彭魯，林聰

(1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬腦科醫(yī)院檢驗(yàn)科，南京 210009；2.南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科，南京 210009)

·臨床實(shí)驗(yàn)研究·

miR-133b在前列腺癌中的表達(dá)及其對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響

彭魯1，林聰2

(1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬腦科醫(yī)院檢驗(yàn)科，南京 210009；2.南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科，南京 210009)

目的 檢測(cè)miR-133b在前列腺癌患者癌組織中的表達(dá)水平及其對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖的影響。方法 提取30例手術(shù)切除的前列腺組織癌和配對(duì)癌旁組織中的總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)癌組織及癌旁組織中miR-133b的表達(dá)水平，并分析其與患者臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性;用脂質(zhì)載體將miR-133b模擬物轉(zhuǎn)染入PC-3細(xì)胞中，檢測(cè)PR結(jié)構(gòu)域結(jié)合因子16(PRDM16)表達(dá)情況;CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-133b模擬物后PC-3細(xì)胞增殖變化情況。結(jié)果 前列腺癌組織中miR-133b的表達(dá)水平(16.85±0.939)×10-4低于癌旁組織(22.95±1.567)×10-4，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.335，P<0.01)。PC-3細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-133b模擬物后，模擬物轉(zhuǎn)染組中PRDM16表達(dá)水平較對(duì)照組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.371±0.031 vs 1.000±0.022,t=12.53,P<0.01)；轉(zhuǎn)染miR-133b模擬物72 h后，模擬物轉(zhuǎn)染組的PC-3細(xì)胞增殖能力低于陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.811，P<0.01)；而PRDM16抑制劑轉(zhuǎn)染PC-3細(xì)胞72 h后的細(xì)胞增殖能力也低于陰性對(duì)照組(t=9.048，P<0.01)。結(jié)論 miR-133b在前列腺癌組織中的表達(dá)下調(diào)，其可能通過(guò)PRDM16控制前列腺腫瘤細(xì)胞增殖。

前列腺癌；微小RNA-133b；PR結(jié)構(gòu)域結(jié)合因子16；增殖

miR-133b是miRNA(miR-133)家族中的一員，定位于6號(hào)染色體短臂，其在肌肉發(fā)育和多種腫瘤生長(zhǎng)過(guò)程中具有重要作用[1]。目前對(duì)miR-133b研究主要集中在其抑制直結(jié)腸腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡及其對(duì)線粒體呼吸的作用[2-4]。PR結(jié)構(gòu)域結(jié)合因子16(positive regulatory domain I-binding factor 16，PRDM16)是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，其存在于如骨髓異常增生綜合征(myelodysplastic syndrome, MDS)等多種血液系統(tǒng)疾病患者體內(nèi)[3]。研究表明，PRDM16在前列腺癌組織中高表達(dá)，且參與細(xì)胞線粒體呼吸作用過(guò)程，通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)(TargetScan)發(fā)現(xiàn)在前列腺癌細(xì)胞中存在miR-133b的作用位點(diǎn)，提示 miR-133b可能通過(guò)PRDM16控制腫瘤細(xì)胞發(fā)生、發(fā)展[4]。

為探究miR-133b在前列腺癌中的表達(dá)及其作用機(jī)制，尋找其下游基因，本研究對(duì)前列腺癌患者的癌組織及癌旁組織中miR-133b的表達(dá)水平進(jìn)行分析，并在前列腺癌細(xì)胞系PC-3中觀察轉(zhuǎn)染miR-133b模擬物后PRDM16表達(dá)情況，旨在為其在前列腺癌診斷中的臨床應(yīng)用價(jià)值提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2016年1-12月江蘇省人民醫(yī)院就診的前列腺癌患者30例，年齡63.2±3.5歲，診斷標(biāo)準(zhǔn)為中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部2011年發(fā)布的《前列腺癌診斷標(biāo)準(zhǔn)》。均采集經(jīng)前列腺根治手術(shù)切除的癌組織及配對(duì)癌旁組織標(biāo)本。所有患者臨床病理資料齊全，每例患者臨床資料的整理和收集均在江蘇省人民醫(yī)院病案室完成。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，并經(jīng)患者知情同意。

1.2 細(xì)胞系、試劑及儀器 人前列腺癌細(xì)胞系PC-3(編號(hào)為ATCC?CRL-1435TM)購(gòu)自美國(guó)模式菌種收集中心(ATCC)；H-DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；RNA提取分離試劑盒(TranZolTMUP Plus RNA kit，北京全式金公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit，日本TaKaRa公司)；PCR擴(kuò)增試劑盒(美國(guó)Roche公司)；轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM3000(美國(guó)Invitrogen公司)；CCK-8試劑(日本碧云天公司)；miR-133b模擬物(上海吉?jiǎng)P基因公司)；PRDM16抑制劑(上海吉瑪制藥公司)；全自動(dòng)酶聯(lián)檢測(cè)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；LightCycler480熒光定量PCR儀(美國(guó)Roche公司)。

1.3 標(biāo)本采集及RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄 術(shù)中取蠶豆大小的前列腺癌組織及癌旁組織(癌旁組織距癌組織約2 cm，且經(jīng)病理組織學(xué)檢查無(wú)癌細(xì)胞)。迅速置于液氮中保存。RNA提取時(shí)，將各組織進(jìn)行研磨，按照RNA提取分離試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA。另取PC-3細(xì)胞約106個(gè)接種于60 mm培養(yǎng)皿中常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞，用TranZolTMUP Plus RNA kit試劑盒提取細(xì)胞總RNA。蛋白質(zhì)核酸分析儀檢測(cè)RNA的濃度及純度，取吸光度(A260/280 nm)在1.8～2.0之間的樣本用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，樣本置-80 ℃保存；用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，樣本置-20 ℃保存。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取PC-3細(xì)胞106個(gè)，用含10%胎牛血清(FBS)的H-DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的條件下培養(yǎng)。按LipofectamineTM3000說(shuō)明書(shū)操作轉(zhuǎn)染細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分為4組(miR-133b模擬物轉(zhuǎn)染組及對(duì)照組、PRDM16抑制劑轉(zhuǎn)染組及對(duì)照組)，將miR-133b模擬物、PRDM16抑制劑及相應(yīng)的陰性對(duì)照分別轉(zhuǎn)染入PC-3細(xì)胞，miR-133b模擬物和PRDM16抑制劑轉(zhuǎn)染終濃度均為100 nmol/L。

1.5 實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)

1.5.1 實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)組織中miR-133b的表達(dá) miR-133b引物序列見(jiàn)文獻(xiàn)[2]。以GAPDH為內(nèi)參基因。根據(jù)GenBank中GAPDH基因的序列號(hào)(26330)，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，并送上海生工公司合成。GAPDH上游引物序列：5′-TGTGGGCATCAATGGATTTGG-3′，下游引物序列：5′-ACACCATGTATTCCGGGTCAAT-3′，退火溫度為60.9 ℃，產(chǎn)物片段大小為116 bp。qPCR總反應(yīng)體系為20 μL，包括10 μmol/L上、下游引物各1 μL，10 μL TaqMan Gene Expression Master Mix(PrimeScriptTMRT reagent Kit自帶),10×PCR buffer 1 μL，模板DNA 1 μL，無(wú)菌ddH2O補(bǔ)足體積至20 μL。反應(yīng)參數(shù): 95 ℃預(yù)變性15 min；95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。于每個(gè)循環(huán)的延伸階段各采集1次熒光信號(hào)，用LightCycle 480 SW1.5.1軟件分析。組織中miR-133b相對(duì)表達(dá)量以2-△Ct法表示。公式：ΔCt=Ct癌組織/癌旁組織-CtGAPDH計(jì)算。所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。重復(fù)3次。

1.5.2 實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中miR-133b及PRDM16表達(dá) 取1.4中的轉(zhuǎn)染各組細(xì)胞，按1.3方法獲得各組細(xì)胞DNA。以GAPDH為內(nèi)參基因。miR-133b及GAPDH引物序列見(jiàn)1.5.1。根據(jù)GenBank中PRDM16基因的序列號(hào)(63976)，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，并送上海生工公司合成。PRDM16上游引物序列：5′-CGAGGCCCCTGTCTACATTC-3′，下游引物序列：5′-GCTCCCATCCGAAGTCTGTC-3′，退火溫度為61.7℃，產(chǎn)物片段大小為185 bp。qPCR反應(yīng)總體系及條件見(jiàn)1.5.1。各組細(xì)胞中miR-133b及PRDM16相對(duì)表達(dá)量以2-△△Ct法表示。公式：ΔΔCt=(CtmiR-133b模擬物轉(zhuǎn)染組/PRDM16抑制劑轉(zhuǎn)染組-CtGAPDH)-(CtmiR-133b模擬物對(duì)照組/PRDM16抑制劑對(duì)照組-CtGAPDH)。所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 細(xì)胞增殖試驗(yàn)(CCK8) 取1.4中的轉(zhuǎn)染各組細(xì)胞，使用H-DMEM培養(yǎng)基配制成單細(xì)胞懸液，按照每孔104個(gè)的細(xì)胞密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，分別于培養(yǎng)0、24、48、72 h時(shí)，每孔避光加CCK8試劑5 μL，37 ℃、5% CO2、飽和濕度的條件下繼續(xù)培養(yǎng)30 min，在450 nm處檢測(cè)吸光度(A450 nm)值，取其均值計(jì)算。各組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 miR-133b在前列腺癌組織中的表達(dá)及與前列腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示miR-133b在前列腺癌組織中表達(dá)量為(16.85±0.939)×10-4，明顯低于癌旁組織中的表達(dá)量(22.95±1.567)×10-4，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.335,P=0.007)。此外，以中位數(shù)為界值將其分為miR-133b低表達(dá)組(≤中位數(shù))和miR-133b高表達(dá)組(>中位數(shù))，miR-133b表達(dá)水平在兩組間差異與年齡、是否吸煙、腫瘤分期、Gleason評(píng)分、有無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

表1 組織中miR-133b的表達(dá)水平與前列腺癌患者臨床病理參數(shù)的分析

2.2 實(shí)時(shí)定量RT-PCR法檢測(cè)PC-3細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-133b后PRDM16的表達(dá) qRT-PCR結(jié)果表明，與miR-133b模擬物對(duì)照組(1.000±0.038)相比，miR-133b模擬物轉(zhuǎn)染組的miR-133b表達(dá)水平(2.033±0.158)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.472,P=0.003)；對(duì)二者進(jìn)行PRDM16表達(dá)水平檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與miR-133b模擬物對(duì)照組(1.000±0.022)相比，miR-133b模擬物轉(zhuǎn)染組的表達(dá)水平(0.371±0.031)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.53,P=0.006),表明miR-133b可以抑制PRDM16表達(dá)。

2.3 CCK-8法檢測(cè)結(jié)果

2.3.1 CCK-8法檢測(cè)PC-3細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-133b模擬物時(shí)PC-3細(xì)胞增殖 結(jié)果表明，與miR-133b模擬物對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染72 h后細(xì)胞增殖率下降(t=6.811,P=0.000 1)，而轉(zhuǎn)染24、48 h時(shí)的miR-133b的表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.143，P=0.890；t=2.068，P=0.072)，表明miR-133b可以抑制前列腺癌細(xì)胞增殖。見(jiàn)圖1。

注: **,P<0.01。

圖1 miR-133b對(duì)PC-3細(xì)胞增殖能力的影響

2.3.2 CCK-8法檢測(cè)PC-3細(xì)胞中轉(zhuǎn)染PRDM16抑制劑后細(xì)胞增殖 與PRDM16抑制對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染48、72 h后細(xì)胞增殖率明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.663,P=0.002;t=9.048,P=0.000 1)，而轉(zhuǎn)染24 h時(shí)的細(xì)胞增殖率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.153 5,P=0.882)，表明PRDM16可以促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖。見(jiàn)圖2。

注: *，P<0.05;**,P<0.01。

圖2 PRDM16對(duì)PC-3細(xì)胞增殖能力的影響

3 討論

本研究通過(guò)檢測(cè)前列腺癌患者組織中miR-133b表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)miR-133b在前列腺癌組織中的表達(dá)明顯低于癌旁組織(P<0.01)。同時(shí)，miR-133b的表達(dá)量與患者的年齡、是否吸煙、腫瘤分級(jí)、是否轉(zhuǎn)移均無(wú)明顯關(guān)系(P>0.05)。為了研究miR-133b對(duì)前列腺癌細(xì)胞的影響，我們將miR-133b模擬物轉(zhuǎn)染人前列腺腺癌細(xì)胞PC-3，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組，觀察miR-133b表達(dá)水平的改變對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-133b模擬物后，PC-3細(xì)胞的增殖明顯降低，提示miR-133b在前列腺癌增殖過(guò)程中可能起到重要作用。

miRNA本身不翻譯產(chǎn)生蛋白質(zhì)，其生物學(xué)功能主要通過(guò)調(diào)節(jié)下游mRNA表達(dá)而實(shí)現(xiàn)[5]。miR-133b在不同腫瘤中存在不同的下游靶基因：在非小細(xì)胞肺癌組織和細(xì)胞中，miR-133b可以通過(guò)抑制MMP9蛋白表達(dá)而抑制細(xì)胞增殖、遷移、侵襲[6]；在肝細(xì)胞腫瘤中，miR-133b可以通過(guò)CTGF調(diào)控細(xì)胞增殖以及細(xì)胞代謝[7]。在前列腺癌中，我們發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-133b可以抑制PRDM16 mRNA生成，說(shuō)明miR-133b可以通過(guò)抑制PRDM16而降低腫瘤細(xì)胞增殖速率，起到抑癌基因作用。miR-133b與PRDM16之間相互作用機(jī)制目前尚不清楚，有研究結(jié)果提示兩者之間可能存在相互聯(lián)系：miR-133b參與神經(jīng)細(xì)胞分化成熟過(guò)程；另有研究發(fā)現(xiàn)PRDM16參與神經(jīng)細(xì)胞分化過(guò)程并具有重要作用[8]。以上研究結(jié)果說(shuō)明miR-133b與PRDM16具有相關(guān)性，驗(yàn)證了本試驗(yàn)結(jié)果。

研究表明，將miRNA的阻斷劑或誘導(dǎo)劑轉(zhuǎn)入細(xì)

胞可抑制腫瘤發(fā)展，起到靶向治療的效果[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-133b在前列腺癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中具有抑癌基因樣功能，轉(zhuǎn)染miR-133b模擬物可抑制前列腺癌腫瘤細(xì)胞增殖，這使得miR-133b有成為前列腺癌新的治療靶點(diǎn)的可能。本研究結(jié)果提示，miR-133b在前列腺癌組織中表達(dá)水平降低，且具有抑制前列腺癌細(xì)胞PC-3增殖的作用。但有關(guān)miR-133b對(duì)前列腺癌細(xì)胞其他生物學(xué)功能的影響及其對(duì)下游靶基因PRDM16具體作用機(jī)制尚需大量臨床試驗(yàn)加以驗(yàn)證。

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(本文編輯：許曉蒙)

Expression of miR-133b in prostate cancer and its effect on the proliferation of tumor cells

PENGLu1,LINCong2

(1.DepartmentofLaboratoryMedicine,BrainHospitalAffiliatedtoNanjingMedicalUniversity,Nanjing210009,Jiangsu; 2.DepartmentofAnesthesiology,theFirstAffiliatedHospitalofNanjingMedicalUniversity,Nanjing210009,Jiangsu,China)

Objective To investigate the expression level of miR-133b in cancer tissues of patients with prostate cancer and its effect on the proliferation of prostate cancer cells. Methods The total RNAs in resected prostate cancer tissues and adjacent tissues from 30 patients with prostate cancer were extracted and reversely transcripted into cDNA, and then the expression levels of miR-133b were detected by real-time quantitative PCR. The correlations between the expression levels of miR-133b and the patients′ clinicopathological features were analyzed. The expression of positive regulatory domain I-binding factor 16(PRDM16) and proliferation of PC-3 cells transfected with miR-133b mimics by LipofectamineTM3000 were determined by real-time quantitative PCR and the CCK8 method, respectively. Results The expression levels of miR-133b in prostate cancer tissues [(16.85±0.94)×10-4] was significantly lower than that in adjacent tissues [(22.95±1.567)×10-4,t=3.335,P< 0.01]. The expression levels of PRDM16 in PC-3 cells transfected with miR-133b mimics were significantly lower than that in the control group (0.371±0.031 vs 1.000±0.022,t=12.53,P<0.01). The proliferation ability of PC3 cells transfected with miR-133b mimics for 72 hours was significantly lower than that in the control group (t=6.811,P<0.01). Similarly, the proliferation ability of PC-3 cells transfected with PRDM16 inhibitor for 72 hours was also significantly lower than that in the control group (t=9.048,P<0.01). Conclusion The expression levels of miR-133b in prostate cancer tissues are significantly down-regulated, which regulate the proliferation of prostate cancer cells possibly through PRDM16.

prostate cancer; microRNA-133b; positive regulatory domain I-binding factor 16; proliferation

10.13602/j.cnki.jcls.2017.05.08

彭魯，1982 年生，女，主管技師，碩士，從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究，E-mail:remenber2008520@sina.com。

R734.2

A

2017-01-14)