì)荷比m/z 100～1 500。其質(zhì)譜條件見表1。

2.4 多元數(shù)據(jù)分析及潛在干預(yù)靶點(diǎn)的鑒定

UPLC-TOF-MS系統(tǒng)為不同離子所對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜峰提供了精確的相對(duì)分子質(zhì)量數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)被首先用于幫助確定代謝物的相對(duì)分子質(zhì)量。對(duì)肝臟樣品進(jìn)行檢測(cè)，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入QI 軟件[12]，聯(lián)合MarkerLynx XS軟件中Ezinfo 2.0軟件對(duì)大鼠肝臟中代謝物組進(jìn)行主成分分析（principal components analysis，PCA），繪制反映組間離散度的Scores plot，觀察肝臟代謝物軌跡是否在各自組內(nèi)相似度較好，在同一判別標(biāo)準(zhǔn)下不同的組別是否呈現(xiàn)各自聚類現(xiàn)象。結(jié)合各組間各離子點(diǎn)量的變化趨勢(shì)，在S-plot圖中選擇潛在的生物標(biāo)志物，以變量投射重要性（VIP）>1的離子作為生物標(biāo)志物，根據(jù)鑒定結(jié)果聯(lián)合HMDB（人類代謝組數(shù)據(jù)庫）及KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，京都基因與基因組百科全書）等數(shù)據(jù)庫及大量文獻(xiàn)對(duì)生物標(biāo)志物進(jìn)行生物學(xué)意義的解釋，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)數(shù)據(jù)的分析確定和代謝通路的分析。

3 結(jié)果

3.1 大鼠肝臟代謝數(shù)據(jù)分析

為了獲得大鼠肝臟樣本代謝輪廓的概況，3D-PCA被運(yùn)用于隨后的UPLC-TOF-MS數(shù)據(jù)分析中。結(jié)果顯示空白組和穿山龍組明顯分離，說明空白組和穿山龍組出現(xiàn)了明顯的化學(xué)擾動(dòng)，見圖1。MSU模型組的代謝輪廓遠(yuǎn)離了空白組，表明MSU誘導(dǎo)后大鼠肝臟內(nèi)發(fā)生了顯著地生物學(xué)變化，見圖2，3。穿山龍?zhí)崛∥锔深A(yù)組的代謝輪廓遠(yuǎn)離于MSU模型組，有向空白組回調(diào)趨勢(shì)，說明由MSU誘導(dǎo)產(chǎn)生的偏離得到了明顯改善。

在S-plots圖中，絕大多數(shù)離子聚集于原點(diǎn)附近，只有少數(shù)離子偏離原點(diǎn)，即S-plots圖兩端的離子造成了2組組間的差異，見圖4。并選定VIP>1的離子預(yù)選為潛在的生物標(biāo)志物，見圖5。

3.2 穿山龍對(duì)正常大鼠和急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型大鼠潛在生物標(biāo)志物

不同生理病理狀態(tài)可能存在相同的代謝產(chǎn)物譜，這可能是機(jī)體應(yīng)激出現(xiàn)的結(jié)果，也可能是藥物作用的潛在靶點(diǎn)，因此通過分析發(fā)生變化的共同代謝產(chǎn)物有助于推測(cè)疾病的發(fā)病機(jī)制以及藥物對(duì)疾病的預(yù)防和治療作用。穿山龍對(duì)正常和急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型大鼠的代謝變化比較，得到11個(gè)相同的生物標(biāo)志物，見表2。

通過比對(duì)這些潛在生物標(biāo)志物的離子強(qiáng)度，其中穿山龍對(duì)正常大鼠的潛在干預(yù)靶點(diǎn)中，4個(gè)上調(diào)，4個(gè)下調(diào)；穿山龍對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型大鼠的潛在干預(yù)靶點(diǎn)中，5個(gè)代謝物在MSU誘導(dǎo)下被上調(diào)，5個(gè)代謝物被下調(diào)，而穿山龍?zhí)崛∥锉憩F(xiàn)出糾正磷酸腺苷、5-甲基四氫葉酸、氧化型谷胱甘肽、次黃嘌呤、二十二碳六烯酸、谷胱甘肽、尿苷二磷酸葡萄糖、肌苷這8個(gè)代謝物異常表達(dá)的趨勢(shì)，見圖6。

3.3 肝臟中潛在生物標(biāo)志物的分類

使用HMDB對(duì)潛在生物標(biāo)志物進(jìn)行分類，11個(gè)潛在靶點(diǎn)中，大約9%屬于脂類，46%為核苷、核苷酸及它們的類似物；18%為有機(jī)酸及其衍生物，9%為兒茶酚胺類及其衍生物，18%為雜環(huán)化合物。在生物功能分布中，所調(diào)節(jié)的潛在靶點(diǎn)中主要參與的生物過程有嘌呤代謝（9%）、谷氨酸代謝（4%）、蛋氨酸代謝組分（5%）、谷胱甘肽代謝組分（7%）、廢物（11%）和其他（64%）。另外，這些代謝物主要存在于細(xì)胞外（29%）、細(xì)胞質(zhì)（21%）、溶酶體（14%）和線粒體（14%）等部位。

3.4 肝臟中潛在生物標(biāo)志物的通路分析

將11個(gè)共同的潛在生物標(biāo)志物作為穿山龍抗急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的肝臟潛在生物標(biāo)志物，并進(jìn)行MetaPA識(shí)別顯著富集通路分析，確定與所分析代謝物組相關(guān)性最強(qiáng)的代謝通路。代謝通路影響值的臨界值設(shè)置為0.10，大于這個(gè)值，將選擇作為潛在關(guān)鍵代謝通路，見圖7，表3。主要富集于谷胱甘肽代謝、淀粉與蔗糖代謝和嘌呤代謝。在穿山龍干預(yù)后，代謝物的含量得到回調(diào)，代謝通路的紊亂得到改善，在代謝途徑層面驗(yàn)證了穿山龍對(duì)由MSU誘導(dǎo)的急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型有良好的預(yù)防和保護(hù)作用。

4 結(jié)論與討論

4.1 谷胱甘肽代謝

谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）參與了谷胱甘肽代謝。在活細(xì)胞內(nèi)，2分子GSH可脫氫以二硫鍵相連形成GSSG。GSSG在NADPH+和H+存在下，由谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase，GR）催化，又可還原成GSH。還參與機(jī)體三羧酸循環(huán)及糖代謝，使機(jī)體獲得高能量，能激活各種酶，從而促進(jìn)糖、脂肪、蛋白質(zhì)代謝，也能影響細(xì)胞的代謝過程，改善中毒性肝炎、感染性肝炎的癥狀[13]，炎癥免疫與急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎密切相關(guān)[14]，且前期研究證實(shí)穿山龍總皂苷抑制急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型大鼠產(chǎn)生IL-1β 和 TNF-α 這類致炎因子，阻斷其所介導(dǎo)和激發(fā)的炎癥反應(yīng)過程[11] 。此外，也能抑制脂肪肝的形成[15]，脂肪肝與血脂和血尿酸的關(guān)系是并存的，且互為影響，脂肪肝形成的過程中尿酸的合成增加，使患者亦并發(fā)痛風(fēng)[16]。在此研究中，MSU模型組中GSH和GSSG的濃度是明顯減少的（P<0.05），且GSH的降低幅度高于GSSG，可以推測(cè)出MSU主要抑制了谷胱甘肽還原酶，致GSH的濃度在肝臟中的含量減少，而穿山龍?zhí)崛∥锏母深A(yù)有利于肝臟中GSH和GSSG轉(zhuǎn)化的進(jìn)行。穿山龍?zhí)崛∥锏姆乐巫饔每赡苁峭ㄟ^調(diào)節(jié)谷胱甘肽代謝中谷胱甘肽還原酶的活性，進(jìn)而調(diào)節(jié)GSH和GSSG的水平來實(shí)現(xiàn)的，見圖8。

4.2 淀粉與蔗糖代謝

尿苷二磷酸葡萄糖參與了淀粉與蔗糖代謝，為生物體合成雙糖及多糖的中間物[17]。肝臟中存在的動(dòng)物性多糖為肝糖原，其在機(jī)體內(nèi)的終產(chǎn)物為葡萄糖，為體內(nèi)代謝供能。此研究中，MSU模型中尿苷二磷酸葡萄糖的含量是明顯減少的（P<0.05），這表明MSU可以間接的減少機(jī)體內(nèi)肝糖原的含量，而穿山龍?zhí)崛∥锟娠@著增加尿苷二磷酸葡萄糖的含量（P<0.05），間接的增加機(jī)體內(nèi)肝糖原的貯備量，提高機(jī)體的運(yùn)動(dòng)耐力[18]。因此穿山龍?zhí)崛∥锟梢酝ㄟ^間接增加機(jī)體內(nèi)肝糖原的貯備量來改善MSU模型急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者運(yùn)動(dòng)不便的困境。

4.3 嘌呤代謝

脫氧鳥苷（dG）、肌苷、次黃嘌呤、脫氧腺苷酸（dAMP）和磷酸腺苷（AMP）分別參與了嘌呤代謝。肌苷酸和腺苷是肌苷的直接前體。dG是鳥苷一磷酸的直接前體，可轉(zhuǎn)化成肌苷酸，而肌苷是其部分水解的產(chǎn)物；腺苷是由dAMP間接轉(zhuǎn)換而來，肌苷由AMP在腺苷脫氨酶催化下生成，在有關(guān)酶作用下可形成次黃嘌呤，它是核酸中嘌呤堿基的代謝中間物。經(jīng)黃嘌呤氧化酶催化作用可形成黃嘌呤，進(jìn)一步代謝形成尿酸[19]。痛風(fēng)患者一般都有尿酸代謝紊亂，出現(xiàn)尿酸高的現(xiàn)象[20]，在此研究中，MSU模型中的dG，肌苷，次黃嘌呤，dAMP和AMP的濃度均明顯增加（P<0.05），可以推測(cè)MSU促進(jìn)并誘導(dǎo)了機(jī)體內(nèi)尿酸的合成，而穿山龍?zhí)崛∥锏母深A(yù)均抑制尿酸的合成，推測(cè)穿山龍?zhí)崛∥锏姆乐巫饔每赡苁峭ㄟ^調(diào)節(jié)嘌呤代謝中dG，肌苷，次黃嘌呤，dAMP和AMP與尿酸的水平來實(shí)現(xiàn)的。

本研究共發(fā)現(xiàn)了11個(gè)共同的潛在生物標(biāo)志物，分別為磷酸腺苷、腎上腺素、次黃嘌呤、5-甲基四氫葉酸、谷胱甘肽、脫氧鳥苷、氧化型谷胱甘肽、肌苷、二十二碳六烯酸、脫氧腺苷酸、尿苷二磷酸葡糖，相關(guān)性最強(qiáng)的通路有谷胱甘肽代謝、淀粉與蔗糖代謝和嘌呤代謝。值得注意的是穿山龍?zhí)崛∥飳?duì)dG、肌苷、次黃嘌呤、dAMP和AMP的下調(diào)和尿苷二磷酸葡萄糖、GSH和GSSG的上調(diào)均具有顯著的逆轉(zhuǎn)趨勢(shì)，能夠使得它們的表達(dá)恢復(fù)平衡。這些結(jié)果可能表明了穿山龍?zhí)崛∥飳?duì)MSU誘導(dǎo)的急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的防治作用，可以通過多個(gè)代謝物靶點(diǎn)的干預(yù)來實(shí)現(xiàn)。MSU介導(dǎo)的急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型大鼠以及生理狀態(tài)下穿山龍組大鼠體內(nèi)發(fā)生了內(nèi)源性代謝物的擾動(dòng)。鑒別的潛在生物標(biāo)志物參與了急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎相關(guān)的代謝通路，而穿山龍?zhí)崛∥飳?duì)相關(guān)靶點(diǎn)具有干預(yù)作用，從而找到穿山龍防治急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制。

課題組的創(chuàng)新之處在于通過肝臟代謝組學(xué)間接驗(yàn)證了從肝論治痛風(fēng)的科學(xué)性，并探討了由MSU誘導(dǎo)的急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型和生理狀態(tài)給予穿山龍后共同的潛在生物標(biāo)志物及其相關(guān)性最強(qiáng)的代謝通路，力求尋找穿山龍可干預(yù)的與生理病理（急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎）變化的小分子代謝物，同時(shí)監(jiān)測(cè)其整個(gè)代謝網(wǎng)絡(luò)的變化，有助于表征急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的病理狀態(tài)，并為穿山龍的預(yù)防和治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎提供診斷信息。同時(shí)，為疾病和藥物的生物化學(xué)作用機(jī)制提供新的見解。肝臟代謝組學(xué)在中醫(yī)藥研究中有利于理解急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎這種疾病的本質(zhì)及評(píng)估穿山龍的防治作用。

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[責(zé)任編輯 曹陽陽]