李 昱， 宋貴軍， 林璐璐， 辛世萌， 曹云鵬

Aβ310多價腺病毒疫苗鼻粘膜免疫阿爾茨海默病轉基因鼠的炎癥反應研究

李 昱1， 宋貴軍1， 林璐璐1， 辛世萌1， 曹云鵬2

目的 探討基因重組腺病毒疫苗Ad-Aβ(3-10)10-CpG鼻粘膜免疫APPswe/PSEN1dE9雙轉基因鼠誘導的炎癥反應。方法 18只雄性10月齡APPswe/PSEN1dE9鼠，隨機分為3組，分別以Aβ3-10多價腺病毒疫苗Ad-Aβ(3-10)10-CpG、空腺病毒載體鼻粘膜免疫及Aβ1-42肽肌內注射免疫，用MTT法檢測脾細胞增殖反應、ELISA法檢測脾細胞培養(yǎng)上清和腦組織勻漿中IL-4和INF-γ水平，免疫組化法檢測腦內星形膠質細胞及淋巴細胞浸潤。結果 Ad-Aβ(3-10)10-CpG組和Aβ1-42組，在相對應的免疫原刺激孔產生較高水平的增殖率，高于非相應免疫原刺激孔(P<0.05)，但低于ConA刺激孔(P<0.05)。皮質和海馬區(qū)GFAP陽性細胞所占面積百分比為：空腺病毒載體組>Aβ1-42組>Ad-Aβ(3-10)10-CpG組。各組小鼠腦組織在血管內和腦實質偶爾發(fā)現(xiàn)個別CD3、CD5陽性細胞，3組沒有顯著差異。Ad-Aβ(3-10)10-CpG組和Aβ1-42組中在其相對應的免疫原刺激時檢測到較高水平的IL-4、IFN-γ。Aβ1-42組在Aβ1-42肽刺激孔的IFN-γ水平顯著高于Ad-Aβ(3-10)10-CpG組在Aβ3-10肽刺激孔的IFN-γ水平(P<0.05)。Ad-Aβ(3-10)10-CpG組腦組織勻漿IL-4水平大于Aβ1-42組，但沒有顯著性差異(P>0.05)，Ad-Aβ(3-10)10-CpG組腦組織勻漿中IFN-γ水平顯著小于Aβ1-42組(P<0.05)。結論 腺病毒疫苗Ad-Aβ(3-10)10-CpG鼻粘膜免疫APPswe/ PSEN1dE9雙轉基因鼠主要產生Th2型免疫應答，可以減少腦內星形膠質細胞活化，未引起腦內炎癥反應，即避免了Aβ1-42全肽段所引起的炎癥反應。

阿爾茨海默病； 淀粉樣蛋白； 炎癥反應； 星形膠質細胞

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是癡呆最常見的類型，但發(fā)病機制不明確，尚無有效的防治方法，是全世界急需解決的健康問題。早期研究發(fā)現(xiàn)，用Aβ1-42肽免疫PDAPP鼠可以減少腦內淀粉樣沉積，使轉基因鼠學習和記憶能力提高。但后期Aβ疫苗(AN1792)臨床試驗由于Ⅱa期臨床試驗6%的患者出現(xiàn)了中樞神經系統(tǒng)炎癥而被迫停止。這種副作用確切原因不清楚，推測與Aβ的T細胞抗原決定簇特異性的細胞免疫應答引起的炎癥反應有關[1]。后續(xù)免疫治療研究集中在改變免疫原和免疫方式來克服不恰當?shù)腡細胞應答引起的中樞神經系統(tǒng)炎癥。炎癥反應不但是AD的主要發(fā)病機制之一[2]，而且與免疫治療的效果及疫苗的安全性密切相關。免疫治療后進一步激活膠質細胞吞噬，參與Aβ斑的清除，但激活的膠質細胞可釋放神經毒性細胞因子進而損害腦組織[3]。一種理想的疫苗，不但要有良好的治療效果，而且不能激活體內過度的炎癥反應，引起中樞神經系統(tǒng)炎癥。

本研究前期工作已成功構建編碼10次重復N末端片段Aβ3-10和CpG序列的新型腺病毒疫苗Ad-Aβ(3-10)10-CpG，并發(fā)現(xiàn)鼻粘膜免疫AD轉基因鼠可以減少腦內Aβ沉積并改善轉基因鼠的學習和記憶功能[4，5]。本研究進一步通過脾細胞增殖反應、細胞因子測定、腦內星形膠質細胞及淋巴細胞浸潤檢測來探討腺病毒疫苗Ad-Aβ(3-10)10-CpG鼻粘膜免疫APPswe/ PSEN1dE9鼠誘導的炎癥反應。進一步評估腺病毒疫苗Ad-Aβ(3-10)10-CpG的安全性。

1 材料與方法

1.1 材料 18只10月齡APPswe/PSEN1dE9鼠，雄性，每只鼠出生后均完成鼠尾DNA鑒定，購自中國醫(yī)科大學動物部。APPswe/PSEN1dE9鼠表達鼠/人嵌合的淀粉樣蛋白前體(Mo/HuAPP695swe)和突變的人早老素1(PS1-dE9)，這兩種突變與早發(fā)性AD相關。隨機分為3組：Ad-Aβ(3-10)10-CpG 組、空腺病毒載體組、Aβ1-42組，每組6只。Aβ1-42多肽(AnaSpect)，完全弗氏佐劑(Sigma，USA)，不完全弗氏佐劑(Sigma，USA)，羊抗小鼠IgG-HRP(R&D)，小鼠IL-4 ELISA 試劑盒(Bender Med Systems@ BMS613)，小鼠 IFN-γ ELISA試劑盒(Bender Med Systems@ BMS006)，抗GFAP(武漢博士德)，兔抗小鼠CD3(Sigma，USA)，兔抗小鼠CD5(Sigma，USA)，兔抗小鼠CD45(Sigma，USA)。

1.2 實驗動物及免疫方法 Ad-Aβ(3-10)10-CpG組：Ad-Aβ(3-10)10-CpG 10 μl(1×108PFU)鼻腔免疫；空載體組：空載體10 μl(1×108PFU)鼻腔免疫；Aβ1-42組：第1次免疫用Aβ1-42肽50 μl(100 μg)+完全性弗氏佐劑(Sigma，USA)50 μl，股四頭肌肌內注射，第2次及以后免疫用Aβ1-42肽50 μl(100 μg)+不完全性弗氏佐劑(Sigma，USA)50 μl，股四頭肌肌內注射，每2 w免疫1次，共免疫7次。

1.3 MTT法檢測脾T淋巴細胞增殖反應 新鮮脾臟置于罩在裝有1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上的尼龍網(200 μm)上研磨，將細胞及培養(yǎng)基移至15 ml離心管，離心1000 r/min，4 ℃，10 min。棄上清，加入紅細胞裂解液3 ml，混勻，室溫靜置5 min。加入7 ml 1640培養(yǎng)基，混勻，離心1000 r/min，4 ℃，10 min，重復上述過程1次。棄上清，加入含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基重懸細胞。取少量細胞液稀釋50倍，用細胞計數(shù)板計數(shù)細胞，根據計數(shù)結果，將細胞液稀釋至5×106/ml。將細胞液接種至96孔細胞培養(yǎng)板，每孔加入細胞懸液100 μl。分別設置對照孔(只加細胞液)、ConA孔(含ConA終濃度2 μg/ml的細胞液)、Aβ3-10孔(含Aβ3-10終濃度20 μg/ml的細胞液)、Aβ1-42孔(含Aβ1-42終濃度20 μg/ml的細胞液)，每種刺激因素設6個復孔，每個96孔板設6個調零孔(加入100 μl含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，不含脾細胞及刺激蛋白)。置于37 ℃含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml)，放入37 ℃含5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。取出，用孔板離心機離心2000 r/min，4 ℃，10 min，收取上清-70 ℃保存。每孔加入150 μl DMSO，手搖孔板，待結晶全部溶解，用酶標儀在492 nm處測定各孔的吸光度(OD)值。各刺激抗原脾細胞增殖率=(各刺激抗原OD平均值-調零孔OD平均值)/(對照孔OD平均值-調零孔OD平均值)。

1.4 ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清及腦組織勻漿中的IL-4和IFN-γ水平 取小鼠左側半球腦組織，按濕重1：10加入0.2 M PBS，用超聲波細胞粉碎機(Xinyi-ILD)勻漿，離心 10000 r/min，5 min，4 ℃，取上清分裝-20 ℃保存。取腦組織勻漿及脾細胞培養(yǎng)上清，按照IL-4(Bender Med Systems@ BMS613)、IFN-γ(Bender Med Systems@ BMS006)試劑盒說明書操作。采用酶標儀(Elx800，BIOTEK)于450 nm處測定吸光度值(OD)，根據標準曲線計算出各樣本IL-4、IFN-γ的濃度。

1.5 免疫組化法檢測腦內星形膠質細胞及淋巴細胞浸潤 石蠟包埋的大腦右側半球，按冠狀位切片，厚約4 μm，常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水；3%雙氧水37 ℃孵育10 min以阻斷滅活內源性過氧化物酶，PBS沖洗3次，每次5 min；置0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液(pH 6.0)中煮沸5 min以抗原修復，冷卻至室溫，PBS沖洗3次，每次5 min；正常羊血清工作液封閉，37 ℃，10 min，傾去勿洗；檢測星形膠質細胞滴加兔抗小鼠GFAP 抗體(1∶200)，檢測淋巴細胞浸潤滴加兔抗小鼠CD3，CD5，CD45(1∶200)，4 ℃冰箱孵育過夜，PBS沖洗3次，每次5 min；滴加生物素標記相應的二抗，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3次，每次5 min；滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素工作液，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3次，每次5 min；DAB顯色，自來水充分沖洗；蘇木素復染5 min，常規(guī)脫水，透明，干燥，中性樹膠封片。應用Polymer雙染檢測試劑盒(Zhongshan Golden bridge Biotechnology，China)對小鼠腦內星形膠質細胞與Aβ沉積進行雙重標記。一抗為小鼠抗Aβ抗體(1∶200)和抗GFAP(1∶200)混合物，二抗為生物素標記的二抗混合物。圖像分析應用MetaMorph顯微圖像分析系統(tǒng)，計算GFAP陽性細胞所占面積百分比。

2 結 果

2.1 脾淋巴細胞增殖反應 各組小鼠的脾細胞分別用Aβ3-10肽，Aβ1-42肽及ConA刺激，用MTT法檢測體外脾細胞增殖率。加入刺激物培養(yǎng)72 h后，ConA在各組中都產生最高水平的增殖率，組間沒有顯著差異(P>0.05)；Ad-Aβ(3-10)10-CpG組和Aβ1-42組在Aβ3-10肽及Aβ1-42肽刺激孔產生較高水平的增殖率，高于非相應免疫原刺激孔(P<0.05)，但低于ConA刺激孔產生的增殖率(P<0.05)；Ad-Aβ(3-10)10-CpG組在Aβ3-10肽刺激孔產生的增殖率和Aβ1-42組Aβ1-42肽刺激孔的增值率無顯著差異(P>0.05)(見圖1)。

2.2 脾細胞培養(yǎng)上清及腦組織勻漿中IL-4、IFN-γ水平檢測 ConA刺激孔在各組中可檢測到非常高水平的IL-4、IFN-γ，對于IL-4各組間比較無差異(P>0.05)。Ad-Aβ(3-10)10-CpG組和Aβ1-42組當分別給予其相對應抗原刺激時檢測到較高水平的IL-4、IFN-γ，但都明顯低于ConA刺激產生IL-4、IFN-γ水平(P<0.01)。Ad-Aβ(3-10)10-CpG組和Aβ1-42組分別在Aβ3-10肽和Aβ1-42肽刺激孔的IL-4水平無顯著差異(P>0.05)。Aβ1-42組在Aβ1-42肽刺激孔的IFN-γ水平顯著高于Ad-Aβ(3-10)10-CpG組在Aβ3-10肽刺激孔的IFN-γ水平(P<0.05)?？障俨《据d體組在Aβ3-10肽和Aβ1-42肽刺激孔都產生較低水平的IL-4、IFN-γ。Ad-Aβ(3-10)10-CpG組腦組織勻漿IL-4水平大于Aβ1-42組，但沒有顯著性差異(P>0.05)，Ad-Aβ(3-10)10-CpG組和Aβ1-42組腦組織勻漿IL-4水平大于空腺病毒載體組(P<0.05)，Ad-Aβ(3-10)10-CpG組腦組織勻漿IFN-γ水平大于空腺病毒載體組(P<0.05)小于Aβ1-42組(P<0.05)(見圖2)。

2.3 免疫治療后APPswe/PSEN1dE9鼠腦內星形膠質細胞 在每張抗GFAP單染片子的皮質及海馬區(qū)各采集4張400倍圖像，采用MetaMorph顯微圖像分析系統(tǒng)，計算GFAP陽性細胞所占面積百分比，Ad-Aβ(3-10)10-CpG組和空腺病毒載體組相比皮質和海馬區(qū)GFAP陽性細胞所占面積百分比為分別減少28.5%和24.1%(P<0.05)。Aβ1-42組和空腺病毒載體組相比皮質和海馬區(qū)GFAP陽性細胞所占面積百分比為分別減少17.5%和19.3%(P<0.05)(見圖3)。雙染顯示GFAP陽性細胞呈深藍色、Aβ沉積呈深棕色，GFAP陽性細胞數(shù)量及被激活的形態(tài)隨著Aβ沉積數(shù)量改變而改變，GFAP陽性細胞分布于Aβ沉積的周圍及內部，對Aβ沉積呈現(xiàn)明顯的趨向聚集現(xiàn)象?？障俨《据d體組：皮質及海馬區(qū)GFAP陽性細胞密集分布，呈深棕褐色，胞漿明顯增大，突觸增多，皮質區(qū)多于海馬區(qū)，GFAP陽性細胞密集分布于老年斑周圍及內部；Aβ1-42組：GFAP陽性細胞形態(tài)上與空腺病毒載體組相比較，胞漿變小，突觸變少，稀疏分布于老年斑周圍及內部；Ad-Aβ(3-10)10-CpG組：GFAP陽性細胞，形態(tài)上胞漿更小，突觸更少，零星分布于淡紅色顆粒狀老年斑周圍及內部(見圖4)。

2.4 腦組織內淋巴細胞浸潤檢測 免疫后各組小鼠腦組織用免疫組化法檢測CD3，CD5和CD45陽性淋巴細胞。三組小鼠血管內和腦實質可以偶爾發(fā)現(xiàn)少量CD3，CD5陽性細胞，三組小鼠均未觀察到CD45陽性細胞。三組小鼠免疫組化結果未見明顯差異(見圖5)。

圖1 體外脾T淋巴細胞增殖率。Ad-Aβ(3-10)10-CpG組和Aβ1-42組在相對應抗原刺激時產生較高水平的增殖率，*與空腺病毒載體組比較P<0.05，#與Aβ1-42組比較P>0.05

3 討 論

研究表明小鼠和人的Aβ分子的B細胞抗原決定簇定位在Aβ1-15，T細胞抗原決定簇定位在Aβ的中間區(qū)域和C末端[6]。本研究用編碼10次重復N末端片段Aβ3-10和CpG序列的新型腺病毒疫苗Ad-Aβ(3-10)10-CpG鼻粘膜免疫AD轉基因鼠，通過MTT法檢測體外脾T淋巴細胞增殖反應來觀察Ad-Aβ(3-10)10-CpG引起的免疫反應只針對Aβ的B細胞抗原決定簇還是Aβ全肽段。脾T淋巴細胞增殖反應結果顯示：只有當Ad-Aβ(3-10)10-CpG組給予Aβ3-10刺激時能產生較高的增殖率，提示Ad-Aβ(3-10)10-CpG引起了針對Aβ的B細胞抗原決定簇(Aβ3-10)，而不是Aβ全肽段的免疫應答。這樣可以避免T細胞抗原決定簇特異性的細胞免疫應答引起的炎癥反應。近期研究也發(fā)現(xiàn)編碼Aβ3-10的質粒疫苗也能引起針對Aβ的B細胞抗原決定簇的免疫應答[7]，同時減少腦內炎癥反應。

CD4+T輔助細胞可以分為五種功能性亞群，分別為Th1，Th2，Th3，Th7和調節(jié)性T細胞(Tregs)[8]，其中Th1和Th2是兩個重要的功能性亞群。Th1細胞主要分泌IL-2、IFN-γ等因子，Th1介導細胞免疫、細胞毒性T細胞和巨噬細胞活化；Th2細胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-8等因子，Th2介導體液免疫、B細胞和嗜酸性粒細胞活化。其中IL-4、IFN-γ是判斷Th細胞類型的主要細胞因子[9]，因此通過檢測細胞因子，可以判斷免疫所刺激的Th細胞類型。在脾細胞培養(yǎng)上清中，Ad-Aβ(3-10)10-CpG組和Aβ1-42組在相應抗原刺激時分泌較多的IL-4、IFN-γ，Ad-Aβ(3-10)10-CpG組和Aβ1-42組IL-4水平差別不明顯，說明兩組誘導的Th2反應相當，但Aβ1-42組IFN-γ水平明顯高于Ad-Aβ(3-10)10-CpG組，說明Aβ1-42誘導了明顯的Th1反應。Aβ1-42組腦組織勻漿中IFN-γ水平明顯高于Ad-Aβ(3-10)10-CpG組，說明Aβ1-42上調了與炎癥反應有關的IFN-γ釋放。細胞因子檢測結果提示：Ad-Aβ(3-10)10-CpG比Aβ1-42多肽疫苗減少了誘導與神經系統(tǒng)炎癥有關的Th1免疫應答的趨勢。

免疫后三組小鼠血管內和腦實質可以偶爾發(fā)現(xiàn)少量CD3，CD5陽性細胞，三組小鼠均未觀察到CD45陽性細胞。這與AD患者接受Aβ1-42疫苗后發(fā)生腦膜腦炎的病理改變不同[1]。這與以往的研究結果相似[7，10]。說明Ad-Aβ(3-10)10-CpG鼻粘膜免疫沒有引起腦膜腦炎的潛在危險。

在AD患者腦組織中，Aβ斑塊周圍有明顯的星形膠質細胞活化，APPswe/PSEN1dE9雙轉基因鼠腦內星形膠質細胞聚集與Aβ沉積明顯相關。星形膠質細胞可以產生炎性因子，促進Aβ聚集和纖維化轉化[11]。研究表明，星形膠質細胞可以內化和降解Aβ，超微結構觀察發(fā)現(xiàn)星形膠質細胞通過延長突起將神經元和纖維化Aβ分離，將Aβ內吞至內體/溶酶體[12]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，Aβ聚集和被星形膠質細胞內吞通過改變神經元的代謝嚴重影響其活性[13]。在本研究中，GFAP陽性細胞所占面積百分比在Aβ1-42組及Ad-Aβ(3-10)10-CpG組明顯減少，說明隨著Aβ斑塊的清除對膠質細胞的激活減少，Ad-Aβ(3-10)10-CpG可以下調對星形膠質細胞的激活，減少了膠質細胞活化對神經元的損害。

綜上所述，腺病毒疫苗Ad-Aβ(3-10)10-CpG鼻粘膜免疫APPswe/ PSEN1dE9轉基因鼠主要產生Th2型免疫應答，可以減少腦內星形膠質細胞活化，沒有引起腦內炎癥反應，避免了Aβ1-42全肽段所引起的炎癥反應。基因重組腺病毒疫苗Ad-Aβ(3-10)10-CpG具有良好的安全性。

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Inflammatory response after intranasal inoculation with an adenovirus vaccine encoding multivalent Aβ3-10in Alzheimer’s disease transgenic mice

LIYu，SONGGuijun，LINLulu，etal.

(DepartmentofNeurology，TheSecondAffiliatedHospitalofDalianMedicalUniversity，Dalian116027，China)

Objective To study the inflammatory response after intranasal inoculation with a recombinant adenovirus vaccine Ad-Aβ(3-10)10-CpG in APPswe/PSEN1dE9 transgenic mice. Methods Eighteen ten-month old male APPswe/PSEN1dE9 mice were divided into three groups and immunized with recombinant adenovirus vaccine Ad-Aβ(3-10)10-CpG，empty adenoviral vector and Aβ1-42peptide，representatively. SpleenT-cell proliferation response was determined with MTT assay. Levels of IL-4 and INF-γ in spleen cell culture supernatant and brain homogenate were determined with ELISA. Astrocytes and CD3，CD5 and CD45 positive cells in the brain were detected with immunohistochemistry. Results Ad-Aβ(3-10)10-CpG group and Aβ1-42peptide group showed higher levels of proliferation rate restimulated with its corresponding antigen(P<0.05)，but lower than the ConA-stimulated wells(P<0.05). The percentage of area of GFAP positive cells in cortex and hippocampus was as follows：empty vector group>Aβ1-42peptide group>Ad-Aβ(3-10)10-CpG group. A very few CD5-positive and CD3-positive lymphocytes were occasionally observed within the blood vessels or in the parachyma in all three groups of mice. There were no significant different in all three groups. Ad-Aβ(3-10)10-CpG and Aβ1-42peptide group exhibited significantly greater IL-4 and IFN-γ levels in the cultures of spleen T cells restimulated with its corresponding antigen. Mice immunized with Aβ1-42peptide exhibited the greater IFN-γ levels in spleen T cells restimulated with Aβ1-42peptide than mice immunized with Ad-Aβ(3-10)10-CpG(restimulated with Aβ3-10)(P<0.05). IL-4 levels in brain homogenates from mice of Ad-Aβ(3-10)10-CpG group were greater than that of Aβ1-42peptide group，but the diffrence was not significant(P>0.05). IFN-γ levels in brain homogenates of Aβ1-42peptide group was greater than that of Ad-Aβ(3-10)10-CpG group(P<0.05). Conclusion Intranasal inoculation with a recombinant adenovirus vaccine Ad-Aβ(3-10)10-CpG appeared to induce a Th2 type immune response and reduction of astrocytosis without causing neuroinflammation in the brain. Ad-Aβ(3-10)10-CpG had low potential to cause autoimmune response caused by Aβ1-42peptide.

Alzheimer’s disease； β-amyloid； Inflammatory response； Astrocyte

圖2 脾淋巴細胞培養(yǎng)上清及腦組織勻漿的IL-4/IFN-γ水平測定。(A)(B)脾細胞培養(yǎng)上清中IL-4/IFN-γ。(C)(D)腦組織勻漿中IL-4/IFN-γ。在相應抗原刺激時脾淋巴細胞培養(yǎng)上清有較高水平的IL-4(A)和 IFN-γ(B)。(A)*和空載體組比較P<0.05，#和Aβ1-42組比較P>0.05。(B)*和Ad-Aβ(3-10)10-CpG組與空載體組比較P<0.05，# 與空腺病毒載體組比較P<0.05。(C)*和空腺病毒載體組比較P<0.05，#和Aβ1-42組比較P>0.05。(D)* 和空腺病毒載體組比較P<0.05，# 和Aβ1-42組比較P<0.05

圖3 免疫后各組小鼠GFAP陽性細胞分析。Ad-Aβ(3-10)10-CpG組(B1，B2)和Aβ1-42組(C1，C2)海馬和皮質GFAP陽性細胞與空腺病毒載體組(A1，A2)相比明顯減少。(D)海馬和皮質GFAP陽性細胞所占面積百分比的定量分析，*和空腺病毒載體組相比P<0.05。比例尺代表 50μm

圖4 Aβ和GFAP雙染。(A)空腺病毒載體組，大量GFAP陽性細胞聚集在Aβ斑塊周圍和內部。(B)Ad-Aβ(3-10)10-CpG組和(C)Aβ1-42組可見散在的GFAP陽性細胞。比例尺代表50μm

圖5 三組小鼠免疫后腦組織淋巴細胞浸潤檢測。在三組中均未發(fā)現(xiàn)廣泛的CD3，CD5，CD45陽性細胞。在血管周圍和腦實質偶爾可以發(fā)現(xiàn)少量CD3陽性和CD5陽性細胞。比例尺代表100μm

2017-03-12；

2017-04-23

國家自然科學基金(No. 81371227) 作者單位：(1.大連醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院神經內科，遼寧 大連 116027；2.中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院神經內科，遼寧 沈陽 110001)

曹云鵬，E-mail：cypcmu@163.com

1003-2754(2017)05-0393-05

R749.1

A