李青+張國(guó)霞+陳奕睿+汪正+丁傳賢

摘 要 采用213 nm納秒激光剝蝕系統(tǒng)對(duì)生物基體樣品的剝蝕顆粒進(jìn)行研究，優(yōu)化了激光剝蝕條件。在剝蝕能量為25%，束斑直徑為200 μm，剝蝕速率為20 μm/s，頻率為20 Hz，載氣為700 mL He + 700 mL Ar時(shí)，信號(hào)強(qiáng)度及穩(wěn)定性最佳。以31P為內(nèi)標(biāo)元素，最佳剝蝕條件下，考察了56個(gè)元素的相對(duì)分餾因子。結(jié)果表明，生物基體的剝蝕顆粒相較于NIST 610 玻璃標(biāo)樣更大，達(dá)到3 μm；生物基體中元素分餾效應(yīng)相較于玻璃基體小，大多數(shù)元素的相對(duì)分餾因子達(dá)到1.0 ±0.1。探討了生物基體中元素分餾機(jī)理，分析了生物基體相較于玻璃基體剝蝕顆粒大，而相對(duì)分餾因子未明顯增大的原因。一方面可能是粒徑3 μm的顆粒進(jìn)入電感耦合等離子體后能原子化；另一方面，大的剝蝕顆粒的富集效應(yīng)相對(duì)較小。進(jìn)一步對(duì)分餾效應(yīng)的影響因素進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)分餾效應(yīng)與激光剝蝕能量、激光頻率和掃描速率相關(guān)，并且與元素的氧化物沸點(diǎn)負(fù)相關(guān)，與氧化物鍵能和電離能正相關(guān)。

關(guān)鍵詞 激光剝蝕電感耦合等離子體質(zhì)譜； 納秒激光； 分餾效應(yīng)； 生物樣品

1 引 言

近年來(lái)，激光剝蝕電感耦合等離子體質(zhì)譜法（LAICPMS） 作為一種重要的原位微區(qū)分析技術(shù)手段，具有空間分辨率高、檢出限低等特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于地球化學(xué)、冶金、生物醫(yī)藥等領(lǐng)域[1～4]。尤其是在生物醫(yī)藥領(lǐng)域，研究者采用LAICPMS研究抗癌藥物在靶器官中的分布，并將其應(yīng)用到蛋白組學(xué)、金屬組學(xué)等領(lǐng)域[5，6]。然而LAICPMS仍面臨著巨大的挑戰(zhàn)——定量校準(zhǔn)[4]。為克服這一難題，研究者建立了基體匹配[7]、內(nèi)標(biāo)校正[7]、在線溶液校準(zhǔn)[8]等方法，但仍難于達(dá)到溶液樣品進(jìn)樣ICPMS分析定量校準(zhǔn)的線性和標(biāo)準(zhǔn)偏差要求，主要原因在于激光物質(zhì)相互作用的復(fù)雜性，例如分餾效應(yīng)[9]。

分餾效應(yīng)是指不同元素在剝蝕蒸發(fā)及傳輸過(guò)程中行為的差異，測(cè)得的樣品組分與樣品組成有一定差異，即元素的非計(jì)量剝蝕。它的基體差異性發(fā)生在樣品剝蝕、傳輸、蒸發(fā)、原子化和電離過(guò)程中。對(duì)分餾效應(yīng)的研究多集中在硅酸鹽樣品或是金屬基質(zhì)樣品[10，11]，研究了分餾效應(yīng)與激光波長(zhǎng)、激光脈沖寬度、激光能量、激光束斑及在ICP中的傳輸和離子化的影響[12，13]。但對(duì)于生物樣品的分餾效應(yīng)研究卻較少。目前，LAICPMS方法在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，使得對(duì)生物樣品分餾效應(yīng)的研究顯得尤為重要。

本研究以動(dòng)物組織為研究對(duì)象，研究了213 nm納秒激光剝蝕系統(tǒng)對(duì)生物基體樣品的剝蝕顆粒，考察了常見(jiàn)元素和微量元素的分餾效應(yīng)，探討了元素分餾機(jī)理，并對(duì)分餾效應(yīng)的影響因素進(jìn)行了研究。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器及參數(shù)

采用LSX213型號(hào)213 nm激光剝蝕系統(tǒng)（美國(guó)Cetac公司）與Thermo X Series Ⅱ電感耦合等離子體質(zhì)譜儀 （美國(guó) ThermoFisher Scientific公司） 聯(lián)用的 LAICPMS 系統(tǒng)。ICPMS的主要工作參數(shù)選擇見(jiàn)表 1。

2.2 試劑

2.3 實(shí)驗(yàn)樣品

實(shí)驗(yàn)所用生物基體樣品均為實(shí)驗(yàn)室自行配制的標(biāo)準(zhǔn)樣品。取豬腎（購(gòu)于本地超市）切成0.5 cm×0.5 cm薄片，在真空干燥箱中烘干， 待用。配制100和1000 μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液，用移液槍取6.8 μL滴至豬腎切片上，室溫下自然風(fēng)干。對(duì)自行配制的標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行線掃描剝蝕，其標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.99～0.999， 信號(hào)RSD<6.5%，認(rèn)為配制的標(biāo)準(zhǔn)樣品具備元素分布均勻性和數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性，可用于分餾效應(yīng)研究。

實(shí)驗(yàn)玻璃基體樣品為美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究院（NIST）合成玻璃標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) NIST 610。

2.4 激光剝蝕顆粒的收集及表征

在最佳激光剝蝕條件下剝蝕生物基體樣品和玻璃基體樣品（NIST610），產(chǎn)生的剝蝕氣溶膠通過(guò)載氣輸出，在輸出口放置干凈硅片并固定，收集30 min剝蝕顆粒后，將硅片密封，待測(cè)。利用場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（JSM6700F，日本電子株式會(huì)社）表征激光剝蝕顆粒形貌。

3 結(jié)果與討論

3.1 激光參數(shù)優(yōu)化

為獲得最優(yōu)信號(hào)強(qiáng)度及穩(wěn)定性，以Cr為例，對(duì)激光剝蝕能量、束斑直徑、掃描速率、頻率和載氣進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果如圖1所示。結(jié)果表明，當(dāng)剝蝕能量為25%，束斑直徑為200 μm，剝蝕速率為20 μm/s，頻率為20 Hz，載氣為He + Ar=700 mL+700 mL時(shí)，信號(hào)強(qiáng)度及RSD最佳。

3.2 分餾效應(yīng)機(jī)理探討

本研究所使用的是納秒激光剝蝕系統(tǒng)， 相對(duì)于飛秒激光剝蝕系統(tǒng)分餾效應(yīng)更強(qiáng)。這主要是由于納秒激光的脈沖持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，通過(guò)雪崩電離獲得激光能量的電子在脈沖結(jié)束前會(huì)將能量傳遞給晶格，因此在一定聚焦體積內(nèi)，通過(guò)熱聚焦使樣品局部被加熱，導(dǎo)致化學(xué)鍵斷裂和部分熔融。樣品內(nèi)產(chǎn)生的熱梯度導(dǎo)致從聚焦區(qū)至周?chē)臒醾鬟f擴(kuò)散，使得樣品的剝蝕和熔融區(qū)遠(yuǎn)大于初始聚焦區(qū)。正是這種熱效應(yīng)導(dǎo)致樣品產(chǎn)生大小不一的顆粒。Kuhn等[15]對(duì)玻璃標(biāo)樣的分餾效應(yīng)進(jìn)行研究，收集了不同粒徑范圍的剝蝕顆粒，測(cè)定了其中的成分，發(fā)現(xiàn)剝蝕顆粒大小對(duì)分餾效應(yīng)有直接影響，粒徑小于125 nm和340 nm的剝蝕顆粒中Cu， Zn， Ag， Tl， Pb 和 Bi等易揮發(fā)元素相較于Ca出現(xiàn)明顯富集；但其中不完全蒸發(fā)、原子化、離子化的大顆粒是分餾效應(yīng)的主要原因[15]。由于激光剝蝕條件和基體會(huì)產(chǎn)生不同的剝蝕顆粒，造成不同的元素分餾效應(yīng)，因此我們對(duì)生物基體樣品和玻璃基體標(biāo)樣的剝蝕顆粒進(jìn)行表征，比較了兩種不同基體間的分餾效應(yīng)。 圖2為生物基體和玻璃基體標(biāo)樣的剝蝕顆粒SEM表征圖。從圖2可見(jiàn)，生物基體的剝蝕顆粒約為3 μm，且多為較規(guī)則的球形；玻璃基體的剝蝕顆粒小于0.5 μm，其形狀多不規(guī)則；生物基體的剝蝕顆粒較玻璃標(biāo)樣的大，這可能是由于基質(zhì)不同導(dǎo)致；生物樣品剝蝕的激光能量閾值較低[16]，在相同剝蝕條件下，生物樣品所受到的激光能量密度超出其閾值，導(dǎo)致能量快速轉(zhuǎn)移進(jìn)入材料，在其融化的樣品表面產(chǎn)生微米級(jí)顆粒，同時(shí)較大的顆粒也會(huì)發(fā)生團(tuán)聚[9，17]。

選取生物基體中31P 元素為內(nèi)標(biāo)，在上述優(yōu)化的最佳剝蝕條件下對(duì)大部分ICPMS可測(cè)元素相對(duì)分餾因子進(jìn)行考察，結(jié)果如圖3所示。實(shí)驗(yàn)未選用13C為內(nèi)標(biāo)元素，是考慮到國(guó)內(nèi)供應(yīng)的氦氣和氬氣中13C 的背景通常較高，不宜使用這種方法[18]。結(jié)果表明，生物基體中多數(shù)元素的分餾因子為1.0 ±0.1。與玻璃基體相比，生物基體中元素分餾因子較小，這可能是由于基體組成元素及元素間的相互作用有關(guān)。玻璃基體中，剝蝕產(chǎn)生的顆粒越小，元素分餾效應(yīng)越大，尤其是易揮發(fā)元素（Ag， Cd， In等）受剝蝕顆粒粒徑影響更為明顯[19]。雖然生物基體剝蝕顆粒的粒徑大于玻璃基體，但研究表明粒徑小于5 μm的顆粒進(jìn)入ICP后能夠原子化[20]；另一方面，根據(jù)剝蝕顆粒的SEM表征結(jié)果說(shuō)明生物基體中大剝蝕顆粒較多，而大顆粒的富集效應(yīng)相對(duì)較小，因此生物基體的相對(duì)分餾因子相較于玻璃基體更接近1。

3.3 不同激光參數(shù)對(duì)分餾效應(yīng)的影響

本研究所用的激光剝蝕能量均為25%，通過(guò)在線掃描的模式下，改變束斑直徑分別為50、100和200 μm， 考察激光剝蝕能量密度對(duì)生物基體樣品中V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Ag、Cd、Tl、Pb等元素的分餾效應(yīng)的影響，結(jié)果如圖4A所示。在束斑直徑為200 μm，頻率為20、10和5 Hz時(shí)考察頻率對(duì)分餾效應(yīng)的影響。如圖4B所示，激光頻率對(duì)分餾效應(yīng)影響較大。隨著頻率增大，相同時(shí)間內(nèi)剝蝕下來(lái)的樣品越多，相對(duì)分餾因子更接近1.0；當(dāng)頻率降至10 Hz時(shí)，相對(duì)分餾因子超出了1.0 ±0.1的范圍。圖4C為激光剝蝕速率分別30，20，10 μm/s對(duì)分餾效應(yīng)的影響，發(fā)現(xiàn)隨著剝蝕速率的減小，相對(duì)分餾因子更接近1。

即束斑直徑為200 μm，頻率為20 Hz，剝蝕速率為10 μm/s時(shí)，相對(duì)分餾因子多在1.0附近。難熔元素如V，Co，F(xiàn)e等的相對(duì)分餾因子與易揮發(fā)元素（如Tl、Cd、Zn等）的波動(dòng)較小。隨著剝蝕量的增加，元素在剝蝕氣溶膠中的富集效應(yīng)更小，更能體現(xiàn)標(biāo)樣的均勻性，使得相對(duì)分餾因子更接近1.0。

進(jìn)一步對(duì)分餾效應(yīng)的影響因素進(jìn)行研究，在上述最佳激光剝蝕條件下，考察了分餾效應(yīng)與電離能、氧化物沸點(diǎn)和鍵能的關(guān)系。從圖5可見(jiàn)，元素相對(duì)分餾因子和元素氧化物沸點(diǎn)呈負(fù)相關(guān)，與電離能和氧化物鍵能呈正相關(guān)[20]，表明氧化物沸點(diǎn)低的元素容易原子化，其相對(duì)分餾因子增大；電離能和氧化物鍵能低的元素非金屬性越強(qiáng)，相應(yīng)的氧化物熔點(diǎn)越高，同理，在ICP中原子化能力越差，因此其相對(duì)分餾因子越小。

4 結(jié) 論

本研究以動(dòng)物組織為研究對(duì)象，研究了213 nm納秒激光剝蝕系統(tǒng)對(duì)生物基體樣品和玻璃基體標(biāo)準(zhǔn)樣品的剝蝕顆粒。形貌表征結(jié)果表明，生物基體的剝蝕顆粒相較于NIST 610 玻璃標(biāo)樣更大，達(dá)到3 μm。以31P為內(nèi)標(biāo)元素，利用相對(duì)分餾因子考察了各元素的分餾效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)生物基體中元素分餾效應(yīng)相較于玻璃基體小，大多數(shù)元素的相對(duì)分餾因子達(dá)到1.0 ± 0.1。探討了生物基體中元素分餾機(jī)理，分析了生物基體相比于玻璃基體剝蝕顆粒大，而相對(duì)分餾因子未明顯增大的原因。一方面可能是粒徑3 μm的顆粒進(jìn)入ICP后仍能原子化；另一方面，大剝蝕顆粒的富集效應(yīng)相對(duì)較小。進(jìn)一步對(duì)分餾效應(yīng)的影響因素進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，分餾效應(yīng)與剝蝕量有直接關(guān)系，并且分餾效應(yīng)與氧化物沸點(diǎn)呈負(fù)相關(guān)，而與電離能和氧化物鍵能呈正相關(guān)。由于分餾效應(yīng)不能完全避免，因此在研究時(shí)應(yīng)根據(jù)需求對(duì)分餾效應(yīng)、信號(hào)強(qiáng)度及穩(wěn)定性有所取舍。本研究為生物樣品LAICPMS法準(zhǔn)確定量分析的可行性提供了重要信息。

References

1 GarbeSchnberg D， Müller S. J. Anal. At. Spectrom.， 2014， 29（6）： 990-1000

2 WANG Ying， GUO YanLi， YUAN HongLin， WEI YongFeng， YAN HongTao， CHEN HuiHui. Spectroscopy and Spectral Analysis， 2012， 32（1）： 223-228

王 穎， 郭艷麗， 袁洪林， 魏永鋒， 閆宏濤， 陳慧慧. 光譜學(xué)與光譜分析， 2012， 32（1）： 223-228

3 ZHANG XinYing， ZHENG LingNa， WANG HaiLong， SHI JunWen， FENG WeiYue， LI Liang， WANG Meng. Chinese J. Anal. Chem.， 2016， （11）： 1646-1651

張欣穎， 鄭令娜， 王海龍， 史俊穩(wěn)， 豐偉悅， 李 亮， 王 萌. 分析化學(xué)， 2016， （11）： 1646-1651

4 Pozebon D， Scheffler G L， Dressler V L， Nunes M A G. J. Anal. At. Spectrom.， 2014， 29（12）： 2204-2228

5 Lum T S， Tsoi Y K， YueP YK， LeungK S Y. Microchem. J.， 2016， 127： 94-101

6 MorenoGordaliza E， Giesen C， Lazaro A， EstebanFernandez D， Humanes B， Canas B， Panne U， Tejedor A， Jakubowski N， GomezGomez M M. Anal. Chem.， 2011， 83（20）： 7933-7940

7 Austin C， Fryer F， Lear J， Bishop D， Hare D， Rawling T， Kirkup L， McDonagh A， Doble P. J. Anal. At. Spectrom.， 2011， 26（7）： 1494-1501

8 Pozebon D， Dressler V L， Mesko M F， Matusch A， Becker J S. J. Anal. At. Spectrom.， 2010， 25（11）： 1739-1744

9 Niehaus R， Sperling M， Karst U. J. Anal. At. Spectrom.， 2015， 30（10）： 2056-2065

10 Loewen M W， KentA J R. J. Anal. At. Spectrom.， 2012， 27（9）： 1502-1508

11 Zhang S， He M， Yin Z， Zhu E， Hang W， Huang B. J. Anal. At. Spectrom.， 2016， 31（2）： 358-382

12 Horn I， Günther D. Appl. Surf. Sci.， 2003， 207（14）： 144-157

13 Horn I， Guillong M， Gunther D. Appl. Surf. Sci.， 2001， 182（12）： 91-102

14 Gunther D， Jackson S E， Longerich H P. Spectrochim. Acta B， 1999， 54（34）： 381-409

15 Kuhn H R， Günther D. J. Anal. At. Spectrom.， 2004， 19（9）： 1158-1164

16 Benesova I， Dlabkova K， Zelenak F， Vaculovic T， Kanicky V， Preisler J. Anal. Chem.， 2016， 88（5）： 2576-2582

17 Paltauf G， SchmidtKloiber H. Laser.Surg. Med.， 1995， 16（3）： 277-287

18 WANG Qi， ZHANG Wen， WANG LiYun， LIU YongSheng， HU ShengHong， HU ZhaoChu. Spectrosc. and Spect. Anal.， 2011， 31（12）： 3379-3383

汪 奇， 張 文， 王立云， 劉勇勝， 胡圣虹， 胡兆初. 光譜學(xué)與光譜分析， 2011， 31（12）： 3379-3383

19 Ebdon L， Foulkes M， Sutton K. J. Anal. At. Spectrom.， 1997， 12（2）： 213-229

20 WU ShiTou， WANG YaPing， XU ChunXue， YUAN JiHai. Chinese J. Anal. Chem.， 2016， 44（7）： 1035-1041

吳石頭， 王亞平， 許春雪， 袁繼海. 分析化學(xué)， 2016， 44（7）： 1035-1041

Abstract The ablated aerosols of biological matrix sample were studied using 213 nm nanosecond laser ablation system. The stable signal intensity and high sensitivity were obtained when the laser energy was 25%， the spot size was 200 μm， the scan rate was 20 μm/s， the frequency was 20 Hz and the carrier gas was 700 mL He + 700 mL Ar. Relative fractionation index of 56 elements were investigated and 31P as the internal standard element was selected under the optimized laser ablation conditions. The results showed that particle size of the biological sample was 3 μm， which was larger compared with NIST 610 sample. Element fractionation in biological sample was smaller than in glass sample， and relative fractionation index of most elements attained 1.0 ± 0.1. Element fractionation mechanism of biological sample was discussed. The possible reason why the relative fractionation index in biological sample with large particle size did not significantly increase compared to the glass sample is that the 3μm particles entered into ICP can be atomized. On the other hand， enrichment effect for large ablation particles was relatively small. Further study of the influence factors of fractionation effect indicated that， the fractionation effect had relations with laser ablation energy， laser frequency and scan rate， negatively relation with the oxide boiling point， and positively relation with oxide bond energy and ionization energy.

Keywords Laser ablationinductively coupled plasmamass spectrometry； Nanosecond laser； Fractionation effect； Biological sample