朱嘉瑋+張洪艷+楊衛(wèi)平+馬倩

摘要：脫氧核糖核酸（DNA）是染色體的重要組成部分，是一種主要的遺傳物質，很多實驗方法與理論模型被用來研究DNA與一些重要生物物種相互作用引起的構象變化。采用激光掃描共聚焦表面等離子體共振（LSCISPR）系統(tǒng)研究了一種特定單鏈DNA（ssDNA）分別與其互補DNA（cDNA）和汞離子（Hg2+）作用后的構象變化。將一端有熒光分子的 ssDNA修飾在表面等離子體共振系統(tǒng)傳感芯片上，通過觀察熒光圖像的變化來確定ssDNA與cDNA及Hg2+之間相互作用而導致的構象變化，并通過動力學曲線計算出二者的結合速率分別為3.33×10-5 s-1和1.42×10-4 s-1。對于ssDNAcDNA的相互作用，熒光圖像沒有變化。對于ssDNAHg2+的相互作用，在通入Hg2+后熒光發(fā)生猝滅。這些結果表明，激光掃描共聚焦表面等離子體共振系統(tǒng)在高靈敏實時監(jiān)測ssDNA與其他特殊生物分子作用產生的構象變化和計算動力學參數(shù)方面有著廣闊的應用前景。

關鍵詞： 激光掃描共聚焦表面等離子體共振（LSCISPR）； 構象變化； 實時監(jiān)測

中圖分類號： R 318.6 文獻標志碼： A doi： 10.3969/j.issn.1005-5630.2017.02.003

文章編號： 1005-5630（2017）02-00012-06

引 言

利用顯微技術實現(xiàn)高分辨率的無損檢測在材料研究、生物醫(yī)學研究和半導體制造方面有著重要的作用。早在1957年，共聚焦顯微鏡被發(fā)明出來時，Minsky首次闡明共聚焦顯微鏡的工作原理[1]。作為一種先進的顯微鏡，激光掃描共聚焦顯微鏡為我們分析微觀結構提供了很大的方便，在近幾年也得到了很大的發(fā)展。激光掃描共聚焦顯微鏡可以對樣品進行斷層掃描和成像，進行無損觀察和分析細胞的三維空間結構[2]。作為一種新型的高分辨率分析手段，激光掃描共聚焦顯微鏡被廣泛應用于各個研究領域，比如生物學、材料科學、納米技術等[3]。但是，激光掃描共聚焦顯微鏡一般用于定性分析，不易直接從熒光強度的變化來進行定量分析。

表面等離子體共振（SPR）傳感器近幾年被廣泛應用于生物及化學檢測。最早在1902年由Wood[4]發(fā)現(xiàn)SPR現(xiàn)象，并在1968年由Kretschmann等[5]利用衰減全反射棱鏡耦合的方法激發(fā)出SPR現(xiàn)象，為后來SPR傳感器發(fā)展奠定了基礎。該傳感檢測技術具有靈敏度高、無需標記、實時等特點。因為SPR傳感技術是根據(jù)高靈敏反射光的變化來檢測，所以可以無標記地檢測在水中或者空氣中的污染物。SPR系統(tǒng)可以實時地檢測并能夠直觀地看到生物分子間相互作用的過程[6-8]，但是SPR信號的變化不能直接反應生物分子間相互作用之后發(fā)生的結構變化[9-13]。

本文采用激光掃描共聚焦表面等離子體共振（LSCISPR）系統(tǒng)，分別對ssDNAcDNA作用和ssDNAHg2+作用進行實時監(jiān)測。該檢測系統(tǒng)利用SPR的高靈敏度和激光掃描共聚焦顯微成像的熒光可視化，把光學和生物學緊密結合，實現(xiàn)對生物分子間作用的檢測。SPR檢測靈敏度高，金膜表面發(fā)生的一切變化，包括生物分子的結合、分解以及結構變化都會引起SPR信號的改變，但是只有動力學曲線并不能直觀地說明生物分子結構發(fā)生了何種改變，因此利用表面等離子體共振（LSCI）系統(tǒng)，通過對生物分子染色，可以很直觀地觀察被染色的生物分子與某種物質發(fā)生作用后結構發(fā)生了何種改變，比如是形成了雙鏈螺旋結構還是饋折變化等。實驗現(xiàn)象表明，通入cDNA后，SPR信號增強，隨后通入緩沖液來證實該信號增強并不是折射率變化引起，而是生物分子間作用引起的變化，但熒光強度沒有變化，說明ssDNA的構象變化并沒有使熒光發(fā)生猝滅，而是遵循沃森克里克[14]當年提出來的DNA雙螺旋結構模式，即cDNA能與ssDNA形成兩條相互反平行盤繞成直徑為2 nm的雙螺旋結構。通入Hg2+后，SPR信號同樣增強，熒光強度明顯減弱，這是因為Hg2+的通入產生一種T-Hg2+T復雜結構使得ssDNA帶有熒光一端發(fā)生折疊導致熒光發(fā)生猝滅[15]。LSCI-SPR在高靈敏實時監(jiān)測ssDNA與其他特殊生物分子作用產生的構象變化和得到相應的動力學參數(shù)方面有著廣闊的應用前景。

1 實 驗

1.1 實驗儀器與實驗試劑

LSCI-SPR系統(tǒng)原理圖如圖1所示。波長型SPR傳感系統(tǒng)是自主搭建的一套系統(tǒng)設備，白光光源由發(fā)光二極管發(fā)出平行光，經過偏振片產生P偏振光，再經過BK7直角棱鏡，反射光由裝有光電倍增管的光纖光譜儀采集。入射角可以通過平臺上的兩個旋轉臺隨意調節(jié)來確定最佳的入射角度。生物傳感基片的制備是用BK7玻璃片作為基底，在表面鍍上4 nm的鉻和50 nm的金。鍍有金膜的一面與流通槽接觸，另一面用匹配液與棱鏡結合使其折射率和棱鏡的折射率相同。棱鏡、傳感基片和流通槽與LSCI的倒置顯微鏡頭相互固定。采用40倍物鏡來采集ssDNA的熒光圖像，熒光用波長為488 nm的多行氬激光器激發(fā)。焦平面設定在金膜面上，這樣可以觀察到ssDNA在與cDNA及Hg2+相互作用時的熒光圖像。樣品溶液通過注射泵注入流通池。

實驗中所需溶劑為ssDNA溶液，物質的量濃度為3 μmol/L，TE緩沖液（呈弱堿性，對DNA的堿基具有保護作用）以及不同物質的量濃度的cDNA溶液與不同物質的量濃度Hg2+溶液，將cDNA溶液用TE緩沖液依次稀釋成0.01 μmol/L、0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L。Hg2+溶液物質的量濃度為0.01 nmol/L、0.1 nmol/L、1 nmol/L、10 nmol/L。DNA在TE緩沖液中穩(wěn)定性較好，不易破壞其完整性或產生開環(huán)及斷裂。

1.2 實驗過程

將金膜用乙醇溶液、乙醇和去離子水（各50%）混合溶液、去離子水各超聲10 min，吹干后用Plasma儀器對金膜表面處理10 min，處理過后浸泡在0.3 μmol/L的ssDNA溶液中24 h，估算得到ssDNA的表面覆蓋率為293 ng/cm2。所用的ssDNA分子結構中5端接有巰基（-SH）能夠與使用的金膜相連接，3端接有紅色染色劑羅丹明染料分子。取出浸泡后的金膜用TE緩沖液緩慢沖洗，洗掉沒有接在金膜上的ssDNA。將修飾了ssDNA的金膜用匹配液與棱鏡結合后固定在SPR儀器中，同時調節(jié)光路，光路調節(jié)好后開始實驗，先通入TE緩沖液，基線平穩(wěn)后，通入不同物質的量濃度的cDNA溶液。所有溶液通入的速率為1 μL/min。實驗中DNA的相互作用過程都能被LSCI-SPR系統(tǒng)進行實時地監(jiān)測，所有實驗都在25 ℃下進行。

2 實驗結果與分析

用LSCI-SPR系統(tǒng)實時監(jiān)測ssDNA與cDNA及Hg2+相互作用時的SPR信號的變化以及熒光圖像的變化，在ssDNA中通入cDNA的熒光圖如圖2所示，通入Hg2+的熒光圖如圖3所示，所有熒光圖均在標尺為10 μm范圍內拍攝。在基線平穩(wěn)后分別通入事先稀釋好的cDNA溶液和Hg2+溶液，cDNA的SPR曲線圖如圖4所示，Hg2+的SPR曲線圖如圖5所示。圖4和圖5縱坐標Ig表示IR與I0的比值，其中I0表示入射光強，IR表示反射光強。圖4（a）與圖5（a）的動力學曲線是通入溶液后反應的實時信號曲線，通入一段時間后，由于cDNA和Hg2+都能與ssDNA發(fā)生特異性作用，因此SPR信號上升，繼續(xù)通入溶液后，基線趨于平穩(wěn)，反應過程結束。圖4（b）和圖5（b）為三次平行實驗的標準誤差圖，誤差較小，說明在相同的實驗條件下，有著良好的實驗重復性。

通過實驗反應前后的SPR信號可以估算出在物質的量濃度為10 μmol/L時的ssDNAcDNA反應的結合速率為3.33×10-5 s-1，物質的量濃度為10 nmol/L時的ssDNAHg2+反應的結合速率為1.42×10-4 s-1。由于是在室溫25 ℃的條件下進行實驗，其結合速率會比在37 ℃條件下的結合速率慢。從熒光圖像可以看出，當通入不同物質的量濃度的cDNA溶液時，SPR信號增強明顯而熒光幾乎沒有發(fā)生變化，這是由于ssDNAcDNA遵循沃森克里克機制形成雙鏈DNA。但是在通入Hg2+后，SPR信號增強，熒光則有了明顯減弱，隨著Hg2+物質的量濃度的增加，熒光猝滅明顯。這說明Hg2+不但與ssDNA發(fā)生了特異性作用，并且產生一種特殊的THg2+T復雜結構，使得帶有熒光的ssDNA結構發(fā)生改變，接有羅丹明染色劑的一端發(fā)生折疊靠近金膜表面，表面等離子共振能在很短的距離使得熒光猝滅。通過LSCISPR系統(tǒng)實時地記錄整個反應過程。

3 結 論

本文采用LSCI-SPR系統(tǒng)監(jiān)測整個實驗過程。實驗證明，ssDNA與cDNA能夠發(fā)生特異性作用，雖然改變了ssDNA的構象形成雙鏈DNA，但不能使熒光發(fā)生猝滅，而Hg2+在與ssDNA發(fā)生特異性作用的同時也改變了ssDNA的構象使得熒光一端折疊，接近金膜表面讓熒光猝滅。通過動力學曲線，計算出ssDNAcDNA以及ssDNAHg2+的結合速率分別為3.33×10-5 s-1、1.42×10-4 s-1。LSCISPR系統(tǒng)有著檢測快速、實時、靈敏度高等優(yōu)點，在監(jiān)測生物分子間相互作用過程有著重要作用。不僅能夠通過SPR信號的變化反映生物分子間特異性作用，還能通過熒光的變化來反映生物分子構象的改變。LSCISPR系統(tǒng)在高靈敏實時地監(jiān)測ssDNA與其他特殊生物分子作用產生的構象變化，有著廣闊的應用前景。

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（編輯：張磊）