姚怡+張建林+趙虹

【摘要】 目的：研究叉頭框蛋白O3a（forkhead box protein O3a，F(xiàn)oxO3a）下調(diào)對人腎小管上皮細胞（HK-2）上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的影響和機制。方法：體外培養(yǎng)HK-2細胞，10 ng/mL TGF-β1誘導HK-2細胞建立EMT細胞模型，Western blot檢測E-cadherin、α-SMA表達，證明細胞EMT模型建立成功。Western blot檢測在EMT細胞和正常細胞中轉(zhuǎn)錄因子FoxO3a的表達變化。敲低正常HK-2細胞中的FoxO3a后，Western blot檢測細胞的EMT程度。Western blot檢測EMT細胞與低表達FoxO3a細胞中β-Catenin的表達變化。結(jié)果：TGF-β1處理HK-2細胞作用后E-cadherin表達量顯著減少（P<0.01），α-SMA蛋白表達量明顯增加（P<0.05），證明EMT細胞模型建立成功。與正常HK-2細胞相比，EMT細胞中轉(zhuǎn)錄因子FoxO3a顯著減少（P<0.01）。敲低HK-2細胞中的FoxO3a后，E-cadherin表達量顯著減少（P<0.01），α-SMA蛋白表達量明顯增加（P<0.05），出現(xiàn)EMT現(xiàn)象。相比于正常細胞，EMT細胞的β-Catenin表達增加（P<0.05）；FoxO3a敲低的細胞中β-Catenin表達也顯著增加（P<0.01）。結(jié)論：HK-2細胞通過降低轉(zhuǎn)錄因子FoxO3a的表達，從而上調(diào)β-Catenin，促進細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化。

【關鍵詞】 腎小管上皮細胞； FoxO3a； β-Catenin； 上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化

【Abstract】 Objective：To explore the effect and mechanism of forkhead box proteinO3a knocking down on the epithelial-to-mesenchymal transition of HK-2 human renal proximal tubular cells.Method：HK-2 cells cultured in vitro，10 ng/mL TGF-β1 induced EMT of HK-2 cells，The expression levels of E-cadherin，α-SMA were determined by Western blot and immunofluorescence assay.The expression of FoxO3a in EMT of HK-2 cells and HK-2 cells were determined by Western blot.Knocking down FoxO3a in the HK-2 cells，the levels of EMT marker proteins were determined by Western blot.The expression level of β-catenin in the EMT of HK-2 cells and low expression FoxO3a of the cells were determined by Western blot.Result：Compared with HK-2 cells incubated with free TGF-β1，the protein expression of E-cadherin significantly decreased（P<0.01），and the expression levels ofα-SMA markedly increased in HK-2 cells（P<0.05）.The expression levels of FoxO3a markedly diminished（P<0.01）in HK-2 cells by the inducement of TGF-β1.In knocking down FoxO3a of HK-2 cells，the protein expression of E-cadherin significantly decreased（P<0.01），and α-SMA markedly increased.The expression level of β-catenin in the EMT of HK-2 cells and low expression FoxO3a of the cells significantly increased by Western blot.Conclusion：Down-regulation of FoxO3a could promote EMT of human renal proximal tubular epithelial cells by increasing the expression levels of β-catenin.

【Key words】 Renal proximal tubular cells； FoxO3a； β-Catenin； Epithelial to mesenchymal transition

First-authors address：School of Basic Medical Sciences，Shanxi Medical University，Taiyuan 030000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.13.010

慢性腎臟疾?。╟hronic kidney disease，CKD）由于其發(fā)病率高以及增加發(fā)生晚期腎臟疾病和心血管疾病的風險，極大地威脅到人類健康[1]。纖維化是所有慢性腎臟疾病的典型性特征，其是因多種病理性因素造成腎臟損傷后，持續(xù)的炎癥反應使得多種促纖維化細胞因子及血管活性物質(zhì)表達增加，導致細胞外基質(zhì)在腎臟間質(zhì)性腔隙的過度沉積而形成瘢痕[2]。腎實質(zhì)主要由腎小管上皮細胞組成，腎臟損傷后極易受到影響，所以腎小管上皮細胞受損被認為是進行性腎臟疾病的主要過程。受損的腎小管細胞通過失去上皮標記物和獲得間質(zhì)標記物的過程，完成上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程（Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT）增加了腎臟肌成纖維細胞的數(shù)量[3]。腎臟肌成纖維細胞的一種活性形式是α-平滑肌肌動蛋白陽性肌成纖維細胞，這種細胞被廣泛認為是在腎纖維化中產(chǎn)生基質(zhì)的主要細胞類型。叉頭框蛋白（forkhead box protein，F(xiàn)OX）家族是調(diào)控纖維化的重要轉(zhuǎn)錄因子，其重要成員叉頭框蛋白O3a（forkhead box proteinO3a， FoxO3a）可以通過抑制β-Catenin的表達，從而達到抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化[4-7]。誘導上皮細胞EMT過程中，轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β1）是其中重要的誘導因子[8]。于是本文章通過TGF-β1誘導HK-2細胞建立EMT模型，觀察FoxO3a轉(zhuǎn)錄因子是否與人腎小管細胞EMT過程有關，并且檢測正常細胞低表達FoxO3a后，細胞EMT的程度。研究細胞EMT后，β-Catenin的表達變化是否與細胞低表達FoxO3a后一致，從而探討在腎臟細胞中FoxO3a是否通過β-Catenin調(diào)節(jié)對細胞EMT產(chǎn)生的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑 人腎小管上皮細胞（HK-2）（中國科學院上海生命科學研究院）；Recombinant Human TGF-β1（PEPROTECH）；DMEM/F12（HyClone）；胎牛血清（Scien Cell）；FoxO3a-siRNA、Control-siRNA、FoxO3a抗體、E-cadherin抗體、β-Catenin抗體（Cell Signaling）；α-SMA抗體（Abcam）鼠抗GAPDH抗體、辣根酶標記山羊抗兔IgG、辣根酶標記山羊抗鼠IgG、FITC標記山羊抗兔IgG（北京中杉金橋）；CY3-羊抗兔IgG（博士德生物）。Lipofectamine RNAiMAX （invitrogen）。

1.2 HK-2細胞培養(yǎng) 配制含有10%胎牛血清及1%青鏈霉素的DMEM/F12完全培養(yǎng)基，將細胞置于5% CO2、37 ℃的環(huán)境下培養(yǎng)。使用0.05%的胰酶含EDTA進行傳代，每3～4天傳代一次。待細胞的融合率達到20%～30%，無血清培養(yǎng)12 h，將細胞分為對照組（Control）和給藥組（Treated）。對照組（-）繼續(xù)無血清培養(yǎng)，給藥組（+）加入濃度為10 ng/mL TGF-β1的無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)72～96 h后收集細胞進行實驗。

1.3 細胞總蛋白的提取和Western blot檢測 每孔加入RIPA裂解液（碧云天）70 μL，將細胞置于冰上裂解30 min后，收集細胞裂解液到EP管中，4 ℃ 12 000 r/min離心5 min。將上清液轉(zhuǎn)移至新的EP管作為細胞蛋白樣品，用BCA法測總蛋白濃度，蛋白樣品100 ℃變性10 min進行電泳，每次上樣量為60 μg。使用10%的十二烷基硫酸鈉–聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜上。5%的脫脂奶粉在室溫下封閉2 h。一抗孵育4 ℃搖床過夜，一抗?jié)舛葹镋-Cadherin（1∶1000）、α-SMA（1∶1000）、FoxO3a（1∶1000）、β-Catenin（1∶1000）、GAPDH（1∶1000）。洗膜。用辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠或山羊抗兔二抗（1∶5000）稀釋液室溫孵育1.5 h，洗膜，化學發(fā)光法ECL法顯色。使用Image J軟件對Western條帶灰度進行定量分析，以GAPDH為內(nèi)參。

1.4 轉(zhuǎn)染實驗 待正常HK-2細胞融合率達40%～50%，棄去細胞培養(yǎng)基，PBS沖洗2次。六孔板每孔加2 mL無血清培養(yǎng)基，把稀釋的Lipofectamine RNAiMAX和稀釋的FoxO3a-siRNA及Control-siRNA混勻靜置20 min。將Control-siRNA-Lipofectamine RNAiMAX 混合液加入細胞為NC組，F(xiàn)oxO3a-siRNA-Lipofectamine RNAiMAX混合液加入孔中為siRNA組。培養(yǎng)6 h后，加藥誘導72 h，收集細胞進行檢測。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用GraphPad Prism 5軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 TGF-β1誘導HK-2細胞產(chǎn)生EMT后FoxO3a表達量情況 HK-2細胞中，10 ng/mL TGF-β1作用72 h后，Western blot檢測上皮標記物E-Cadherin表達降低（P<0.01），間質(zhì)細胞標記物α-SMA表達增加（P<0.05），證明EMT模型建立成功。TGF-β1給藥組的FoxO3a蛋白含量與對照組相比呈現(xiàn)降低趨勢，比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），提示FoxO3a與HK-2細胞EMT過程有關，見表1與圖1。

2.2 敲低FoxO3a后對細胞EMT程度的影響 將FoxO3a-siRNA轉(zhuǎn)入HK-2細胞中，轉(zhuǎn)染72 h后Western blot檢測細胞內(nèi)的FoxO3a蛋白水平的表達情況。轉(zhuǎn)染FoxO3a-siRNA后細胞內(nèi)的FoxO3a蛋白含量顯著降低（P<0.01），HK-2細胞中的E-Cadherin蛋白含量降低（P<0.01），α-SMA表達量增加（P<0.05），證明敲低轉(zhuǎn)錄因子FoxO3a后，可促進HK-2細胞的EMT，進一步證實FoxO3a與HK-2細胞EMT過程有關，見圖2。

2.3 FoxO3a調(diào)控HK-2細胞EMT的可能機制 Western blot結(jié)果顯示：EMT細胞中AKT通路關鍵分子β-Catenin表達量增高（P<0.05）；而在敲低FoxO3a的 HK-2細胞中β-Catenin蛋白表達增高（P<0.01），在EMT細胞和低表達FoxO3a細胞中β-Catenin表達變化一致，說明當細胞中FoxO3a減少時，可能通過增加β-Catenin表達，促進HK-2細胞EMT。Control組TGF-β1誘導及敲低FOXO3a對HK-2細胞表達β-Catenin為（0.66±0.03），Treated組為（0.83±0.02），NC組為（0.24±0.07）siRNA組為（0.58±0.01），見圖3。

3 討論

纖維化是所有慢性腎臟疾病的主要特征，而腎小管上皮細胞發(fā)生EMT是腎臟發(fā)生纖維化的重要原因[9]。EMT過程對于腎臟損傷后的腎小管功能障礙和促進纖維化的發(fā)展都是重要且必需的。通過敲除Snail和Twist這兩個轉(zhuǎn)錄因子等手段抑制EMT過程，能夠保護腎小管細胞的完整性和功能，恢復腎小管的修復和再生能力，并減少肌成纖維細胞的堆積，減輕多種慢性腎臟疾病模型的間質(zhì)性纖維化[10]。FOXO轉(zhuǎn)錄因子包括FoxO1，F(xiàn)oxO3a，F(xiàn)oxO4和FoxO6。其中FoxO3a又名橫紋肌肉瘤樣1叉頭框（forkhead rhabdomyosar-coma-like 1，F(xiàn)KHRL1），在人類基因中位于6號染色體（6q21）。FoxO3a不僅在細胞的增殖、凋亡、氧化應激反應、衰老等過程中發(fā)揮著重要的作用，而且通過與其它轉(zhuǎn)錄因子的相互影響，整合不同信號，參與內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的調(diào)控[11]。最近有研究表明用藥物增加FoxO3a的活性，可以抑制肺纖維化小鼠的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化[5]。本研究發(fā)現(xiàn)，敲低FoxO3a后，HK-2細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關鍵指標E-Cadherin蛋白含量明顯減少，而α-SMA蛋白含量與NC組相比顯著增加。說明FoxO3a對人腎小管上皮細胞的EMT過程有調(diào)控作用。

β-連環(huán)蛋白（β-catenin）是細胞膜上鈣黏蛋白復合物的主要組成成分，參與Wnt/β-catenin、TGF-β通路、NF-κB通路等多條信號通路。研究報道：TGF-β1可以誘導小管上皮細胞在細胞核中積累β-Catenin，β-Catenin作用于Wnt通路下游基因可導致細胞發(fā)生EMT過程，當敲低β-Catenin，能夠抑制TGF-β1誘導EMT過程[12]。近來發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄因子FoxO3a可以調(diào)控β-Catenin的表達，參與癌細胞EMT的細胞通路，但具體機制仍未弄清[7]。本文發(fā)現(xiàn)HK-2細胞下調(diào)FoxO3a后，不僅EMT程度加深，且β-Catenin含量也增加。FoxO3a調(diào)節(jié)HK-2細胞EMT的機制可能與β-Catenin有關。綜上所述，在HK-2細胞中，F(xiàn)oxO3a可能通過調(diào)控β-Catenin蛋白含量，促進腎小管上皮細胞EMT。

但是FoxO3a抑制腎臟纖維化的研究還不充分。過表達FoxO3a，是否能減輕細胞的EMT程度還有待于研究，且FoxO3a通過怎樣的機制抑制細胞EMT過程還不清楚。希望通過研究轉(zhuǎn)錄因子FoxO3a，今后能夠找到于臨床治療慢性腎臟疾病的新手段。

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（收稿日期：2017-03-10） （本文編輯：周亞杰）