方振華 沈振國 孫 倩

(海南職業(yè)技術(shù)學(xué)院熱帶農(nóng)業(yè)技術(shù)學(xué)院,海南海口 570216)

一例豬傳染性胃腸炎的RT-PCR診斷

方振華 沈振國 孫 倩

(海南職業(yè)技術(shù)學(xué)院熱帶農(nóng)業(yè)技術(shù)學(xué)院,海南?？?570216)

2016年11月，海南省某豬場發(fā)生一起疑似豬傳染性胃腸炎病。根據(jù)豬傳染性胃腸炎病毒N基因序列設(shè)計(jì)、合成1對(duì)引物，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)對(duì)病死豬的腸道內(nèi)容物等組織進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出預(yù)期目的基因。結(jié)合臨床癥狀和病理剖檢變化初步診斷為豬傳染性胃腸炎病毒。

豬 豬傳染性胃腸炎 RT-PCR診斷

豬傳染性胃腸炎是由豬傳染性胃腸炎病毒引起的一種急性、高度接觸性的腸道傳染病。各年齡段的豬均能發(fā)病，以1周齡以下的仔豬死亡率最高，隨著年齡的增加死亡率會(huì)降低，但同時(shí)飼料報(bào)酬也會(huì)降低，嚴(yán)重影響豬的料肉比。該病在養(yǎng)豬中常有發(fā)生，給養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，極大地制約了畜牧業(yè)的健康發(fā)展。2016年11月底，海南省?？谑心池i場發(fā)生一起以豬嘔吐、水樣腹瀉為主要癥狀的疾病，經(jīng)RT-PCR檢測豬傳染性胃腸炎病毒陽性，結(jié)合臨床癥狀、病理剖檢變化初步診斷為豬傳染性胃腸炎。

1 發(fā)病情況

2016年11月下旬，海南省某豬場仔豬突然發(fā)病，仔豬出現(xiàn)嘔吐，嘔吐物中有未消化的乳塊，接著發(fā)生淡黃色水樣腹瀉，很快波及全舍。成年豬食欲不振，出現(xiàn)腹瀉，糞便呈灰褐色，腥臭。發(fā)病豬精神沉郁，口渴明顯，脫水癥狀嚴(yán)重，個(gè)別仔豬發(fā)病3d后死亡。根據(jù)其臨床表現(xiàn)，初步懷疑為豬傳染性胃腸炎。

2 剖檢變化

對(duì)病死的仔豬進(jìn)行剖檢，可見尸體明顯消瘦、脫水，胃內(nèi)充滿未消化的白色凝乳塊，胃壁黏膜充血；小腸壁變薄，呈半透明狀；腸道內(nèi)充滿氣體，腸壁樹枝狀充血，腸腔內(nèi)有呈灰色的泡沫狀液體和未徹底消化的凝乳塊，空腸黏膜剝落；腸系膜充血，淋巴結(jié)腫脹。

3 實(shí)驗(yàn)室檢查

采集病豬的腸道內(nèi)容物，采用RT-PCR方法檢測。

3.1 引物的設(shè)計(jì)與合成

試驗(yàn)所用引物位于N基因內(nèi)，預(yù)期擴(kuò)增片段為386 bp，上游引物：5’-AGAGGCAGGCAACAATCCAA-3’，下游引物：5’-GTGACTTCTATCTGGTCGCCAT-3’。

3.2 檢測樣品的制備

采集腸道內(nèi)容物研磨，用生理鹽水2倍稀釋，反復(fù)凍融3次，4℃ 5000 r/min 離心10 min，收集上清液體，加入雙抗備用。

3.3 病毒基因組總RNA 提取

按照總RNA 提取試劑盒（北京索萊寶）的說明步驟進(jìn)行。

3.4 豬傳染性胃腸炎病毒N基因的RT-PCR擴(kuò)增

cDNA合成：以提取的總RNA 為模板，以O(shè)ligo（d T）18為引物進(jìn)行 RT 反應(yīng)。反應(yīng)體系為：總RNA 2 μl，Oligo（d T）18（0.5 μg/μl）1 μl，2×TS Reaction Mix 10 μl，Trans Script RT/ RI Enzyme Mix 1 μl，RNase-free Water 5 μL。反應(yīng)條件為：42 ℃孵育 30 min，85 ℃ 5 min。

反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物存于-20℃，保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR反應(yīng)體系：模板cDNA 2 μL，Premix Taq 12.5 μl，上下游引物（20 μmol/L）各1 μl，用滅菌的ddH2O補(bǔ)至25 μl。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共34個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸10 min。反應(yīng)完畢，取PCR產(chǎn)物6 μl，加入上樣緩沖液，在有g(shù)oldviewII的1.0%瓊脂糖凝膠上電泳，紫外燈下觀察?？蓴U(kuò)增得到1條386 bp 的特異性條帶（圖1），表明待測樣品為陽性，同時(shí)結(jié)合臨床癥狀和病理變化，診斷該豬場病豬為豬傳染性胃腸炎病毒感染。

圖1 豬傳染性胃腸炎病毒N基因的PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果

4 討論

近年來，豬傳染性胃腸炎發(fā)病率持續(xù)上升，其流行情況日趨嚴(yán)重，臨床很難確診[4]。豬是唯一易感宿主，傳染源為病豬和帶毒豬，病豬的嘔吐物和排泄物中都可能傳播該病毒。并且極易造成其他腸道疾病的混合或繼發(fā)感染，使疫情變得更加復(fù)雜，提高病死率，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。由于豬傳染性胃腸炎與豬流行性腹瀉和豬輪狀病毒感染的癥狀極為相似，給臨床診斷和防治帶來了重重困難。而常規(guī)的病毒分離鑒定、免疫熒光等檢測手段費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且敏感性不強(qiáng)，無法滿足需要。RT-PCR反應(yīng)以其特異性強(qiáng)、靈敏度高和操作方便等優(yōu)點(diǎn)，成為豬傳染性胃腸炎診斷的主要方法[5]，為豬傳染性胃腸炎的早期診斷和流行病學(xué)調(diào)查奠定了理論基礎(chǔ)。N基因是豬傳染性胃腸炎病毒基因片段中相對(duì)保守的一個(gè)基因[6]，其結(jié)構(gòu)的高度保守性，在病毒的診斷方面具有很重要的意義。

[1] 樊長林，穆曉旭，劉澤.豬傳染性胃腸炎及其防控措施[J].中國畜牧獸醫(yī)文摘，2016，32（4）：124.

[2] 白云云，葛旭影，高睿澤，等.豬傳染性胃腸炎病毒的分離鑒定及其S 基因分子生物學(xué)特征的分析[J].中國獸醫(yī)科學(xué)，2016，46（3）：296-302.

[3] 張慧玲.豬傳染性胃腸炎預(yù)防和治療的研究進(jìn)展[J].中國畜牧獸醫(yī)文摘，2012，28（8）：108.

[4] 王文娟.豬傳染性胃腸炎的診斷[J].甘肅畜牧獸醫(yī)，2015，45（5）：70-71.

[5] 蘭喜.豬傳染性胃腸炎病毒的分子診斷與免疫研究[D].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2006.

海南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（20153086）.

方振華（1980-），男，碩士，講師，研究方向：動(dòng)物營養(yǎng)與動(dòng)物疾病。